一种基于ATP检测生物气溶胶总活菌的电化学检测方法

本发明属于分析检测，具体涉及一种基于atp检测生物气溶胶总活菌的电化学检测方法。

背景技术：

1、生物气溶胶含有多种活微生物，对人类健康（包括呼吸道感染和过敏反应）构成显著风险。鉴于这一威胁，许多国家已制定了空气中细菌浓度的法规限值，其中总细菌是最常监测的空气质量评估指标。国标gb 37488-2019规定休息区为1500 cfu/m3，其他公共场所为4000 cfu/m3。该标准也凸显了生物气溶胶总活菌监测对于保障公众健康的重要性。

2、传统生物气溶胶定量分析普遍采用菌落计数法，检测结果以菌落形成单位（cfu）呈现。该方法虽然准确度尚可，但培养周期长达48–72小时；且该方式仅能检出可培养微生物，容易低估真实微生物含量，尤其会遗漏存活但不可培养细菌，这类细菌仍存在代谢活性与致病潜力。而聚合酶链式反应（pcr）针对特定病原体设计，不适用于总微生物计数。激光诱导荧光、流式细胞术和质谱等先进技术灵敏度高，但依赖庞大昂贵的仪器，需要复杂的样品前处理或标记，且无法在不使用活性染料的情况下区分死活细胞。三磷酸腺苷（atp）是代谢活性细菌的通用标志物，使其成为总活菌生物气溶胶监测的理想目标。已有研究（ko, h.s.; hwang, j. fluorescence resonance energy transfer-based biosensor withfemtomolar sensitivity for culture-independent detection of airbornebacteria. environ. sci. technol.2026, 60 (5), 4279–4288. doi: 10.1021/acs.est.5c15957）证实了atp与菌落形成单位（cfu）计数之间的相关性，验证了其用于量化空气中总细菌的可行性。然而，到目前为止，基于atp通过电化学方法来检测生物气溶胶总活菌的相关研究还未见报道。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供一种基于atp检测生物气溶胶总活菌的电化学检测方法。本发明利用atp作为t4 dna连接酶的特异性辅因子，触发线性单链dna的环化，进而启动滚环扩增反应，产生大量长链dna和焦磷酸根阴离子。焦磷酸根阴离子与锰离子结合形成焦磷酸锰沉淀作为结构骨架，同时长链dna与焦磷酸锰结合形成具有电化学活性的dna-锰复合物颗粒（dmp），该dmp可负载至工作电极上，通过电化学信号强度实现对atp及总活菌的定量检测；本发明方法无需光学读出设备，灵敏度高、检测范围宽，且能够区分死活菌，适合生物气溶胶总活菌检测。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供一种基于atp检测总活菌的电化学检测方法，包括以下步骤：

4、（1）提取待测样品中的细菌atp：将待测样本溶液中的细菌破碎，将所得菌悬液离心，取上清液，即得含有细菌atp的待测液；

5、（2）atp触发的环化反应：将步骤（1）制备的待测液与5'端磷酸化的线性单链dna（ldna）及t4 dna连接酶缓冲液混合，加入t4 dna连接酶，于30~40℃下反应5~30 min，然后将酶灭活；atp作为t4 dna连接酶的辅因子，催化线性单链dna环化为环状dna模板（cdna）；

6、（3）滚环扩增及dna-锰复合物颗粒的组装：向步骤（2）的反应液中加入含锰离子的rca缓冲液、rca引物和dntps，得到rca反应液，在80~95℃加热2~10 min，然后冷却至室温，引物与环结合后，加入过量的super phi29 dna聚合酶，于40~45℃下进行滚环扩增反应0.5~2 h，然后将酶灭活，室温下组装5~15小时，滚环扩增产生大量长链dna，反应过程中产生的焦磷酸根阴离子与锰离子结合形成焦磷酸锰作为骨架，长链dna与焦磷酸锰结合形成电活性dna-锰复合物颗粒；

7、（4）信号检测：将步骤（3）得到的dna-锰复合物颗粒分散于电极负载液中，滴加至工作电极表面后干燥，连接电化学工作站，采用循环伏安法进行检测，记录峰电流强度，通过峰电流强度与菌浓度的定量关系实现总活菌的定量检测。

8、上述技术方案中，进一步地，步骤（1）中所述的待测样本溶液是通过采样器采集生物气溶胶中活菌后得到的采样溶液。

9、上述技术方案中，进一步地，步骤（1）中采样过程所用的采样液为pbs缓冲液。

10、上述技术方案中，进一步地，步骤（1）中所述的破碎方法包括超声破碎法。

11、上述技术方案中，进一步地，步骤（1）中所述超声破碎法的具体过程为：超声破碎20~40 s，置于冰中冰冻1~3 min，重复此操作3~10次。

12、上述技术方案中，进一步地，步骤（1）中离心的转速为6000~10000 rpm。

13、上述技术方案中，进一步地，步骤（2）中所述线性单链dna的核苷酸序列如seq idno.1所示。

14、上述技术方案中，进一步地，步骤（2）中所述线性单链dna为具有独特二级结构的适配体序列，能够在无需夹板链的条件下被t4 dna连接酶高效环化。

15、上述技术方案中，进一步地，步骤（2）中所述t4 dna连接酶缓冲液成分如下：350~450 mm tris-hcl，50~150 mm mgcl2，50~150 mm dtt，ph 7.5~8.0。

16、上述技术方案中，进一步地，步骤（2）中待测液、5'端磷酸化的线性单链dna（ldna，0.5~2 μm）、t4 dna连接酶缓冲液、t4 dna连接酶（0.01~0.1u/μl）的体积比为5~15：3~5：1~3：0.5~2。

17、上述技术方案中，进一步地，步骤（2）中所述灭活具体过程为在85~100 ℃下保温1~5 min。

18、上述技术方案中，进一步地，步骤（3）中所述的rca引物的核苷酸序列如seq idno.2所示。

19、上述技术方案中，进一步地，步骤（3）中所述rca反应液的成分如下：40~60 mmtris-hcl、5~15 mm (nh4)2so4、0.5~5 mm dtt、5~10 mm mnso4、0.5~5 mm dntps、100~300pmol rca引物。

20、上述技术方案中，进一步地，步骤（3）中所述dna-锰复合物颗粒的组装在室温下进行10 h。

21、上述技术方案中，进一步地，步骤（3）通过将所得溶液在6000~15000 rpm下离心5~20 min，弃上清，加入超纯水重悬颗粒，在6000~15000 rpm下离心5~20 min，重复上述过程洗涤3~5次，以去除未反应的rca试剂，得到dna-锰复合物颗粒。

22、上述技术方案中，进一步地，步骤（4）中所述工作电极为玻碳电极，电极负载液成分为：2~4 mg乙炔黑，0.4~0.6 ml超纯水、0.5~1.5 ml 2-丙醇和0.05~0.5 ml 5% nafion®溶液，电极负载液以增强电极的导电性和稳定性。

23、上述技术方案中，进一步地，步骤（4）中所述循环伏安法的检测条件为：电位范围为0 ~ 0.8 v（相对于ag/agcl），扫描速率为10~30 mv/s。

24、上述技术方案中，进一步地，步骤（4）中所述峰电流强度与菌浓度的定量关系是通过如下方法获得，配制一系列浓度（分别为101、102、103、104、105、106、107cfu/ml）的菌悬液，按照上述步骤（1）到步骤（4）进行检测，记录峰电流强度，根据峰电流强度和菌浓度拟合得到标准曲线。

25、与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

26、本发明以atp作为t4 dna 连接酶特异性辅因子启动环化及滚环扩增反应，实现atp信号高效放大，检测灵敏度高，atp检测限可达飞摩尔级别；借助滚环扩增产物与焦磷酸锰形成电化学活性复合物构建免标记电化学检测体系，简化检测步骤，整套方案所用的电学检测设备仪器便于集成，适合生物气溶胶总活菌检测。