一种高覆盖度且能够提升代谢物鉴定可信度的个性化代谢组分析方法

本发明涉及代谢组学和临床营养学，具体地，涉及一种能够实现高覆盖度、高效率且提高代谢物鉴定可信度的个性化代谢组分析方法。

背景技术：

1、在临床营养学研究中，精准获取膳食信息是实现个性化饮食指导的基础。目前广泛使用的传统膳食评估方法，如称重饮食记录、24小时膳食回顾和食物频率问卷，以及近年来发展的数字化饮食日记、图像辅助技术等应用，虽在一定程度上提升了评估的便捷性，但本质上仍依赖受试者的自我报告，容易引入回忆偏差。膳食生物标志物在对调查对象主诉的膳食摄入量进行校准方面呈现出良好的应用前景，但目前可用的膳食生物标志物局限于营养素，难以满足不断增长的膳食评估需求。

2、近年来，利用代谢组学技术探究新的食物摄入生物标志物已成为研究的热点。非靶向代谢组学能够提供广泛的分子覆盖范围，适用于新化合物的发现，但其定量数据的重复性相对较低；而靶向代谢组学则依赖标准品建立校准曲线，对已知代谢物进行准确定量，具有高重现性和定量精度，特别适用于临床研究中膳食模式与营养摄入的精准监测。然而，靶向分析的代谢物覆盖率有限，难以全面反映膳食暴露的复杂信息。

3、因此，本领域亟需一种兼具广泛分子覆盖与高重现性的代谢物定性定量的分析方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高覆盖度且能够提高代谢物鉴定可信度的个性化代谢组分析方法。

2、本发明的第一方面，提供了一种高覆盖度的代谢组分析方法，所述代谢组分析方法包括步骤：

3、(s1) 提供一种或多种代谢样本；

4、(s2) 对所述代谢样本进行预处理并进行代谢组分析，从而获得质谱结果，包括：利用双色谱法和电喷雾离子源正负离子模式的质谱对所述代谢样本进行分析，其中，所述双色谱法为亲水相互作用色谱和反相色谱；

5、(s3) 对所述质谱结果进行靶向与非靶向后处理，包括：

6、(s3.1) 所述靶向后处理包括：根据所述质谱结果提取峰面积；根据标准曲线与所述峰面积确定代谢物的绝对浓度，从而对代谢物进行靶向定性与定量分析；和

7、(s3.2) 所述非靶向后处理包括：根据所述质谱结果确定特征峰并进行对齐、过滤、峰面积和特征提取；将所述特征与数据库进行比对，对所述质谱结果进行注释，从而对代谢物进行非靶向定性与定量分析。

8、在另一优选例中，所述代谢样本包括体液样本和粪便样本。

9、在另一优选例中，所述体液样本包括血液样本和尿液样本。

10、在另一优选例中，所述代谢样本来自健康个体和/或疾病患者。

11、在另一优选例中，所述双色谱法采用vanquish超高效液相色谱系统。

12、在另一优选例中，对所述体液样本进行预处理并利用双色谱法进行分析包括步骤：

13、(a1) 将所述体液样本室温静置后离心，取上清液；

14、(a2) 取体积为v1的步骤(a1)获得的上清液于多孔板中；

15、(a3) 加入体积为v2的同位素内标溶液于所述多孔板中，其中，v2:v1满足4:1；

16、(a4) 对步骤(a3)获得的混合液体进行振荡并离心，取上清液；

17、(a5) 利用多孔去磷脂板对所述上清液进行处理，获得滤液，将滤液分为第一份滤液和第二份滤液；

18、(a6) 对滤液进行吹干与复溶，并进行柱分离，获得分离液；包括：

19、 (a6.1) 对第一份滤液进行吹干与复溶，利用亲水相互作用色谱柱进行分离；和

20、 (a6.2) 对第二份滤液进行吹干与复溶，利用反相色谱柱进行分离；

21、(a7) 对步骤(a6)获得的两份分离液进行振荡，获得待测样本。

22、在另一优选例中，在步骤(a1)中，所述静置的条件为：30±5 min。

23、在另一优选例中，在步骤(a1)中，所述离心的条件为：4℃下4500g离心15min。

24、在另一优选例中，在步骤(a2)中，v1 = 100±5 μl。

25、在另一优选例中，在步骤(a3)中，v2 = 400±5 μl。

26、在另一优选例中，在步骤(a3)中，所述同位素内标溶液为含同位素内标的甲醇:乙腈（v/v=1:1）溶液。

27、在另一优选例中，在步骤(a4)中，所述振荡的条件为：800 rpm振荡5 min。

28、在另一优选例中，在步骤(a4)中，所述离心的条件为：4℃下2000g离心30 min。

29、在另一优选例中，在步骤(a6)中，所述吹干为氮气吹干。

30、在另一优选例中，在(a6.1)中，利用50%的乙腈进行复溶。

31、在另一优选例中，所述亲水相互作用色谱柱为amide色谱柱。

32、在另一优选例中，所述amide色谱柱的分离条件如表a所示：

33、表a

34、。

35、在另一优选例中，在(a6.2)中，利用甲醇:乙腈:水（v/v/v=1:1:8）进行复溶。

36、在另一优选例中，所述反相色谱柱为t3色谱柱。

37、在另一优选例中，所述t3色谱柱的分离条件如表b所示：

38、表b

39、。

40、在另一优选例中，在步骤(a7)中，所述振荡的条件为：800 rpm振荡5 min。

41、在另一优选例中，对所述粪便样本进行预处理并利用双色谱法进行分析包括步骤：

42、(b1) 取冻干的所述粪便样本于研磨管中加水研磨；

43、(b2) 加入一定量的同位素内标溶液于所述研磨管中；

44、(b3) 对步骤(b2)获得的混合物进行振荡并离心，取上清液；

45、(b4) 利用多孔去磷脂板对所述上清液进行处理，获得滤液，将滤液分为第一份滤液和第二份滤液；

46、(b5) 对滤液进行吹干与复溶，并进行柱分离，获得分离液；包括：

47、 (b5.1) 对第一份滤液进行吹干与复溶，利用亲水相互作用色谱柱进行分离；和

48、 (b5.2) 对第二份滤液进行吹干与复溶，利用反相色谱柱进行分离；

49、(b6) 对步骤(b5)获得的两份分离液进行振荡，获得待测样本。

50、在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述同位素内标溶液为含同位素内标的甲醇:乙腈（v/v=1:1）溶液。

51、在另一优选例中，在步骤(b3)中，所述振荡的条件为：800 rpm振荡5 min。

52、在另一优选例中，在步骤(b3)中，所述离心的条件为：4℃下2000g离心30 min。

53、在另一优选例中，在步骤(b5)中，所述吹干为氮气吹干。

54、在另一优选例中，在步骤(b5)中，利用50%的乙腈进行复溶。

55、在另一优选例中，所述标准曲线包括来自12类559种代谢物的标准曲线。

56、在另一优选例中，所述标准曲线来自的代谢物见表1。

57、在另一优选例中，所述标准曲线的构建方法包括步骤：

58、(c1) 精确称量目标代谢物的标准品；

59、(c2) 用超纯水配置成一定浓度的储备液；

60、(c3) 对所述储备液进行梯度稀释，获得一系列标曲点；

61、(c4) 每个所述标曲点按预定的样品/内标提取液体积比对所述标曲点进行混匀；

62、(c5) 将步骤(c4)获得的混合液进行吹干与复溶，获得线性范围在10ng/ml-10000ng/ml的标准曲线。

63、在另一优选例中，在步骤(c2)中，所述储备液浓度为5mg/ml。

64、在另一优选例中，在步骤(c4)中，所述样品/内标提取液体积比为1:4。

65、在另一优选例中，在步骤(c5)中，用50%的乙腈进行复溶。

66、在另一优选例中，在(s3.2)中，具体包括步骤：

67、(s3.2a) 根据所述质谱结果确定特征峰并进行峰对齐与保留时间校正，并提取峰面积；

68、(s3.2b) 对步骤(s3.2a)的结果进行批次校正；

69、(s3.2c) 根据步骤(s3.2b)的结果对所述特征峰进行过滤；(s3.2d) 从所述特征峰中提取峰面积和特征；结合碰撞能信息，将所述特征与数据库进行比对，对同位素峰、加合离子和碎片相关性进行注释，从而对代谢物进行非靶向定性分析。

70、在另一优选例中，在步骤(s3.2b)中，进行批次校正的软件包括normae模型。

71、在另一优选例中，所述数据库是基于真实标准品建立的。

72、在另一优选例中，所述过滤的条件包括：

73、(d1) 去除在所有代谢样本中缺失值超过50%的特征峰；和

74、(d2) 去除在质量控制样本中相对标准偏差（rsd）> 40%的特征峰。

75、在另一优选例中，所述特征包括保留时间、质荷比和ms/ms碎片谱图。

76、在另一优选例中，根据保留时间差异< 0.2 min，质荷比质量误差<10 ppm，ms/ms碎片谱图的余弦相似度>0.9的条件进行比对，从而对同位素峰、加合离子和碎片相关性进行注释。

77、本发明的第二方面，提供了一种利用本发明第一方面所述方法获得的代谢物的用途，用于(i)构建疾病风险回归模型；(ii)作为疾病风险预测/诊断的标志物； (iii)作为疾病分型的标志物；(iv)构建连续型表型预测回归模型；和/或(v)作为连续型表型预测的标志物。

78、在另一优选例中，所述代谢物的鉴定可信度达到2级，较佳地为1级。

79、在另一优选例中，所述代谢物包括三甲胺-n-氧化物（tmao）、3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸（cmpf）、6-姜酚（6-gingerol）、飞燕草素（delphinidin）和辣椒红色素。

80、在另一优选例中，所述疾病包括：冠心病（chd）、卒中（stroke）、心血管疾病（cvd）、糖尿病（dm）、高血压（hbp）、高血脂（hlp）、阿尔茨海默病（ad）和抑郁相关状态（dp）。

81、在另一优选例中，所述连续型表型包括：血糖（glu）、甘油三酯（tg）、总胆固醇（cho）、低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）、高密度脂蛋白胆固醇（hdl-c）、收缩压（sbp）、舒张压（dbp）、脉压（pp）及认知评分（moca）。

82、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。