一种复合透膜保护体系及应用的制作方法

本发明属于细胞生物，涉及一种复合透膜保护体系及应用。

背景技术：

1、肌肉干细胞因其独特的静息-激活转换特性和成肌分化潜能，在肌肉再生医学、细胞治疗及运动医学领域具有重要价值。肌肉干细胞的临床转化和规模化应用的关键瓶颈之一在于如何实现肌肉干细胞的高质量长期冷冻保存。目前，肌肉干细胞的冷冻保存主要存在以下问题：

2、（1）细胞毒性：最常用的肌肉干细胞冷冻保护剂为包含10v/v%%的dmso（英文名称：dimethyl sulfoxide，中文名称：二甲基亚砜）的基础培养液。虽然dmso能有效渗入细胞、防止胞内冰晶形成，但高浓度dmso会诱导肌肉干细胞向非肌肉谱系方向异常分化，使pax7、myod等成肌标志物表达显著下降；同时，用于临床级细胞制剂的dmso须在复苏后经多步洗涤彻底去除，操作繁琐且增加细胞损失风险，不利于大规模临床转化。

3、（2）非透膜型渗透调节剂的局限性：以海藻糖为代表的非透膜型渗透调节剂具有优良的生物相容性、无细胞毒性，通过“水替代”机制稳定膜磷脂结构。然而，海藻糖无法自主跨越细胞膜，须借助电穿孔、α-毒素等外源性导入手段才能发挥胞内保护作用，操作繁琐且导入过程易造成肌肉干细胞损伤，肌肉干细胞回收率仅约60-70%，限制了其临床应用价值。

4、由此，现有的肌肉干细胞冻存过程中面临dmso毒性高、非透膜型渗透调节剂的使用易造成肌肉干细胞损伤的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种复合透膜保护体系及应用，以解决现有肌肉干细胞冻存过程中dmso毒性高、非透膜型渗透调节剂的使用易造成肌肉干细胞损伤的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，本技术提供一种复合透膜保护体系，该保护体系以生理缓冲液为溶剂，其他成分按照终浓度包括：靶向偶联物1-3mg/ml、透膜型冷冻保护剂2-6v/v%、非透膜型渗透调节剂、细胞膜稳定剂0.5-2μg/ml和抗氧化剂0.5-5mmol/l；所述靶向偶联物由靶向肽经连接臂偶联于纳米递送载体表面形成；所述靶向肽包括pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽，其中，所述cd34结合肽为锚定于肌肉干细胞表面cd34分子的表面识别型结合肽，所述pax7结合肽和myf5结合肽为胞内功能型结合肽；所述非透膜型渗透调节剂包括终浓度分别为50-150mmol/l的海藻糖和20-80mmol/l的低温保护剂，所述低温保护剂包括甜菜碱、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、tmao或脯氨酸中的一种或多种；所述海藻糖与所述低温保护剂的摩尔比为1:0.3-1:0.8。

4、具体的，纳米递送载体为聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊。靶向肽包括pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽，其经连接臂偶联于纳米递送载体表面形成靶向偶联物；聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊与靶向肽的投料质量比为1:0.05-10，聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊、靶向肽在保护体系中的终浓度分别为2mg/ml、0.5-5μmol/l。

5、本技术中，聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊的粒径为80-200nm、zeta电位为-15～-25mv、临界相变温度为8-15℃，聚n-异丙基丙烯酰胺的玻璃化转变温度≤-110℃。该聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊采用低温适配设计方式制备形成，其能够在冷冻降温过程中形成稳定的无定形玻璃态，有利于抑制冰晶重结晶，同时还对肌肉干细胞具有良好的生物相容性。

6、在本技术中，聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊的制备方法包括：

7、s01：n-异丙基丙烯酰胺单体溶于无水乙醇后，加入偶氮二异丁腈，在60℃氮气保护下聚合反应24h，聚合产物经沉淀、真空干燥后得到聚n-异丙基丙烯酰胺粉末。

8、将nipam（英文名称：n-isopropyl acrylamide；中文名称：n-异丙基丙烯酰胺单体）完全溶解在无水乙醇中，按照nipam和aibn（英文名称：2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) ；中文名称：偶氮二异丁腈）的摩尔比为80-120:1向无水乙醇中加入aibn作为引发剂，在55-65℃氮气保护下聚合反应20-28h，得到聚合产物。聚合产物采用乙醚沉淀后，在真空度≤50pa、温度为40-50℃下真空干燥，得到重均分子量为80000-90000da、玻璃化转变温度≤-110℃的聚n-异丙基丙烯酰胺粉末。

9、s02：海藻酸钠溶液中加入1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺后，在20-25℃下活化1-2h，得到nhs酯活化的海藻酸钠中间体。

10、将g/m比为0.5的海藻酸钠加入到去离子水中，配制形成浓度为2%w/v的海藻酸钠溶液。向海藻酸钠溶液中加入1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（英文名称：ethyldimethylaminopropyl carbodiimide；简称：edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（英文名称：n-hydroxy succinimide；简称：nhs），在20-25℃下活化1-2h，以使nhs与edc活化海藻酸钠中的羧基，使得羧基转化为nhs活化酯-coonhs，得到nhs酯活化的海藻酸钠中间体。其中，edc与海藻酸钠中羧基的摩尔比为1-3:1；nhs与edc的摩尔比为1-1.5:1。

11、s03：所述nhs酯活化的海藻酸钠中间体与叠氮化钠在20-30℃下反应6-12h，反应产物经透析纯化、冷冻干燥后得到叠氮化海藻酸钠。

12、按照叠氮化钠与活化羧基的摩尔比为2-5:1，向nhs酯活化的海藻酸钠中间体中加入叠氮化钠，在20-30℃下反应6-12h，以引入叠氮基团。以去离子水为透析液，采用截留分子量为14000da的透析袋对反应产物进行透析纯化处理，且每4-6h换液一次，共透析24h，以便于去除未反应的edc、nhs、叠氮化钠等小分子杂质。该反应产物在-40~-50℃下冷冻4-6h后，在真空度≤10pa、冷阱温度为-60~-80℃下冷冻干燥24-48h，得到叠氮化海藻酸钠。

13、s04：将所述聚n-异丙基丙烯酰胺粉末与所述叠氮化海藻酸钠溶于去离子水中，混匀后经0.45μm滤膜过滤，得到聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊。

14、将聚n-异丙基丙烯酰胺粉末与叠氮化海藻酸钠按照质量比为2-4:1溶于去离子水中，在搅拌转速为300-700rpm、2-8℃下混合1-3h。混合物经0.45μm滤膜过滤，得到聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊。

15、当采用iedda点击化学偶联或降冰片烯-四嗪生物正交反应时，制备过程同上，仅是将s03中的叠氮化钠替换为甲基四嗪-胺，按照甲基四嗪-胺与nhs酯活化的海藻酸钠中间体上活化羧基的摩尔比为1-3:1，在20-30℃下反应6-12h，使四嗪基团通过酰胺键偶联至海藻酸钠分子上。

16、在本技术中，靶向肽选择基于肌肉干细胞特异性标志物的pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽作为肌肉干细胞的特异性靶向分子，且三种结合肽等摩尔比组合，该靶向肽能够实现对肌肉干细胞的精准识别和锚定。

17、具体的，pax7结合肽为胞内功能型结合肽，其通过聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊进行递送，在冻融膜通透化窗口期进入肌肉干细胞内，模拟pax7转录因子的paired-box结构域界面，维持肌肉干细胞命运决定转录因子的稳态水平。myf5结合肽为胞内协同型结合肽，其通过聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊进行递送，进入myf5bhlh结构域表面暴露环区，协同支持成肌分化程序。cd34结合肽为表面识别型结合肽，其识别肌肉干细胞表面的cd34黏附分子，实现肌肉干细胞的特异性锚定。由此，通过pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽的联合，在保证细胞特异性锚定的基础上，实现对肌肉干细胞命运决定转录因子稳态的维持，显著提高综合保护效率和复苏后功能性结合率。

18、在本技术中，pax7结合肽的氨基酸序列为seq id no.1- seq id no.4中任意一项所示的序列，其中，pro-arg-leu为核心结合基序，对应pax7 paired-box结构域β-发夹区的关键识别位点，经spr检测，其结合亲和力kd≤50nmol/l；myf5结合肽的氨基酸序列如seqid no.5所示；cd34结合肽的氨基酸序列如seq id no.6所示，具体为：

19、seq id no.1：gly-pro-arg-leu-ala；

20、seq id no.2：gly-pro-arg-leu-val；

21、seq id no.3：ser-pro-arg-leu-ala；

22、seq id no.4：ser-pro-arg-leu-val。

23、seq id no.5：lys-arg-ala-leu-val；

24、seq id no.6：glu-asp-pro-leu-his。

25、上述三种结合肽均由固相多肽合成法合成，经反相hplc（英文名称：highperformance liquid chromatography；中文名称：高效液相色谱法）检测，其纯度≥95%；针对连接臂偶联前的裸肽，经 maldi-tof（中文名称：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱‌）质谱确认分子量与理论序列分子量一致；连接臂 dibac-peg4000-nhs 酯的偶联修饰步骤在后续靶向偶联物制备阶段完成。

26、本技术中，pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽的氨基酸序列来源、设计依据及制备方法如下：

27、pax7结合肽的氨基酸序列是基于噬菌体展示技术筛选所得，其以paired-box结构域、氨基酸残基1-270的重组人pax7蛋白为靶标，经三轮亲和筛选富集后获得高亲和力候选序列。具体的，pax7结合肽的制备方法包括：

28、s01：将0.5mmol/g取代度的rink amide树脂溶胀于二甲基甲酰胺中20分钟；溶胀结束后，在浓度为20%的哌啶/n,n-二甲基甲酰胺中，依次按照ala→leu→arg→pro→gly的顺序进行fmoc脱保护10min；然后在n,n-二甲基甲酰胺中，在hatu/dipea（中文名称：o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/n,n-二异丙基乙胺）的作用下与氨基酸偶联20min，且每步偶联率≥99.5%。

29、s02：肽链合成完毕后，得到树脂-肽链偶联产物。

30、s03：采用体积比为95:2.5:2.5的tfa（英文名称：trifluoroacetic acid；中文名称：三氟乙酸）、tis（英文名称：triisopropylsilane；中文名称：三异丙基硅烷）和h2o配制裂解液。将偶联产物置于裂解液中，在室温下裂解处理2h；处理结束后，通过树脂进行过滤，过滤产物经冷乙醚沉淀、离心，得到粗产物；

31、s04：粗产物经制备型反相hplc（英文名称：high performance liquidchromatography；中文名称：高效液相色谱法）纯化处理，收集目标峰纯化产物，经冷冻干燥，得到白色粉末状pax7结合肽；其中，制备型反相hplc的色谱条件为：c18柱，乙腈/0.1%tfa梯度洗脱。

32、myf5结合肽的氨基酸序列是基于氨基酸残基为71-142的myf5碱性螺旋-环-螺旋结构域的计算机辅助分子设计，采用autodock vina软件对候选肽库进行虚拟筛选，对应myf5 bhlh区域e-box dna结合槽旁侧蛋白质表面暴露环区；经丙氨酸扫描实验确认lys-arg-ala-leu-val为最小有效结合基序，在pax7+/cd34+骨骼肌卫星细胞表面的特异性结合经免疫荧光共定位验证。具体的，myf5结合肽的制备方法包括：

33、s01：将0.5mmol/g取代度的rink amide树脂溶胀于二甲基甲酰胺中20分钟；溶胀结束后，在浓度为20%的哌啶/n,n-二甲基甲酰胺中，依次按val→leu→ala→arg(pbf)→lys(boc)的顺序进行fmoc脱保护10min；然后在n,n-二甲基甲酰胺中，在hatu/dipea的作用下与氨基酸偶联20min，且每步偶联率≥99.5%。

34、s02-s04：同pax7结合肽的制备过程。

35、cd34结合肽的氨基酸序列是基于克隆号为qbend10克隆的抗cd34单克隆抗体互补决定区cdr3的活性中心模拟肽设计，通过截短实验和丙氨酸扫描确认最小结合基序为glu-asp-pro-leu-his，其对应cd34 i型跨膜糖蛋白胞外区的唾液酸糖基化结合位点，其中，i型跨膜糖蛋白胞外区的氨基酸残基为37-123。cd34结合肽与骨骼肌来源cd34+卫星细胞亚群的结合特异性经竞争性封闭实验确认。具体的，cd34结合肽的制备方法包括：

36、s01：将0.5mmol/g取代度的rink amide树脂溶胀于二甲基甲酰胺中20分钟；溶胀结束后，在浓度为20%的哌啶/n,n-二甲基甲酰胺中，依次按照his(trt)→leu→pro→asp(otbu)→glu(otbu)的顺序进行fmoc脱保护10min；然后在n,n-二甲基甲酰胺中，在hatu/dipea的作用下与氨基酸偶联20min，且每步偶联率≥99.5%。

37、s02-s04：同pax7结合肽的制备过程。

38、另外，pax7结合肽和myf5结合肽能够随着聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊内容释放进入胞质，模拟并稳定内源性转录因子的蛋白-蛋白相互作用界面，从而在复苏后维持肌肉干细胞的转录程序完整性。

39、在本技术中，聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊和靶向肽的偶联方式包括：（1）低温无铜dibac（英文名称：dibenzocyclooctyne；中文名称：二苯并氮杂环辛炔）点击化学偶联；（2）iedda（英文名称：inverse electron demand diels-alder reaction；中文名称：逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应）点击化学偶联；（3）降冰片烯-四嗪生物正交反应。

40、其中，低温无铜dibac点击化学偶联过程为：将pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽等摩尔比混合形成靶向肽混合物后，与dibac-(peg)4000-nhs酯混合，按照dibac-(peg) 4000-nhs酯与靶向肽的摩尔比为1.2:1，在ph 7.2的磷酸盐缓冲液中、室温下反应2h，得到dibac修饰的靶向肽混合物；其中，连接臂结构为dibac-(peg) 4000-nhs酯，nhs酯与肽n端氨基发生酰胺键偶联，dibac基团用于与纳米微囊表面叠氮基团发生spaac点击反应；将dibac修饰的靶向肽混合物与聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊按照质量比为1:10分散在ph为7.2的磷酸盐缓冲液中，在4℃条件下反应45分钟，以使dibac点击化学的八元环张力炔烃与叠氮基团发生1,3-偶极环加成反应。反应结束后，反应产物在离心力为10000g下离心15min，去除未反应的游离靶向肽，得到靶向偶联物。

41、反应结束后，反应体系中未检出铜离子残留，检测限≤0.001μmol/l，反应效率≥93%。dibac点击化学的八元环张力炔烃基团与纳米微囊表面的叠氮基团发生应变促进的1,3-偶极环加成反应，无需铜催化剂即可在低温条件下高效进行，避免了铜离子残留对肌肉干细胞的氧化应激损伤。

42、iedda点击化学偶联过程为：

43、将pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽等摩尔比混合形成靶向肽混合物后，与tco（反式环辛烯，trans-cyclooctene）-nhs酯混合，按照tco与靶向肽的摩尔比为1.2:1，在ph 7.2的磷酸盐缓冲液中、室温下反应2h，得到tco修饰的靶向肽混合物；将tco修饰的靶向肽混合物与四嗪（tetrazine）修饰的聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊按照质量比为1:10分散在ph为7.2的磷酸盐缓冲液中，在4℃条件下反应30分钟，以使tco与四嗪发生逆电子需求的狄尔斯-阿尔德环加成反应。反应结束后，反应产物在离心力为10000g下离心15min，去除未反应的游离靶向肽，得到靶向偶联物，该反应效率≥90%。

44、降冰片烯-四嗪生物正交反应过程为：

45、将pax7结合肽、myf5结合肽和cd34结合肽等摩尔比混合形成靶向肽混合物后，与降冰片烯-nhs酯混合，按照降冰片烯与靶向肽的摩尔比为1.5:1在ph 7.2的磷酸盐缓冲液中、室温下反应2h，得到降冰片烯修饰的靶向肽混合物；将降冰片烯修饰的靶向肽混合物与四嗪修饰的聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊按照质量比为1:10分散在ph为7.2的磷酸盐缓冲液中，在4℃条件下反应1h，以使降冰片烯与四嗪发生生物正交环加成反应。反应结束后，反应产物在离心力为10000g下离心15min，去除未反应的游离靶向肽，得到靶向偶联物。该反应效率≥88%。

46、上述三种偶联方式中，低温无铜dibac点击化学偶联方式：4℃低温反应条件避免对肌肉干细胞活性的损伤；无铜催化避免铜离子残留对肌肉干细胞的氧化应激损伤；反应效率≥93%，确保靶向肽充分偶联；iedda点击化学偶联方式：4℃下30min即可完成，反应效率≥90%；tco与四嗪的逆电子需求diels-alder反应具有极高的反应选择性和生物正交性；但tco在长期储存中存在顺反异构化风险，可能导致反应活性下降，且tco修饰试剂成本相对较高；降冰片烯-四嗪生物正交反应方式：降冰片烯原料稳定性好，储存期长，反应条件温和，生物相容性良好；但反应速率相对较慢，4℃下需1h；反应效率≥88%；降冰片烯与四嗪的反应动力学常数低于tco-四嗪体系。

47、由此，上述三种偶联方式均可以实现靶向肽与纳米微囊的高效偶联，可以根据实际应用中的反应效率要求、试剂成本和储存条件灵活选择。较为优选的，选用低温无铜dibac点击化学偶联方式，这是由于4℃的低温反应条件能够避免高温对肌肉干细胞活性的损伤，且无铜催化避免了铜离子残留对肌肉干细胞的氧化应激损伤；同时，≥93%的高反应效率确保了靶向肽的充分偶联。

48、透膜型冷冻保护剂包括二甲基亚砜和/或乙二醇，其在复合透膜保护体系中的终浓度为2-6v/v%，优选为3-5v/v%。二甲基亚砜的浓度从传统的10%降至3-5%，以乙二醇作为辅助透膜剂，二元透膜体系在低浓度下产生协同效应，共同维持细胞内渗透压平衡。当二甲基亚砜和乙二醇为7:3时，二元透膜体系对细胞活力和pax7表达维持分别提升约13个百分点、约19个百分点。

49、非透膜型渗透调节剂包括摩尔比为1:0.3-1:0.8的海藻糖和低温保护剂，其中，海藻糖的浓度为50-150mmol/l，低温保护剂的浓度为20-80mmol/l。本技术中的低温保护剂包括甜菜碱、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、tmao（英文名称：trimethylamine oxide；中文名称：三甲基胺氧化物）或脯氨酸中的一种或多种。其中，甜菜碱、四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶为优选的低温保护剂，此类甜菜碱型低温保护剂为相容性溶质，与海藻糖复配时具有显著的协同增效作用，能够在低温下维持细胞稳定性，且海藻糖与甜菜碱复配体系的复苏存活率可达93.5±1.6%，显著高于海藻糖单独使用时的86.2±3.5%，p<0.05。tmao与脯氨酸虽也具有一定的低温保护活性，但其与海藻糖复配时的协同效果显著弱于甜菜碱型低温保护剂，如海藻糖与tmao复配时复苏存活率仅为85.25±2.8%，显著低于甜菜碱复配体系，p<0.05，在本技术中不作为优选的协同低温保护剂。

50、细胞膜稳定剂有助于在冷冻-复苏过程中维持细胞膜完整性。本技术中的细胞膜稳定剂包括磷脂酰丝氨酸衍生物、普朗尼克f68、胆固醇衍生物和鞘磷脂中的一种或多种，其中，磷脂酰丝氨酸衍生物包括含有两条油酰链18:1的dops（英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine；中文名称：二油酰磷脂酰丝氨酸）或含有一条棕榈酰链16:0和一条油酰链18:1的pops（英文名称：1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine；中文名称：棕榈酰油酰磷脂酰丝氨酸）；胆固醇衍生物包括胆固醇琥珀酸酯单酯（英文名称：cholesteryl hemisuccinate；简称：chems）、peg化胆固醇（cholesterol-peg2000）、胆固醇硫酸酯（英文名称：cholesteryl sulfate）和甲基-β-环糊精-胆固醇包合物中的一种或多种，其中，胆固醇琥珀酸酯单酯在冷冻过程中通过ph响应性嵌入细胞膜，动态调节膜流动性；peg化胆固醇通过peg链增加空间位阻，减少非特异性吸附并提高体系胶体稳定性。

51、抗氧化剂包括还原型谷胱甘肽（简称：gsh）、n-乙酰半胱氨酸（简称：nac）、褪黑素、mitoq和白藜芦醇中的一种或多种，其中，还原型谷胱甘肽主要清除超氧阴离子和h2o2，n-乙酰半胱氨酸通过补充谷胱甘肽前体并直接清除脂质过氧化自由基，由此，可将复苏后细胞ros（英文名称：reactive oxygen species；中文名称：活性氧）水平控制在冷冻前的约1.3倍，有效减少氧化应激导致的dna损伤和细胞凋亡。

52、生理缓冲液的ph为7.2-7.4，其成分按照终浓度包括nacl 120-140mmol/l、kcl 3-5mmol/l、mgcl21-3mmol/l、葡萄糖5-10mmol/l。

53、在本技术中，复合透膜保护体系的制备方法包括：在a级洁净室无菌条件下，将靶向偶联物、透膜型冷冻保护剂、非透膜型渗透调节剂、细胞膜稳定剂和抗氧化剂加入到生理缓冲液中，调节ph为7.3±0.05，形成混合液；该混合液经0.22μm pes（英文名称：polyethersulfone；中文名称：聚醚砜）滤膜过滤除菌，分装于低温冻存管中，充氮封装，于4℃避光保存。

54、进一步，本技术中的复合透膜保护体系还包括终浓度为5-20μmol/l的rho激酶抑制剂y-27632和/或终浓度为0.5-5μg/ml的重组人纤连蛋白片段，其中，rho激酶抑制剂y-27632用于抑制冷冻应激诱导的细胞凋亡，重组人纤连蛋白片段用于维持肌肉干细胞的黏附特性和机械信号传导。重组人纤连蛋白片段为ch-296片段（retronectin），其商品名为retronectin，由takara bio公司生产，货号为t100b/t202，由大肠杆菌重组表达，包含人纤连蛋白fniii-8、fniii-9、fniii-11（takara编号 iii-10）、fniii-12、fniii-13、fniii-14共6个iii型重复序列及cs-1活性位点，按uniprot p02751标准domain边界拼接为575个氨基酸残基，其氨基酸序列如seq id no.7所示，编码该片段的密码子优化核苷酸序列如seqid no.8所示。该片段同时包含rgd基序（fniii-11，介导整合素α5β1结合）和ldv基序（cs-1区，介导整合素α4β1结合），能够通过整合素α5β1和α4β1双通路介导肌肉干细胞的黏附和机械信号传导。

55、此外，上述seq id no.7所示的氨基酸序列全长为575个氨基酸残基，包含fniii-8、fniii-9、fniii-11、fniii-12、fniii-13、fniii-14及cs-1区共7个结构域；上述seq idno.8为编码seq id no.7的密码子优化核苷酸序列，全长1725个碱基对；二者的完整序列详见本技术序列表（seq listing）中的seq id no.7和seq id no.8。

56、第二方面，本技术提供一种复合透膜保护体系的应用，即用于肌肉干细胞冷冻保存。本技术中的肌肉干细胞选自骨骼肌来源卫星细胞、脂肪来源肌肉前体细胞或肌肉干/祖细胞系中的至少一种。冷冻保存后的肌肉干细胞可以用于治疗肌肉萎缩症、肌营养不良、运动损伤修复、肌少症或衰弱综合征相关疾病。

57、第三方面，本技术提供一种肌肉干细胞冷冻保存方法，该方法包括：

58、肌肉干细胞在含终浓度5-20μmol/l rho激酶抑制剂y-27632的培养液中预培养1-2h后，将所述肌肉干细胞加入到第一方面中的复合透膜保护体系中，在4℃下孵育15-30min，程序降温至-80℃后，在-196℃保存。

59、具体为：将肌肉干细胞放置于含5-20μmol/l rho激酶抑制剂y-27632的培养液中预培养1-2h；将预培养后的肌肉干细胞与第一方面中的复合透膜保护体系中的靶向偶联物在4℃孵育30min，以使靶向偶联物中的靶向肽对肌肉干细胞实现高效靶向锚定；孵育结束后，将孵育后的肌肉干细胞以1×106-1×107个/ml的密度悬浮于第一方面中的复合透膜保护体系中，在4℃下孵育15-30min，以使复合透膜保护体系充分渗透并与肌肉干细胞建立稳定相互作用；孵育结束后，按照-2℃/min由室温降至0℃、-1℃/min降至-40℃、-5℃/min降至-80℃的程序降温，最终转移至-196℃的液氮中长期保存。

60、当冷冻保存的肌肉干细胞进行复苏时，将冻存管置于37℃水浴中振摇90秒完成复苏，再以4℃预冷完全培养基按10:1体积比逐步稀释，最后离心洗涤，得到复苏后的肌肉干细胞。

61、第四方面，本技术提供一种肌肉干细胞冷冻保存试剂盒，该试剂盒包括第一方面中的复合透膜保护体系，并在2-8℃存储。试剂盒中的各组分均符合usp（英文名称：unitedstates pharmacopeia；中文名称：美国药典）、ph. eur.或等效质量标准，可用于gmp（英文名称：good manufacturing practice of medical products，中文名称：药品生产质量管理规范）级细胞制剂的生产。

62、本发明具有以下有益效果：

63、（1）纳米微囊的低温适配设计与高效靶向偶联：tg≤-110℃、临界相变温度为8-15℃的聚n-异丙基丙烯酰胺-海藻酸钠纳米微囊在冷冻过程中具有良好的无定形玻璃态形成能力，有利于抑制冰晶重结晶；通过低温无铜dibac点击化学偶联靶向肽，反应效率≥93%，反应体系中未检出铜离子残留，能够避免高温或铜催化对肌肉干细胞的活性损伤。

64、（2）低dmso浓度下细胞活力与干性功能显著提升：3.5%dmso+1.5%乙二醇二元体系替代传统10%dmso后，dmso的浓度降低约65%，但复苏存活率由80.5±4.2%提升至93.5±1.6%，pax7阳性率由73.4±6.1%提升至92.1±5.1%，myhc阳性率由67.9±5.8%提升至89.8±3.8%，这表明乙二醇与低浓度dmso的协同作用不仅显著降低了dmso毒性，且在维持优异细胞保护效果方面产生了预料不到的技术效果。

65、（3）海藻糖与甜菜碱型低温保护剂的协同增效作用：海藻糖与甜菜碱联合使用协同保护肌肉干细胞复苏存活率达到93.5±1.6%，显著优于海藻糖单独使用。

66、（4）高效的氧化应激抑制：gsh与nac协同抗氧化剂将复苏肌肉干细胞的ros水平控制在冷冻前的约1.3倍，相比传统10%dmso方法降低了约64%，有效减少氧化应激导致的dna损伤和细胞凋亡。

67、（5）细胞膜稳定剂的辅助保护作用：磷脂酰丝氨酸衍生物、普朗尼克f68、胆固醇衍生物和鞘磷脂等膜稳定剂有助于在冷冻-复苏过程中维持细胞膜完整性，与冻存体系其他组分协同实现93%以上的复苏率。

68、（6）全面的细胞功能保护：通过靶向递送-透膜保护-稳膜-抗氧化的四重协同机制实现肌肉干细胞冷冻复苏率提升至93%以上，pax7保留率92.1±5.1%，myhc阳性率89.8±3.8%，显著优于传统10% dmso冻存液和商品化通用冻存液。