一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法

本发明涉及植物细胞工程，尤其涉及一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法。

背景技术：

1、山桐子(

idesia polycarpa maxim.)作为我国特有的高产木本油料树种，被誉为“树上油库”，兼具生态修复与食用油开发等多重价值，可在不占用耕地的前提下依托荒山、荒坡大规模种植，是国家重点布局的木本油料战略树种，产业规模化需求迫切。

2、当前山桐子繁育多依赖实生播种，存在苗期难辨雌雄、需4-5年挂果后才能分辨雌雄株，极易导致造林后雌雄比例失调等难题，严重阻碍山桐子产业的高效发展。

3、因此，建立稳定高效的离体再生体系是山桐子优良种苗无性繁育、实现性别提前固定以及开展基因功能研究的基础。

4、现有山桐子再生途径多为愈伤组织诱导再分化途径，该途径需要先诱导产生愈伤组织，再进行愈伤组织继代增殖和不定芽诱导，存在培养周期长、体细胞变异概率高等问题。

5、而关于直接器官发生途径的再生体系构建，目前仅见通过叶柄直接诱导不定芽的报道，尚未见以叶片直接诱导不定根再诱导不定芽，实现完整植株再生的相关报道。

6、因此，针对现有技术中的问题，提供一种无需愈伤组织诱导阶段，可直接从叶片外植体诱导不定根再分化获得不定芽，能够有效缩短培养周期，降低变异概率的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，可以建立山桐子高效稳定的再生体系。

2、为解决上述技术问题，本发明采取了如下技术方案：

3、一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，包括以下步骤：

4、（1）外植体的获取

5、获取方式有以下三种，任选其一：

6、方式一：选择山桐子雌雄优株的枝条，带回实验室进行水培、雾培、基质培、无菌培养等新萌发的叶片作为外植体；

7、方式二：选择山桐子种子进行表面蜡质去除、低温层积后，先利用75%酒精消毒2min，无菌水冲洗2~3次，再利用0.1%氯化汞溶液消毒15 min，无菌水冲洗4~6次，随后将其接种于空白ms培养基平板上进行无菌萌发，于25℃培养15~30 d后，取无菌实生苗的叶片作为外植体；其中空白ms培养基平板包含ms培养基干粉、琼脂，ph为5.8；

8、方式三：山桐子无菌苗需定期进行继代增殖培养，继代增殖过程中需对多余叶片进行修剪，常规做法是剪掉的多余叶片直接扔掉，故可以继代培养过程中剪掉的多余无菌叶片作为外植体；

9、（2）外植体的预处理：

10、获得无菌叶片后，将无菌叶片进行切割处理；

11、（3）不定根的诱导：

12、将上述叶片采用基部插入、叶块平铺在不定根诱导培养基上，先暗培养3~7 d后转移至光下培养诱导产生不定根；

13、（4）不定芽的诱导：

14、将上述处理后不带叶柄的叶片、内部刻伤或未刻伤的叶块采用平铺在不定芽诱导培养基，先暗培养3~7 d后转移至光下培养诱导产生不定芽。

15、优选的，所述步骤（2）中，切割处理的方式为：不带叶柄的完整叶片、带0.5 cm长度叶柄的完整叶片、带1.0 cm长度叶柄的完整叶片、内部未刻伤的叶块0.5~1.0×0.5~1.0cm2、内部不伤害主叶脉刻伤2~4个刀口的叶块0.5~1.0×0.5~1.0 cm2。

16、优选的，所述步骤（3）和步骤（4）中，光下培养诱导的条件为：光周期为12 h光照、12 h黑暗、光照强度为1500~3000 lux。

17、优选的，所述步骤（3）中，不定根诱导培养基为：

18、1/4ms+0.01~4.0 mg/l iba+5~30 g/l蔗糖+4~8 g/l卡拉胶，培养基ph值为5.4~6.2。

19、优选的，所述步骤（4）中，还包括：待不定芽生长至0.5-1.0 cm时，剪下单个不定芽接种至增殖培养基进行扩繁，待不定芽长出后，切下带有1~2个生长点的不定芽块接种至不定芽增殖培养基。

20、优选的，所述步骤（4）中，不定芽诱导培养基为：ms+0.1-2.5 mg/l 6-ba+0-0.3mg/l iba+20-40 g/l蔗糖+4~10 g/l琼脂，培养基ph值为5.4~6.2。

21、优选的，所述不定芽增殖培养基为：ms+0.1-5.0 mg/l 6-ba+0.1-2.0 mg/l iba+20-40 g/l蔗糖+4~10 g/l琼脂，培养基ph值为5.4~6.2。

22、本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

23、（1）技术体系突破：首次建立山桐子叶片一步式直接再生不定根体系，无需愈伤组织诱导环节，不同大小、切割方式的叶片外植体均可直接诱导产生不定根，彻底解决了现有山桐子组培技术依赖愈伤组织再生，存在培养周期长、体细胞变异率高、遗传稳定性差的行业共性问题，填补了山桐子在直接器官发生领域的技术空白。

24、（2）降低生产成本：整体操作流程简单，无需复杂前处理，外植体取材便利、材料利用率高，可大幅减少组培生产的试剂投入与人工成本。

25、（3）解决产业痛点：可快速定向繁育性状稳定的优良雌性山桐子种苗，解决了现有实生苗无法早期鉴别雌雄、良种壮苗供给缺口超千万株的产业发展难题，支撑山桐子产业良种化、规模化发展。

26、（4）拓展应用场景：可广泛应用于山桐子优良单株的规模化无性扩繁，同时为山桐子crispr编辑、农杆菌介导遗传转化等分子育种体系搭建提供核心技术支撑，可支撑山桐子基因功能验证、定向遗传改良等研究工作。

27、（5）契合战略需求：以兼具生态修复、油料生产、景观利用多重价值，是保障国家粮油安全“不与粮争地”的新型油料作物山桐子为研究对象，该技术为国家粮油安全布局下山桐子产业的发展提供了关键底层技术支撑。

1.一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，切割处理的方式为：不带叶柄的完整叶片、带0.5 cm长度叶柄的完整叶片、带1.0 cm长度叶柄的完整叶片、内部未刻伤的叶块0.5~1.0×0.5~1.0 cm2、内部不伤害主叶脉刻伤2~4个刀口的叶块0.5~1.0×0.5~1.0 cm2。

3.根据权利要求1所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中，光下培养诱导的条件为：光周期为12 h光照、12 h黑暗、光照强度为1500~3000 lux。

4.根据权利要求1所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，不定根诱导培养基为：

5.根据权利要求1所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，还包括：待不定芽生长至0.5-1.0 cm时，剪下单个不定芽接种至增殖培养基进行扩繁，待不定芽长出后，切下带有1~2个生长点的不定芽块接种至不定芽增殖培养基。

6.根据权利要求1所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，不定芽诱导培养基为：ms+0.1-2.5 mg/l 6-ba+0-0.3 mg/l iba+20-40 g/l蔗糖+4~10 g/l琼脂，培养基ph值为5.4~6.2。

7.根据权利要求5所述的一种山桐子叶片直接诱导不定根再生途径的构建方法，其特征在于，所述不定芽增殖培养基为：ms+0.1-5.0 mg/l 6-ba+0.1-2.0 mg/l iba+20-40 g/l蔗糖+4~10 g/l琼脂，培养基ph值为5.4~6.2。