一种无酶尿酸电化学传感器、尿酸电化学检测方法和可穿戴无线电化学传感系统

本发明属于电化学生物传感，具体涉及一种无酶尿酸电化学传感器、尿酸电化学检测方法和可穿戴无线电化学传感系统，可用于智慧农业中家畜、家禽及水产养殖动物尿酸代谢的监测等领域。

背景技术：

1、尿酸是嘌呤代谢的终产物,其在体液中的浓度异常与痛风、内脏型痛风(在家禽中尤为高发)等病理状态密切相关,对尿酸进行高灵敏、宽范围、抗干扰的电化学监测具有重要意义。

2、在尿酸的电化学传感中,酶法传感(例如基于尿酸氧化酶者)易受温度、ph等环境因素影响而灭活,稳定性差且成本较高;而现有的非酶电催化策略大多依赖贵金属或其复合纳米结构作为催化位点,存在成本高、资源受限的问题,或因电极界面固有活性不足而需施加较高的氧化过电位。因此,如何在不使用尿酸氧化酶、亦不依赖贵金属催化位点的前提下,以电极界面的固有活性在较低电位下实现对尿酸的高灵敏电化学氧化检测,是现有技术亟待解决的问题。

3、另一方面,尿酸在生理样本中的浓度跨度很大,由低浓度区间延伸至临床高浓度区间。现有尿酸传感平台普遍存在固有权衡:为获得亚微摩尔级的检测限,往往以压缩线性范围的上限为代价,难以兼顾低检测限与宽线性动态范围;并且,尿酸在常规磷酸盐缓冲液中的固有溶解度有限,不足以覆盖临床高浓度区间,进一步限制了检测范围的上限。因此,如何在保持亚微摩尔级检测限的同时,使线性检测范围覆盖临床高浓度区间,是该领域面临的难题。

4、此外,在真实样本中,尿酸常与抗坏血酸、多巴胺等电活性物质共存,三者的氧化电位相互接近、伏安响应严重重叠,尤其抗坏血酸的强氧化背景容易掩盖多巴胺与尿酸的独立信号。如何在不使用酶、亦不引入额外修饰的条件下,从严重重叠的伏安响应中特异性地分辨并识别尿酸,是实现真实样本抗干扰检测的关键难题。

5、再者,将台式电化学检测平台转化为能够贴合人体或动物体表、对汗液、尿液等非侵入性体液进行连续实时监测的可穿戴终端,要求传感界面与柔性微电子及微流控采样技术深度集成,并需解决体液的快速采集与腔内浓度均匀化、电化学信号的无线传输,以及活性界面的本征传感性能在经历柔性封装、微流控集成与无线传输等系统级工程转化后能否得到保持等问题。现有技术在将高性能传感界面集成为兼具柔性、微流控采样与无线传输能力的完整可穿戴系统方面,仍存在不足。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了解决上述背景技术存在的不足，提供一种无酶尿酸电化学传感器、尿酸电化学检测方法和可穿戴无线电化学传感系统，实现无酶且不依赖贵金属的低过电位尿酸检测，兼顾亚微摩尔检测限与宽线性范围，实现强干扰背景下对尿酸的特异性识别以及高性能传感界面向柔性可穿戴系统的工程转化。

2、本发明采用的技术方案是：一种无酶尿酸电化学传感器，包括由工作电极、对电极和参比电极构成的三电极体系；所述工作电极包括石墨烯薄膜导电层和位于所述石墨烯薄膜导电层上的连续单层氧化石墨烯活性层；所述连续单层氧化石墨烯活性层由单层氧化石墨烯纳米片以单层平铺、彼此边缘相接且基本不重叠的方式镶嵌成连续层，其厚度为1.4-1.6nm，在所述石墨烯薄膜导电层表面的覆盖率不低于94.9%，并经由π-π共轭相互作用与所述石墨烯薄膜导电层直接接触；所述无酶尿酸电化学传感器配置为在不使用尿酸氧化酶及贵金属催化位点的情况下，以差分脉冲伏安法对体液样本中的尿酸进行电化学检测。

3、上述技术方案中，所述石墨烯薄膜导电层为经激光微加工图案化以限定所述工作电极电化学活性区的高取向石墨烯薄膜。

4、上述技术方案中，在ph7.4的0.1mol/l磷酸盐缓冲液中、以填充饱和氯化钾溶液的银/氯化银参比电极为电位基准，所述无酶尿酸电化学传感器对尿酸的差分脉冲伏安阳极氧化峰位于0.36v，且在相同测试条件下，所述阳极氧化峰相对于未沉积所述连续单层氧化石墨烯活性层的裸石墨烯薄膜导电层对尿酸的阳极氧化峰负移不低于0.3v；在尿酸浓度大于0且不超过1000μmol/l的范围内，所述阳极氧化峰的峰电流随尿酸浓度递增呈单调增长。

5、本发明提供了一种尿酸电化学检测方法，采用上述技术方案所述的无酶尿酸电化学传感器，在不使用尿酸氧化酶的条件下对待测样本中的尿酸进行电化学定量，包括：

6、（1）建立覆盖0-5000μmol/l的两段式拼接校准关系：分别以一系列已知尿酸浓度的标准溶液采集所述工作电极的差分脉冲伏安阳极氧化峰电流，据此在不含碳酸锂的磷酸盐缓冲液中、于0-1000μmol/l尿酸浓度范围内建立用于不超过1000μmol/l尿酸定量的第一段线性校准曲线，并在添加有作为溶解增强剂的碳酸锂的磷酸盐缓冲液中、于大于1000-5000μmol/l尿酸浓度范围内建立用于大于1000μmol/l尿酸定量的第二段线性校准曲线，所述第一段线性校准曲线与所述第二段线性校准曲线在1000μmol/l衔接浓度处衔接、且二者在所述衔接浓度处的电流响应偏差小于3%；

7、（2）于不含碳酸锂的磷酸盐缓冲液中对所述待测样本采集差分脉冲伏安响应曲线，并由所述差分脉冲伏安响应曲线获取所述待测样本的阳极氧化峰电流；当所获取的阳极氧化峰电流超出所述第一段线性校准曲线对应于1000μmol/l的电流响应时，改于添加有所述碳酸锂的磷酸盐缓冲液中对所述待测样本重新采集差分脉冲伏安响应曲线、并由其获取所述待测样本的阳极氧化峰电流；

8、（3）当所述待测样本于不含碳酸锂的磷酸盐缓冲液中采集时，依据所述第一段线性校准曲线将所获取的阳极氧化峰电流换算为所述待测样本中的尿酸浓度；当所述待测样本于添加有所述碳酸锂的磷酸盐缓冲液中采集时，依据所述第二段线性校准曲线将所获取的阳极氧化峰电流换算为所述待测样本中的尿酸浓度。

9、上述技术方案中，所述待测样本为共存有抗坏血酸、多巴胺和尿酸的样本；对采集所述待测样本所得的差分脉冲伏安响应曲线进行savitzky-golay平滑后的二阶数值微分处理，使共存的抗坏血酸、多巴胺和尿酸的氧化贡献在所得二阶导数曲线上分别表现为相互独立的极小值点，据此在不使用酶的情况下分辨所述抗坏血酸、多巴胺和尿酸，并识别出对应于尿酸的氧化贡献，从而在抗坏血酸和多巴胺共存下特异性地检测尿酸；其中，在抗坏血酸的浓度不低于多巴胺浓度的20倍的条件下，仍能分辨并识别出尿酸与多巴胺各自对应的极小值点。

10、上述技术方案中，所述第一段线性校准曲线对应的尿酸检测限不大于0.078μmol/l，所述第二段线性校准曲线对应的尿酸检测限不大于0.087μmol/l。

11、本发明提供了一种可穿戴无线电化学传感系统，所述可穿戴无线电化学传感系统配置为可拆卸地佩戴或附着于待测对象的体表，对所述待测对象的体液进行非侵入式实时电化学传感，包括：通过激光微加工在石墨烯薄膜上图案化形成的、包括工作电极、对电极和参比电极的三电极阵列，所述工作电极表面具有连续单层氧化石墨烯活性层，所述连续单层氧化石墨烯活性层由单层氧化石墨烯纳米片以单层平铺、彼此边缘相接且基本不重叠的方式镶嵌成连续层、在所述工作电极表面的覆盖率不低于94.9%且厚度为1.4-1.6nm，所述参比电极由涂覆于所述石墨烯薄膜上的饱和银/氯化银浆料构成；将所述三电极阵列封装于其间、并开设有暴露所述三电极阵列工作区域的电化学窗口的顶层聚对苯二甲酸乙二醇酯封装层和底层聚对苯二甲酸乙二醇酯基底；覆盖于所述电化学窗口之上、用于采集所述待测对象的体液并使所采集的体液与所述工作电极接触的弹性体微流控芯片；以及通过柔性连接器与所述三电极阵列电连接、并集成有电化学测量电路、低功耗无线通信模块和电源管理单元的柔性印刷电路板，所述柔性印刷电路板配置为将由所述三电极阵列采集的电化学信号无线传输至外部智能终端。

12、上述技术方案中，所述弹性体微流控芯片为聚二甲基硅氧烷微流控芯片，其包括半圆形主收集腔、与所述半圆形主收集腔连通的多个入口通道以及位于所述半圆形主收集腔底部的出口通道；所述半圆形主收集腔配置为在所述待测对象的体液经所述多个入口通道进入后，使所述半圆形主收集腔内的分析物浓度在不超过15秒内趋于均匀一致。

13、上述技术方案中，所述可穿戴无线电化学传感系统配置为以无线计时安培法对所述待测对象的汗液中的尿酸进行电化学传感、且所述电化学传感的浓度区间覆盖30-150μmol/l，或配置为以差分脉冲伏安法对所述待测对象的尿液中的尿酸进行电化学传感、且所述电化学传感的浓度区间覆盖2-5mmol/l。

14、上述技术方案所述的可穿戴无线电化学传感系统在尿酸电化学检测中的应用，以所述可穿戴无线电化学传感系统在不使用尿酸氧化酶的条件下，对待测样本中的尿酸进行无酶电化学定量分析；所述待测样本为人工模拟体液或者动物体液，所述人工模拟体液包括人工汗液和人工尿液中的至少一种，所述动物体液为家畜、家禽或水产养殖动物的体液；从而用于智慧农业中家畜、家禽或水产养殖动物的尿酸代谢监测。

15、本发明的有益效果是：本发明的无酶尿酸电化学传感器而言,其工作电极以覆盖率不低于94.9%、厚度1.4-1.6 nm的连续单层氧化石墨烯为活性层,凭借界面电子隧穿距离的最小化与有利的能级匹配,以电极固有活性在较低电位下驱动尿酸的电化学氧化;由于检测无需尿酸氧化酶,从而避免了酶法传感易受环境灭活、稳定性差的问题,又因不依赖贵金属催化位点而显著降低了成本,实现了兼具稳定性与经济性的高灵敏尿酸检测。本发明以经激光图案化的柔性高取向石墨烯薄膜限定工作电极活性区,为传感器提供了柔性、可批量制备的电极基础;本发明量化了上述低过电位优势——在ph 7.4磷酸盐缓冲液中尿酸的差分脉冲伏安阳极氧化峰位于约0.36 v、较裸石墨烯薄膜负移不低于0.3 v,且在不超过1000 μmol/l范围内峰电流随浓度单调增长,为低浓度区间提供了可靠、单调的定量响应基础。

16、本发明以碳酸锂作为溶解增强剂突破尿酸在磷酸盐缓冲液中的固有溶解度上限,并以在1000 μmol/l衔接浓度处电流响应偏差小于3%的两段式拼接校准覆盖0-5000 μmol/l的超宽范围,从而在保持亚微摩尔级检测限的同时使线性范围覆盖临床高浓度区间,从根本上打破了尿酸传感中"检测限—线性范围"难以兼顾的固有权衡。本发明以savitzky–golay平滑后的二阶数值微分,将抗坏血酸、多巴胺与尿酸严重重叠的伏安响应解卷积为相互独立的极小值点,即便在抗坏血酸浓度达多巴胺20倍的强失衡背景下仍能分辨并识别尿酸,从而在不使用酶、不引入额外修饰的条件下满足真实样本的抗干扰要求;本发明进一步将该方法的灵敏度优势体现为不大于0.078 μmol/l(第一段)与0.087 μmol/l(第二段)的低检测限,实现亚0.1 μmol/l级的高灵敏定量。

17、本发明的可穿戴无线电化学传感系统将上述连续单层传感界面与激光图案化三电极阵列、聚对苯二甲酸乙二醇酯三明治封装、弹性体微流控采样模块以及集成有电化学测量电路、低功耗无线通信模块与电源管理单元的柔性印刷电路板相结合,把台式检测平台转化为可贴合体表、对非侵入性体液进行连续实时监测并将数据无线传输至智能终端的可穿戴终端,且其本征传感性能在经历柔性封装、微流控集成与无线传输等系统级工程转化后仍得到有效保持。本发明的聚二甲基硅氧烷微流控芯片以半圆形主收集腔配合多入口通道与底部出口,使腔内分析物浓度在不超过15秒内趋于均匀一致,满足可穿戴场景秒级快速检测对样本充分传质与浓度均匀化的要求;本发明使系统可配置为以无线计时安培法监测汗液中30-150 μmol/l的尿酸、或以差分脉冲伏安法监测尿液中2-5 mmol/l的尿酸,从而适配不同体液与浓度区间的实时监测需求。

18、本发明将所述无酶尿酸电化学传感器或可穿戴无线电化学传感系统用于人工汗液与人工尿液等人工模拟体液中尿酸的无酶电化学定量,验证了其由台式平台向可穿戴系统转化的有效性;结合尿酸作为动物嘌呤代谢终产物的客观存在及本传感界面对尿酸的本征电化学响应,该应用可进一步面向智慧农业中家畜、家禽及水产养殖动物的尿酸代谢监测,为养殖现场即时检测与群体健康管理提供一种无酶、便携、可无线的监测手段。

19、整体而言,本发明以无酶尿酸电化学传感器、尿酸电化学检测方法、可穿戴无线电化学传感系统及其应用,共同提供了一种无酶、无贵金属、低过电位、覆盖0-5000 μmol/l超宽范围、具亚微摩尔级检测限、可在强干扰背景下特异识别尿酸并可穿戴无线实时监测的尿酸传感整体解决方案;其有益效果集中体现于尿酸检测在灵敏度、线性范围、抗干扰选择性与可穿戴集成等方面的性能优势,即提供的是面向尿酸监测的下游传感器件、检测方法与系统。本发明的有益效果在于尿酸检测与可穿戴监测的性能,而不在于该传感界面的制造机理本身,亦不在于将界面电子结构转化为传感靶标筛选的方法学。