一种检测外泌体的磁性微球的制备方法、磁性微球及应用

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种检测外泌体的磁性微球的制备方法、磁性微球及应用。

背景技术：

1、外泌体作为细胞分泌的纳米级囊泡，携带有蛋白质、核酸及脂质等多种生物活性分子，其在肿瘤微环境调控及细胞间通讯中的关键作用已被广泛证实。研究表明，肿瘤细胞分泌的外泌体数量显著高于正常细胞，且其内容物直接参与癌症的侵袭、转移及耐药等恶性进程。由于外泌体可稳定存在于血液、尿液、唾液等体液中，能够实时反映源细胞的病理生理状态，因此被视为极具潜力的液体活检标志物，可用于癌症的早期筛查、辅助诊断及预后评估。然而，外泌体的高效捕获与灵敏检测仍是制约其临床转化的核心瓶颈。

2、目前，外泌体的分离纯化主要依赖超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法及免疫亲和捕获法等技术。超速离心法虽为经典方法，但设备昂贵、操作繁琐且回收率不稳定；密度梯度离心法虽能提高纯度，却因耗时极长、步骤繁杂而难以标准化；尺寸排阻色谱法对外泌体结构损伤小，但易受共洗脱蛋白污染，影响下游分析准确性；聚合物沉淀法操作简便，但非特异性共沉淀严重，产物纯度不足，仅适用于初步筛查。免疫亲和法基于抗原-抗体特异性识别，选择性较高，但传统免疫亲和基质成本高昂、稳定性差，且难以兼顾高通量与快速分离的需求，限制了其在临床大规模样本检测中的推广。此外，上述方法普遍存在操作时间长、样本消耗量大、自动化程度低等缺陷，难以满足临床检测对简便、快速、可重复性的迫切要求。

3、在检测灵敏度方面，荧光标记法虽被广泛采用，但常规荧光检测易受背景干扰，且信号强度往往不足以实现单颗粒水平的精确计数，导致低丰度外泌体的检测可靠性不足。同时，现有分离与检测流程通常分为独立步骤，缺乏有效的集成与信号增强手段，致使整体检测效率低下。因此，开发一种兼具高捕获效率、高检测灵敏度、操作便捷且成本可控的外泌体分离检测技术，对于推动癌症液体活检的临床应用具有重要意义。然而，如何在保持免疫识别高特异性的同时，实现磁性微球表面抗体的高效偶联、维持微球结构的均一性与分散性，并同步增强荧光检测信号，是当前技术面临的多重挑战，其解决涉及材料制备、表面化学修饰及光学工程等多学科的协同创新，难度显著。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测外泌体的磁性微球的制备方法、磁性微球及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明制备的磁性微球具有光子晶体结构，比表面积大，抗体偶联效率高；磁控特性实现外泌体快速高效捕获；微纳结构增强荧光信号，检测灵敏度达339 particles/ml，可在癌症筛查诊断中应用。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测外泌体的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

4、s1：将粒径为155-214 nm的单分散二氧化硅纳米粒子分散液与粒径为5~10 nm的四氧化三铁纳米粒子分散液混合，经振荡和超声后，得到均匀的混悬液，作为分散相流体；

5、s2：将步骤s1所得分散相流体与连续相流体注入微流控装置中，形成单分散乳液液滴，经干燥、洗涤、煅烧，得到具有光子晶体结构的磁性微球；所述连续相流体为二甲基氟化硅油；

6、s3：将步骤s2所得磁性微球进行表面功能化修饰，依次经羟基化、氨基化、羧基化和活化处理，得到功能化修饰的磁性微球；

7、s4：将步骤s3所得功能化修饰的磁性微球与cd63抗体进行偶联，封闭后得到偶联cd63抗体的磁性微球。

8、可选的，步骤s1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子的粒径为214 nm。

9、可选的，步骤s1中，所述二氧化硅纳米粒子分散液中二氧化硅纳米粒子的质量百分含量为20~30%；所述四氧化三铁纳米粒子分散液中四氧化三铁纳米粒子的质量百分含量为0.5~1%；所述二氧化硅纳米粒子分散液与四氧化三铁纳米粒子分散液的体积比为1:1。

10、可选的，步骤s2中，所述分散相流体的流速为1 ml/h，所述连续相流体的流速为12ml/h；所述煅烧温度为800℃，煅烧时间为5小时。

11、可选的，步骤s3中，所述羟基化处理为将磁性微球置于食人鱼溶液中80℃热浴30分钟；所述氨基化处理为将羟基化后的磁性微球置于含体积百分浓度5% aptes的乙醇溶液中震荡12小时；所述羧基化处理为将氨基化后的磁性微球置于含质量体积百分浓度10%琥珀酸酐的dmf溶液中震荡8小时；所述活化处理为将羧基化后的磁性微球置于含有50 mmol/l edc和25 mmol/l nhs的mes缓冲液中37℃孵育30分钟。

12、可选的，步骤s4中，所述cd63抗体的浓度为0.5 mg/ml，偶联条件为4℃孵育过夜；所述封闭采用含体积百分浓度0.2%乙醇胺的50 mg/ml bsa溶液，37℃孵育1小时。

13、本发明还提供一种所述的制备方法获得的磁性微球。

14、本发明还提供一种所述的磁性微球在制备检测外泌体的产品中的应用。

15、本发明还提供一种所述的磁性微球在制备癌症早期筛查、辅助诊断、疗效评估或预后监测产品中的应用。

16、可选的，所述癌症包括肝癌。

17、本发明公开了以下技术效果：

18、发明采用微流控法制备具有光子晶体结构的磁性微球，通过表面功能化修饰偶联cd63抗体，实现了对外泌体的高效特异性捕获。相较于传统超速离心和聚合物沉淀法，本发明方法有效避免了外泌体结构损伤和非特异性共沉淀问题，显著提高了捕获纯度和效率。同时，磁性微球的磁控特性使得分离操作简便快捷，大幅缩短了检测时间，降低了设备依赖和操作成本，具有良好的临床适用性和推广性。

19、本发明制备的磁性微球的有序微纳结构具有荧光信号增强效应，结合荧光标记二抗检测体系，可实现单颗粒水平的灵敏检测，检测下限可达339 particles/ml。通过荧光强度定量分析，能够准确反映样本中外泌体浓度，并在临床血清样本检测中成功区分肝癌患者与健康个体（auc=0.952），与elisa法结果高度相关。表明本发明在癌症早期筛查、辅助诊断、疗效评估及预后监测中具有重要的临床应用价值。

1.一种检测外泌体的磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述单分散二氧化硅纳米粒子的粒径为214 nm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述二氧化硅纳米粒子分散液中二氧化硅纳米粒子的质量百分含量为20~30%；所述四氧化三铁纳米粒子分散液中四氧化三铁纳米粒子的质量百分含量为0.5~1%；所述二氧化硅纳米粒子分散液与四氧化三铁纳米粒子分散液的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述分散相流体的流速为1ml/h，所述连续相流体的流速为12 ml/h；所述煅烧温度为800℃，煅烧时间为5小时。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述羟基化处理为将磁性微球置于食人鱼溶液中80℃热浴30分钟；所述氨基化处理为将羟基化后的磁性微球置于含体积百分浓度5% aptes的乙醇溶液中震荡12小时；所述羧基化处理为将氨基化后的磁性微球置于含质量体积百分浓度10%琥珀酸酐的dmf溶液中震荡8小时；所述活化处理为将羧基化后的磁性微球置于含有50 mmol/l edc和25 mmol/l nhs的mes缓冲液中37℃孵育30分钟。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述cd63抗体的浓度为0.5mg/ml，偶联条件为4℃孵育过夜；所述封闭采用含体积百分浓度0.2%乙醇胺的50 mg/mlbsa溶液，37℃孵育1小时。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法获得的磁性微球。

8.一种权利要求7所述的磁性微球在制备检测外泌体的产品中的应用。

9.一种权利要求7所述的磁性微球在制备癌症早期筛查、辅助诊断、疗效评估或预后监测产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肝癌。