一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法

本发明涉及生物组织透明化领域，尤其涉及一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法及系统。

背景技术：

1、全球范围内，由内耳毛细胞不可逆损伤导致的耳聋患者已超过4.6亿。毛细胞作为听觉转导的核心单元，其空间排列分布及其与神经纤维的连接模式对于研究听力损伤机制及药物筛选具有极其重要的科学意义。

2、然而，耳蜗组织由于包裹在坚硬的颞骨内，且内部结构精密、脂质含量高，对其进行大尺度原位三维成像极具挑战。目前，针对耳蜗毛细胞的表征主要存在以下瓶颈：

3、第一，传统的耳蜗铺片术需机械剥离骨质并剪开蜗管，该过程不可避免地破坏了耳蜗的螺旋拓扑结构，导致毛细胞的空间排列信息丢失。

4、第二，传统的组织切片技术虽能观察局部微观结构，但难以重构完整毛细胞阵列的三维分布。

5、第三，目前的组织透明化技术在处理耳蜗时存在显著缺陷。例如，有机溶剂透明化技术虽透明度高，但易导致组织剧烈收缩且快速淬灭荧光信号；而常规亲水性透明化试剂由于渗透压及分子扩散限制，对于密集的骨化组织透明效率低下，处理周期长，且往往需要配置高浓度的折射率匹配液，导致成本高昂且操作复杂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，解决由于传统铺片术导致的组织拓扑结构破坏、机械损伤，以及现有透明化技术存在的处理周期长、荧光信号易淬灭、组织变形严重的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，包括以下步骤：

3、s1、获取耳蜗样本，并采用多聚甲醛溶液对耳蜗样本进行固定处理；

4、s2、采用乙二胺四乙酸二钠溶液，对固定处理后的耳蜗样本进行脱钙处理；

5、s3、采用去垢剂和氨基醇的混合溶液，对脱钙处理后的耳蜗样本进行脱脂处理；

6、s4、采用尿素溶液，对脱脂处理后的耳蜗样本进行水化透明处理，并采用磷酸盐缓冲盐溶液对水化透明处理后的耳蜗样本进行震荡洗涤；

7、s5、依次加入磷酸盐吐温缓冲液、封闭液、一抗和二抗，通过渗透处理、封闭处理、孵育和避光孵育，对震荡洗涤后的耳蜗样本进行免疫荧光标记染色；

8、s6、采用折射率匹配液对免疫荧光标记染色后的耳蜗样本进行折射率匹配，得到透明化的耳蜗组织。

9、优选地，所述多聚甲醛（paraformaldehyde，pfa）溶液中甲醛的等效浓度为4%；所述固定处理的温度为3℃-5℃，时间为12h-24h。

10、本申请通过pfa溶液使组织蛋白质发生交联，锁定耳蜗内毛细胞、神经纤维及支撑细胞的原始空间位置，确保了后续剧烈化学处理中组织结构不发生解体或变形。

11、优选地，所述乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，edta）溶液的浓度为0.3m-0.7m；所述脱钙处理是采用震荡处理的方式，震荡处理12h-24h。

12、耳蜗外周包裹坚硬的颞骨（高钙质），edta溶液通过螯合钙离子使骨质软化，从而消除骨盐引起的严重光散射，并为后续透明化试剂及抗体进入蜗管内部建立物理通道。

13、优选地，所述去垢剂和氨基醇的混合溶液为亲水型组织透明化试剂，所述去垢剂的体积百分比浓度为5%-20%，所述氨基醇的质量体积百分比浓度为10%-35%；所述脱脂处理包括两次连续的震荡浸泡处理，每次震荡浸泡处理的时间为12h-36h。

14、本申请通过去垢剂和氨基醇的混合溶液的两次循环处理，深度脱除细胞膜及髓鞘上的脂质。脂质是组织中最大的散射源，脱脂不仅能提高透明度，还能显著增加组织的孔隙率，利于后续大分子抗体的渗透。

15、优选地，所述去垢剂为聚乙二醇辛基苯基醚、聚山梨酯-20、十二烷基硫酸钠中的至少一种；所述氨基醇为n,n,n',n'-四(2-羟丙基)乙二胺、n-丁基二乙醇胺、三乙醇胺中的至少一种。

16、优选地，所述尿素溶液中尿素的浓度为4m-8m；所述水化透明处理的时间为12h-36h；所述震荡洗涤的次数为3次，每次震荡洗涤的时间为2h。

17、本申请通过尿素溶液诱导高水化作用，使组织内蛋白质分子的氢键部分断裂，结合大量水分，从而显著降低蛋白质本身的折射率（refractive index，ri），向水性环境（ri≈1.33）靠近，实现“由内而外”的透明化。并通过震荡洗涤除去高渗透性的处理液，将组织恢复至适宜免疫反应的生理ph环境。

18、优选地，所述磷酸盐吐温缓冲液中聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比浓度为0.3%-2%。

19、优选地，所述封闭液包括：牛血清白蛋白和聚乙二醇辛基苯基醚；所述封闭液中牛血清白蛋白的质量体积百分比浓度为1%-10%，聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比浓度为0.1%-1%。

20、优选地，所述一抗为能够特异性结合耳蜗样品组织中的目标抗原的抗体；所述二抗为能够特异性结合一抗且标记有荧光染料的抗体。利用抗体能够突破蜗管壁的屏障，均匀渗透至毛细胞层，实现对耳蜗样品组织中的目标抗原的高特异性原位标记。

21、优选地，所述折射率匹配液包括：高折射率糖类或多元醇；所述高折射率糖类为蔗糖、果糖、海藻糖中的至少一种；所述多元醇为甘油、山梨醇、木糖醇中的至少一种。通过折射率匹配液进行最终的折射率匹配，消除组织残余背景与介质之间的折射率差异，使耳蜗达到近乎全透明状态，从而实现数百微米甚至毫米级的深层扫描。

22、综上所述，本发明提供的一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，相比传统技术，有益效果如下：

23、（1）本申请无需机械剥离蜗管或人工拉平螺旋结构，避免了物理操作对脆弱毛细胞造成的机械损伤，解决了传统铺片术导致的组织拓扑结构破坏、机械损伤，以及现有透明化技术存在的处理周期长、荧光信号易淬灭、组织变形严重的问题。实验结果显示，处理后的耳蜗样本完整保留了从蜗底到蜗顶的螺旋拓扑结构，完美保留了耳蜗原始三维解剖结构，实现了毛细胞、螺旋神经节及基底膜的原位空间表征，大幅降低了漏诊率和误诊率。

24、（2）本发明利用尿素溶液诱导的水化作用，使组织内蛋白质折射率主动降低并与水性环境匹配，结合折射率匹配液的终末匹配，使耳蜗组织的光学通透性显著提升。

25、（3）传统固定耳蜗成像深度通常不足50μm，而本申请得到的透明化的耳蜗组织，通过共聚焦显微镜可实现完整蜗管（深度可达500μm-1000μm以上）的清晰成像，能够一站式获取毛细胞阵列的连续三维图像；并且对背景光的散射降低了80%以上，极大地提高了深层组织成像的对比度和分辨率。

26、（4）本申请将全耳蜗透明化周期从2周缩短至4-5天，易于在标准化实验室推广，且所用化学试剂成本较低，且无需购置昂贵的电泳透明化设备，大幅度降低了全器官透明化成像的科研门槛和经费支出。

27、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

1.一种基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述多聚甲醛溶液中甲醛的等效浓度为4%；所述固定处理的温度为3℃-5℃，时间为12h-24h。

3.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸溶液的浓度为0.3m-0.7m；所述脱钙处理是采用震荡处理的方式，震荡处理12h-24h。

4.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述去垢剂和氨基醇的混合溶液为亲水型组织透明化试剂，所述去垢剂的体积百分比浓度为5%-20%，所述氨基醇的质量体积百分比浓度为10%-35%；所述脱脂处理包括两次连续的震荡浸泡处理，每次震荡浸泡处理的时间为12h-36h。

5.根据权利要求4所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述去垢剂为聚乙二醇辛基苯基醚、聚山梨酯-20、十二烷基硫酸钠中的至少一种；所述氨基醇为n,n,n',n'-四(2-羟丙基)乙二胺、n-丁基二乙醇胺、三乙醇胺中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述尿素溶液中尿素的浓度为4m-8m；所述水化透明处理的时间为12h-36h；所述震荡洗涤的次数为3次，每次震荡洗涤的时间为2h。

7.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述磷酸盐吐温缓冲液中聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比浓度为0.3%-2%。

8.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述封闭液包括：牛血清白蛋白和聚乙二醇辛基苯基醚；所述封闭液中牛血清白蛋白的质量体积百分比浓度为1%-10%，聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比浓度为0.1%-1%。

9.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述一抗为能够特异性结合耳蜗样品组织中的目标抗原的抗体；所述二抗为能够特异性结合一抗且标记有荧光染料的抗体。

10.根据权利要求1所述的基于水化作用的耳蜗组织透明化方法，其特征在于，所述折射率匹配液包括：高折射率糖类或多元醇；所述高折射率糖类为蔗糖、果糖、海藻糖中的至少一种；所述多元醇为甘油、山梨醇、木糖醇中的至少一种。