双通道无标记电化学免疫传感器及其在玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测中的应用

本发明涉及一种双通道无标记电化学免疫传感器及其在玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测中的应用，属于电化学传感。

背景技术：

1、霉菌毒素是由某些特定真菌产生的有毒次级代谢产物，其污染贯穿从农作物生产到食品消费的完整供应链。有效控制农产品中的霉菌毒素的含量对于保障食品质量安全至关重要。然而，在实际生产过程中，由于受田间生长和采后储藏阶段的真菌感染影响，农产品常存在多种霉菌毒素复合污染现象。例如，在谷物和谷物类食品中，镰刀菌毒素的共现率很高。其中，玉米赤霉烯酮(zen)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)经常在谷物中同时被检测到，由于其对农作物安全和食品质量的显著影响，引发了公共卫生关注。因此，单一霉菌毒素的检测方法难以有效防控食品供应链中由霉菌毒素复合污染引发的健康风险。

2、电化学方法因其高灵敏度、优异选择性、操作经济性、用户友好特性和实时监测能力，越来越广泛的应用于多种霉菌毒素的快速现场分析。现有霉菌毒素电化学分析技术主要可分为两类：无生物分子传感器和基于生物分子传感器。其中，无生物分子传感器采用纳米材料作为选择性传感元件。这些传感器依赖于目标分析物在电极表面发生氧化还原反应的能力。然而，由于并非所有分析物均能满足此电化学活性要求，从而限制了这类传感器的通用性。为了解决这一局限性，基于亲和识别原理的传感器正被开发为多种霉菌毒素电化学分析的替代方法。

3、作为基于亲和识别原理的传感器，电化学免疫分析方法因其高特异性和亲和力而被广泛认为是检测金标准方法。目前，用于多重检测的免疫分析技术大多依赖于标记物来实现信号区分，但这类方法通常受到探针合成复杂和偶联效率低等的影响。相对而言，能实现多目标分析的无标记生物传感器因其能简化检测流程并满足实际应用需求而受到广泛关注。虽然在针对霉菌毒素的多重电化学传感器研发方面已取得进展，但只有少数能实现便携式和现场检测的应用。大多数传感器仍然依赖于传统的电化学工作站和刚性电极配置，严重阻碍了它们在现场检测环境中的应用。因此，仍然迫切需要开发具有高灵敏度、高选择性、同时检测多种霉菌毒素并满足实际应用需求的电化学传感器。

4、为了开发一种无标记的电化学免疫传感器，选择合适的信号探针对于实现最佳的分析性能至关重要。该检测原理基于氧化还原探针的电化学响应变化，从而直接监测电极表面上的免疫相互作用。固态氧化还原探针(二茂铁、普鲁士蓝等)由于其容易从电极表面浸出的倾向，通常表现出较差的稳定性，因此往往需要采用复杂的电极修饰工艺予以改善。相比之下，液相氧化还原探针在信号稳定性及与电极表面相互作用强度方面展现出明显优势。然而，当应用无标记电化学免疫传感器检测霉菌毒素，作为小分子化合物的霉菌毒素在与电极表面结合时引起的传感器电响应信号变化极小。这种低分子量特性导致检测面临较大的挑战。为了克服这些局限性，电极表面的有效修饰至关重要，可以有效增强电荷转移效率和改善催化性能，同时实现生物分子高效固定化。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种双通道电化学免疫传感器，并用于玉米赤霉烯酮(zen)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)的多重高灵敏检测；本发明免疫传感器具有优异的分析性能，包括宽线性范围、低检测限、高选择性、重现性和稳定性，并且能够用于现场检测应用。

2、本发明提供的便携式集成双通道无标记电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：

3、s1、采用丝网印刷方法在聚对苯二甲酸乙二醇酯基底表面制备三电极体系，印刷完成后，干燥，并使用聚酰亚胺胶带作为介电层覆盖电极，得到双联丝网印刷电极(spes)；

4、所述三电极体系包括两个独立的工作电极(we1、we2)、一个参比电极(re)和一个对电极(ce)；

5、s2、铁卟啉化合物/金属基有机框架纳米酶与碳纳米管(cnts)复合得到纳米复合材料，将所述纳米复合材料分散于含壳聚糖的乙酸溶液中，然后滴加至所述工作电极表面，得到纳米复合材料修饰的丝网印刷电极；

6、s3、将交联剂溶液分别滴加至所述工作电极的表面，静置干燥后，分别在所述工作电极上固定玉米赤霉烯酮抗体和脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体，孵育完成后滴加封闭剂以封闭非特异性结合位点，得到双通道无标记电化学免疫传感器。

7、本发明制备方法中，所述工作电极和所述对电极均采用导电碳浆印刷，所述参比电极采用银/氯化银浆料印刷；

8、所述工作电极的覆盖面积为5～10mm2。

9、本发明制备方法中，所述铁卟啉化合物/金属基有机框架纳米酶为uio-66-氯化血红素(uio-66-hemin)，采用一锅水热法制备，具体包括如下步骤：

10、将四氯化锆溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入2-氨基对苯二甲酸、hemin和乙酸进行水热处理；

11、所述乙酸溶液中，乙酸的质量浓度为0.5-1％，壳聚糖的质量浓度为0.5-1％。

12、本发明制备方法中，所述n,n-二甲基甲酰胺的用量为30-60ml，所述四氯化锆的用量为0.1-0.2g，所述2-氨基对苯二甲酸的用量为0.1-0.2g，所述hemin的用量为50-150mg，所述乙酸的用量为3-10ml；

13、分散后形成的分散液中，所述铁卟啉化合物/金属基有机框架纳米酶的浓度为0.5-1.0mg ml-1，所述碳纳米管的浓度为0.5-1.0mg ml-1。

14、本发明制备方法中，所述交联剂为0.1-0.5％的戊二醛溶液，用量为1-5μl，孵育时间为10-30分钟；

15、所述玉米赤霉烯酮抗体和所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的浓度均为15-25μg ml-1，孵育时间为20-60分钟；

16、所述封闭剂为0.05-0.1％的牛血清白蛋白溶液，用量为1-5μl，孵育时间为10-30分钟。

17、本发明制备方法还包括下述预处理的步骤：

18、置于0.5-1.5m na2co3溶液中，施加1.20-1.60v恒定电压电化学清洗30-90秒；

19、每一步孵育后使用0.05-0.15m磷酸盐缓冲液(ph 6-8)冲洗电极，制备完成后传感器在4℃下保存，直至使用。

20、本发明提供的双通道无标记电化学免疫传感器能够用于分步或同时检测食品和饲料中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。

21、应用时，包括建立标注曲线的如下步骤：

22、将15-25μl不同浓度的标准样品溶液滴加至所述双通道无标记电化学免疫传感器的工作电极表面，在25-37℃孵育20-60分钟，冲洗后采用电化学工作站进行方波伏安法、微分脉冲伏安法或循环伏安法扫描；

23、记录峰电流变化值δi与目标物浓度对数lgc的线性关系，得到所述标准曲线；

24、基于所述校准曲线确定待分析样品中玉米赤霉烯酮(0.00001-100μg ml-1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(0.00001-10μg ml-1)的含量。

25、应用时，还包括对待测样品进行的如下前处理：

26、称取5-15g玉米、小麦或米粉，加入20-30ml、体积比5:1-10:1的乙腈-水混合溶液；然后振荡5-15min，并在4000-8000rpm下离心3-8min；收集上清液，将上清液通过0.2-0.5μm滤膜过滤，最后采用0.05-0.15m、ph 6-8的磷酸盐缓冲液稀释。

27、本发明具有如下有益技术效果：

28、(1)本发明提供的多目标快速检测传感平台及策略具有出色的通用性。通过采用不同的生物识别元件，能够实现对多种目标物质的选择性、高灵敏度快速检测。特别是玉米赤霉烯酮(zen)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)，显著减少了分析所需的时间。

29、(2)本发明免疫传感器表现出优异的分析性能，具有宽线性范围、低检测限、高选择性、重现性和稳定性。

30、(3)由于其紧凑的设计和生物固定所需的最小工作电极表面积(约5-10mm2)，且电极数量也可调节(本发明以两个工作电极仅为示例)。同时，丝网印刷免疫传感器非常适合一次性使用，进一步提高了其实际应用的潜力。