一种生物样品中抗生素的检测方法与流程

本技术属于分析化学领域，具体涉及一种检测生物样品中抗生素(例如g418)的方法。

背景技术：

1、根据药物生产规范(如ema指南)及相关行业标准，生物制品或药物中的抗生素残留需严格控制至ppm(百万分之一)级别以下，以确保药品安全性和合规性。

2、g418也称遗传霉素，是一种氨基糖苷类抗生素(结构如下所示)，它通过与原核和真核细胞的70s和80s核糖体结合，阻断肽链延伸，从而抑制蛋白质合成。当细胞成功转染并整合含有新霉素抗性基因后，能够赋予细胞在含有g418的选择性培养基中生长的抗性。因此，在制备例如西妥昔等单抗时，通常会将编码抗体的基因与抗性基因一起插入到载体中，通过g418筛选出成功转染并整合了目标基因的细胞，从而获得稳定表达抗体的细胞系。

3、

4、对于引入了g418而制备的例如西妥昔单抗等生物制品，根据ich指南对类似残留溶剂的要求，人体静脉注射液中g418的允许日暴露量(pde)值大约在40～50ng/ml，具体为约46.7ng/ml。

5、但是，g418残留检测较难，因为分子特性复杂，易与生物样本中的杂质结合，干扰检测灵敏度，而且在细胞培养液、细胞裂解液或纯化后的抗体样品中，基质比较复杂，可能掩盖目标信号。文献报道的对g418的检测方法多为高效液相色谱法。但液相方法的检测限较高，例如张旭凡等人(“重组蛋白中g418残留量超高效液相色谱-蒸发光散射检测方法的建立”，中国物制品学杂志2020年1月，第33卷第1期)报道的超高效液相色谱-蒸发光散射(uplc-elsd)方法对g418的检测定量限为0.01mg/ml，远高于人体静脉注射液中g418的安全pde值，达不到安全检测限要求。

6、因此，需要一种能够有效检测痕量抗生素(例如g418)的方法，以期达到监管及产品安全控制的要求。

技术实现思路

1、本技术提供一种能够有效检测痕量抗生素(例如g418)的方法，该方法简单、便捷，具有较好的专属性、准确性、灵敏度、可靠性和稳定性，且检测限和定量限较低。

2、一方面，本技术提供一种检测样品中抗生素(例如g418)的方法，包括使用液相色谱-质谱(lc-ms)进行检测。

3、在一些实施方案中，所述样品是生物样品。

4、在一些实施方案中，所述样品是生物制品(例如西妥昔单抗制品)或其制备或纯化过程中产生的中间产品。

5、在一些实施方案中，所述方法使用标准加入法对样品进行检测。本发明人发现，针对生物制品(例如西妥昔单抗制品)或其制备或纯化过程中产生的中间产品，因为基质较为复杂，标准加入法可消除基质影响，保护检测结果的可靠性。

6、在一些实施方案中，由于样品基质较为复杂，含有无机盐和蛋白等，因此在检测前对样品进行超滤。本发明人发现，所述超滤操作可以去除大分子蛋白，从而有效降低蛋白类基质对离子源的污染和对g418离子化的影响。

7、在一些实施方案中，所述超滤操作的截留分子量为3～100kd，例如5～20kd，例如约10kd。

8、在一些实施方案中，使用超滤离心管进行超滤操作。

9、在一些实施方案中，所述液相色谱中的色谱柱为亲水色谱柱。

10、在一些实施方案中，所述色谱柱选自硅胶柱、二醇基柱、氨基柱、氰基柱和酰胺基柱。在一些实施方案中，所述色谱柱为酰胺基柱。

11、在一些实施方案中，所述液相色谱中的色谱柱内径为1～8mm，例如为1～5mm，例如约2.1mm。

12、在一些实施方案中，所述液相色谱中的色谱柱长度为50～300mm，例如约150mm。

13、在一些实施方案中，所述液相色谱中的色谱柱的填料粒径为0.5～8μm，例如约1.7μm。

14、在一些实施方案中，所述液相色谱中的色谱柱为waters acquity uplc glycanbeh amide色谱柱，优选具有以下规格：waters acquity uplc glycan beh amide column2.1mm×150mm，1.7μm。

15、在一些实施方案中，所述液相色谱流动相为流动相a和流动相b的混合物。

16、在一些实施方案中，所述流动相a为含有缓冲盐的水溶液。在一些实施方案中，所述缓冲盐选自甲酸盐，例如甲酸铵；乙酸盐，例如乙酸铵；磷酸盐，例如磷酸钠盐或磷酸钾盐等。

17、在一些实施方案中，所述流动相a还含有酸类。在一些实施方案中，所述酸类为三氟乙酸、甲酸、乙酸或磷酸。

18、在一些实施方案中，所述流动相a是含有甲酸铵和甲酸的水溶液。

19、在一些实施方案中，流动相a含有的甲酸铵浓度为0.001～0.3mol/l，例如为约0.01～0.1mol/l，例如为约0.03mol/l。本发明人发现，流动相中的缓冲液浓度较高时，检测峰形较好。

20、在一些实施方案中，流动相a含有的甲酸浓度为0.01～0.5％(v/v)，优选为0.1～0.3％(v/v)，例如为约0.2％(v/v)。

21、在一些实施方案中，流动相a为约0.03mol/l甲酸铵溶液，其含有约0.2％(v/v)的甲酸。

22、在一些实施方案中，流动相b为有机溶剂或有机溶剂与水的混合体系。在一些实施方案中，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，优选为乙腈。在一些实施方案中，流动相b为乙腈-水体系。在一些实施方案中，所述乙腈-水体系含有60～100％(v/v)的乙腈，例如70～90％(v/v)，再例如约80％(v/v)。

23、在一些实施方案中，所述流动相b含有缓冲盐。在一些实施方案中，所述缓冲盐选自甲酸盐，例如甲酸铵；乙酸盐，例如乙酸铵；磷酸盐，例如磷酸钠盐或磷酸钾盐等。

24、在一些实施方案中，所述流动相b还含有酸类。在一些实施方案中，所述酸类为三氟乙酸、甲酸、乙酸或磷酸。

25、在一些实施方案中，所述流动相b是含有缓冲盐和酸类的乙腈-水体系。在一些实施方案中，所述流动相b是含有甲酸铵和甲酸的乙腈-水体系。

26、在一些实施方案中，流动相b含有的甲酸铵浓度为0.001～0.3mol/l，例如为0.01～0.1mol/l，例如为约0.03mol/l。

27、在一些实施方案中，流动相b含有的甲酸浓度为0.01～0.5％(v/v)，优选为0.1～0.3％(v/v)，例如为约0.2％(v/v)。

28、在一些实施方案中，流动相b为约0.03mol/l甲酸铵的80％乙腈溶液，其含有约0.2％(v/v)甲酸。

29、在一些实施方案中，流速为0.2～1.5ml/min，例如为约0.6ml/min。

30、在一些实施方案中，柱温为20～60℃，优选为40～55℃，例如为约50℃。

31、在一些实施方案中，所述液相色谱方法采用梯度洗脱。

32、在一些实施方案中，所述梯度洗脱程序如下所示：初始梯度为流动相b占流动相的体积百分数80％～100％，第二梯度为流动相b占流动相的体积百分数由80％～100％变化至60-80％，第三梯度为流动相b占流动相的体积百分数为60-80％，第四梯度为流动相b占流动相的体积百分数由60-80％变化至80％～100％，最终梯度为流动相b占流动相的体积百分数为80％～100％；所述初始梯度的洗脱时间为1～3min，所述第二梯度的洗脱时间为0.5～2min，所述第三梯度的洗脱时间为2～6min，第四梯度的洗脱时间为0～1min，所述最终梯度的洗脱时间为2～5min。

33、在一些实施方案中，所述梯度洗脱程序如下所示：

34、

时间(min)

流动相a％

流动相b％

0

10

90

2

10

90

3

30

70

7

30

70

7.1

10

90

10

10

90

35、在一些实施方案中，所述质谱采用电喷雾离子源(esi)。

36、在一些实施方案中，所述质谱采用正离子多反应监测模式mrm进行质量扫描。

37、在一些实施方案中，所述质谱中去簇电压为100～160v，例如120～140v，例如约130v。

38、在一些实施方案中，所述质谱中干燥气流速为5～15l/min，例如8～12l/min，例如约9～11l/min，例如约10l/min。

39、在一些实施方案中，所述质谱中干燥气温度为200～500℃，例如300～400℃，例如约330～350℃，例如约350℃。

40、在一些实施方案中，所述质谱中雾化气压力为20～50psi，例如40～45psi，例如约35psi。

41、在一些实施方案中，所述质谱中鞘气温度为200～500℃，例如300～400℃，例如330～370℃，例如约350℃。

42、在一些实施方案中，所述质谱中鞘气流速为6～18l/min，例如10～15l/min，例如11～12l/min，例如约12l/min。

43、在一些实施方案中，所述质谱中毛细管电压为+1500v至+3500v，例如+2000v至+3000v，例如约+2500v。

44、在一些实施方案中，所述质谱中喷嘴电压为+300v至+700v，例如+400v至+600v，例如约+500v。

45、在一些实施方案中，所述质谱中检测器增益电压为150～250v，例如约200v。

46、在一些实施方案中，所述质谱中碰撞池加速电压为2～6v，例如约4v。

47、在一些实施方案中，所述质谱中驻留时间为50～150ms，例如80～120ms，例如约100ms。

48、在一些实施方案中，g418质谱检测的前级离子为497.3(m/z)。

49、在一些实施方案中，g418质谱检测的产物离子选自380.3、338.3、205.1、163.1(m/z)。

50、在一些实施方案中，g418的定性或定量离子对选自以下一者或多者：497.3→380.3；497.3→338.3；497.3→205.1；497.3→163.1。

51、在一些实施方案中，g418的定性离子对选自以下一者或多者：497.3→380.3；497.3→338.3；497.3→205.1；g418的定量离子对为497.3→163.1。

52、在一些实施方案中，所述质谱中的碰撞能量(ce)为5～40ev。

53、在一些实施方案中，所述质谱中针对离子对497.3→380.3的碰撞能量(ce)为10～20ev，例如约16ev。

54、在一些实施方案中，所述质谱中针对离子对497.3→338.3的碰撞能量(ce)为10～20ev，例如约16ev。

55、在一些实施方案中，所述质谱中针对离子对497.3→205.1的碰撞能量(ce)为20～30ev，例如约24ev。

56、在一些实施方案中，所述质谱中针对离子对497.3→163.1的碰撞能量(ce)为20～40ev，例如约28ev。

57、本技术的有益效果包括：本技术检测g418的方法简单、便捷，具有较好的专属性、准确性、灵敏度、可靠性和稳定性，且检测限和定量限较低，能够有效检测生物制品及其制备和/或纯化过程中生成的中间产品中的g418的含量，检测限甚至低至ng/ml。

58、本领域技术人员能够理解，本技术的方法也可以用于检测样品中除g418以外的其它抗生素，例如新霉素等。

59、本说明书中公开的所有技术特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的技术特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

60、如无特别指明，本技术的数值均由术语“约”修饰。术语“约”是指在所述数值的±20％范围内，优选±10％范围内，优选±5％范围内，更优选±2％范围内。