一种用于检测肾上腺素的比色传感器及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物传感，尤其涉及一种用于检测肾上腺素的比色传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肾上腺素（epinephrine, ep）是一种关键的儿茶酚胺类神经递质和激素，主要由肾上腺髓质分泌，参与调节人体糖代谢、血压稳定、应激反应等多种生理过程，在中枢神经系统的信号传导中发挥关键作用。正常生理状态下，人体体液中 ep 浓度维持在较低水平（纳摩尔至微摩尔级），但在抑郁症、高血压、糖尿病病理状态下，其浓度会发生异常变化；临床上，盐酸肾上腺素药物通常是作为心脏骤停、过敏性休克的急救药物以及缓解支气管哮喘的急性发作；此外，ep 作为强效的心脏兴奋剂和血管收缩剂，在运动竞技中被列为禁止使用的兴奋剂，其非法使用会严重破坏竞技公平性，同时对使用者心血管系统造成潜在危害。因此，实现体液中 ep 的精准定量检测，不仅可为相关疾病的临床诊断、病理研究提供关键技术支持，也为运动兴奋剂检测、公共卫生监管等领域提供技术保障，因此建立高效、灵敏的 ep 检测方法具有重要的科学意义与实际应用价值。近年来，科研人员已开发多种ep 检测技术，包括高效液相色谱法（hplc）、热透镜光谱法、毛细管电泳法、伏安法及酶联免疫吸附测定（elisa）等，其中，hplc 法具有分离效率高、定性准确等优点，但仪器昂贵、样品前处理复杂、检测周期长，难以满足现场快速检测需求；毛细管电泳法与伏安法虽具有较高的检测灵敏度，但操作流程繁琐，对操作人员专业技能要求较高，且易受基质干扰；elisa法基于抗原-抗体特异性结合，具有良好的选择性，但抗体制备成本高、稳定性差，且检测周期较长，限制了其在即时检测场景中的应用。因此，开发一种操作简便、灵敏度高、选择性强、抗干扰能力优异且适用于复杂基质的 ep 检测技术，成为当前生物传感领域的研究热点与迫切需求。

2、金属有机框架（metal-organic frameworks, mofs）作为一类由金属离子与有机配体通过配位作用形成的多孔晶体材料，具有比表面积大、孔径可调、活性位点丰富、结构可控等独特优势，在催化、传感等领域展现出广阔的应用前景。其中，具有漆酶样活性的mof 纳米酶因兼具天然酶的高催化效率与纳米材料的高稳定性、低成本等优点，是生物传感领域的研究热点。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，能够在无需过氧化氢的情况下，直接将氧气还原为水，同时催化酚类、胺类等底物氧化。铜基 mof（cu-mof）作为漆酶样纳米酶的重要类型，其催化活性源于 cu²⁺/cu⁺之间的 redox 循环，能够高效模拟天然漆酶的催化中心结构与功能。与天然漆酶相比，cu-mof 纳米酶具有优异的稳定性、制备成本低廉、结构可设计性强以及高效的抗干扰能力等显著优势；ep 分子结构中含有典型的儿茶酚基团，可作为漆酶的特异性底物，在漆酶或漆酶样纳米酶的催化下发生氧化反应，生成具有特征光学信号的产物，为 ep 的比色或荧光检测提供了可能。

3、传统的 ep 检测主要依赖血液样本，但血液采集过程具有侵入性，容易引起患者疼痛与不适，且血液样本成分复杂易对检测产生基质干扰，需要专业人员操作与样本预处理。相比之下，间质液（interstitial fluid, isf）是存在于细胞间隙的生物流体，成分与血浆高度相似，含有多种与疾病相关的生物标志物，能够准确反映人体生理状态。水凝胶微针（hydrogel-forming microneedles, hmns）是一种新型的微创采样技术，它由亲水性聚合物通过交联反应形成，其针尖长度通常在 50-1500 μm 之间，能够穿透皮肤角质层但不触及真皮层神经末梢，实现无痛、微创采样，可有效解决isf 提取的难题，使用水凝胶微针贴片操作简便，可由患者自行操作，无需专业技能，适用于家庭健康监测与现场快速检测场景。

4、综上所述，尽管现有的ep检测技术已取得一定进展，但仍存在诸多局限性：传统检测方法（如hplc、毛细管电泳等）往往依赖昂贵复杂的仪器，样品前处理繁琐且检测周期长，难以满足现场快速检测的需求；基于血液样本的检测具有侵入性，易给患者带来不适，且血液成分复杂易引发基质干扰；而现有的免疫学方法（如elisa）则面临抗体制备成本高、稳定性差等问题。此外，现有的传感材料在复杂生物基质中的抗干扰能力、灵敏度及便携性方面仍有待进一步提升。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供一种灵敏度高、专属性强、高通量、分析简单、样品前处理简便的用于检测肾上腺素的比色传感器；本发明的第二目的是提供一种用于检测肾上腺素的比色传感器的制备方法；本发明的另一目的是提供一种上述比色传感器的应用。

2、为了达到上述第一目的，本发明提供的比色传感器的技术方案如下：

3、本发明所述的比色传感器包括cu-mof和4-氨基安替比林，所述cu-mof包括铜基金属有机框架以及掺杂在铜基金属有机框架内的精氨酸；所述铜基金属有机框架是以cu2+为金属源、以2，6-吡啶二羧酸为有机配体自组装形成。

4、本发明以硝酸铜为金属前体，2，6-吡啶二羧酸（2，6-pdca）为有机配体以及掺杂富氮氨基酸-精氨酸（arg），合成新型的模拟天然漆酶活性中心和底物结合位点的cu-mof，通过调节金属前体与有机配体的比例，利用多种分析技术对其结构表征以及漆酶活性对比，优选出漆酶活性最强的cu-mof。通过其催化4-氨基安替比林（4-aap）与肾上腺素形成红色醌染料的显色反应，建立检测信号a495nm（495nm处的吸光度）和肾上腺素浓度之间的定量关系，实现血清等生物样品中ep的可视化快速检测。

5、为了达到上述第二目的，本发明提供的比色传感器的制备方法的技术方案如下：

6、本发明所述的比色传感器的制备方法，包括以下步骤：

7、（1）将铜盐、2，6-吡啶二羧酸、精氨酸溶解在有机溶剂中，得到的混合液进行水热反应，水热反应结束后收集沉淀，即为cu-mof；

8、（2）将cu-mof和4-氨基安替比林与溶剂混合，即得所述比色传感器。

9、其中，步骤（1）中，所述铜盐、2，6-吡啶二羧酸、精氨酸的摩尔比为0.75-2：0.8-1.8：0.2-0.45。

10、为了达到上述第三目的，本发明提供的比色传感器的应用的技术方案如下：

11、本发明所述的比色传感器可在非诊断和治疗目的检测肾上腺素中应用。

12、本发明提供利用上述的比色传感器检测肾上腺素的方法，包括以下步骤：

13、（1）向一系列含有梯度浓度肾上腺素的标准溶液中，分别加入由cu-mof分散液、4-氨基安替比林和ph缓冲液组成的混合体系，经孵育反应后得到系列测试液；测定各测试液在特征波长处的吸光度，以肾上腺素的浓度为横坐标、对应的吸光度值为纵坐标，进行线性拟合，构建吸光度标准曲线；

14、（2）待测样品的检测：将待测样品替换步骤（1）中的标准溶液，与所述的混合体系混合，在与步骤（1）相同的条件下进行孵育反应，得到待测液；测定该待测液的吸光度，并将其代入步骤（1）所得的吸光度标准曲线中，从而计算得出待测样品中肾上腺素的浓度。

15、其中，步骤（1）中，所述cu-mof分散液中的分散溶剂选自：二甲亚砜、无水乙醇、环己烷、异丙醇和水。所述孵育反应的温度为55-65℃，孵育反应时间至少为35min。所述测试液中，cu-mof的浓度是0.15-0.4 mg/ml。

16、本发明所述的比色传感器可在制备水凝胶微针贴片可穿戴传感器中应用。所述水凝胶微针贴片可穿戴传感器包括背衬层以及设置于所述背衬层下方的微针贴片；其中，所述背衬层包括纸基以及负载于所述纸基上的比色传感器。

17、其中，微针贴片为pva/ha复合微针贴片，所述pva/ha复合微针贴片含有聚乙烯醇（pva）和透明质酸（ha）。

18、本发明构建的基于高漆酶活性新型 cu-mof 的水凝胶微针可穿戴传感器，可用于复杂基质中 ep 的灵敏检测。本发明以生物相容性良好的亲水性聚合物pva和透明质酸ha为基质制备水凝胶微针阵列，将 cu-mof 纳米酶负载于微针中，实现 isf 提取与 ep 催化检测的一体化，并利用智能手机拍照快速获取rgb数据，应用于小鼠体内肾上腺素的微创快速、精准检测，该方法无需复杂仪器，操作简单，为现场实时监测提供参考。

19、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明开发了一种操作简便、制备成本低廉且性能稳定的一锅法合成策略，成功制备出具有高漆酶活性的铜基金属有机骨架（cu-mofs）；通过调节金属与配体之间的比例，提升了催化过程中的电子转移能力，优化出最佳漆酶活性的cu-mof；基于cu-mof的传感器对肾上腺素具有0.37μm的检测限和1-600μm的宽线性范围，该方法具有灵敏度高、专属性强、高通量、分析简单、样品前处理简便以及成本低等优点可用于人血清中肾上腺素的检测，且回收率良好；cu-mof@pva/hamns可实现微创无痛采样，缩短检测时间，现场快速检测，适用于反兴奋剂检测等特殊场景，有望应用于过敏性休克、心脏骤停等急救场景中，指导盐酸肾上腺素药物的使用剂量与频次，提升急救成功率，优化治疗方案，减少不良反应，期待能够为新药开发中肾上腺素相关药效评价提供高效检测工具。