玉蜀黍花粉油悬浮液的制作方法

本发明涉及玉蜀黍育种和人为诱导授粉领域，并且特别涉及在玉蜀黍生产田地和温室中施用所储存玉蜀黍花粉的领域。

背景技术：

1、花粉储存长期以来一直是植物育种者的需求和目标。通常参见w.m.king, reportof chief on seed divisions [种子部门领导报告], in report of the commissionerof agriculture (yearbook) [农业部长报告（年鉴）], 华盛顿特区, gpo, 47-61 (1885)（阐明了对储存的花粉的期望“使得我们可以在我们自己方便的时间和地点使用它。”）。在一些植物中，花粉非常耐寒且寿命长。例如，银杏树花粉可以被收集并且在无需特别照料的情况下储存六个月或更长时间。相比之下，其他植物的花粉很脆弱，并且如果暴露在这些要素中，它们易于在数小时内迅速衰败。玉蜀黍（玉米）是一种这样的植物。

2、在玉蜀黍商业化杂交种生产田地中，目前的实践是交替种植四行雌性近交植株与两行雄性近交植株。将雌性去雄以防止自花授粉，而雄性仅因其对邻近雌性授粉的能力而种植。这种安排在雌性植株和雄性植株属于类似的成熟期组（即，雄性在雌性可授花粉的大约相同时间散落花粉）的情况下效果最好。

3、然而，如果雄性和雌性属于不同的成熟期组或者如果雄性和雌性的生殖成熟度不同步，对于农民，存在不能成功授粉，并且因此损失作物的风险。在没有花粉储存的情况下，对于农民，存在雄性植株过早或过晚散落花粉的风险，并且可能由于授粉失败而损失整个田地。通过花粉储存和用于递送储存的花粉的有效方法，无论开花期面临何种挑战，花粉都可以精确地在正确的时间递送。可以更容易地完成不同成熟期组的种间杂交，从而扩大遗传库并且改善玉蜀黍植株育种，例如，通过制备更具干旱和/或疾病抗性的玉蜀黍品系。此类方法还将使得所希望的性状能够从一个玉蜀黍品系渐渗到另一个玉蜀黍品系。

技术实现思路

1、农民需要能够在一天或在一个位置可靠地收集和储存有活力的玉蜀黍花粉，并且在另一天和/或在另一位置将该花粉递送到雌性田地。为了满足这种需要，提供了将玉蜀黍花粉递送至雌性植株的方法。在一个实施例中，收集一定量的新鲜玉蜀黍花粉，任选地用载体处理收集的花粉，并将花粉和任选的载体添加到油中。油中的花粉悬浮液可以递送至雌性玉蜀黍植株，导致成功受精。在一方面，载体是微晶纤维素、活性硅酸镁、滑石粉末或二氧化硅粉末。

2、定义

3、除非下文中另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与如本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。对本文采用的技术的提及旨在是指本领域中通常所理解的技术，包括对本领域普通技术人员而言很清楚的那些技术的变型和/或等效技术的替代方案。虽然认为以下术语可以被本领域普通技术人员很好地理解，还是阐述了以下定义以促进对本发明披露的主题的解释。

4、除非内容清楚规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种（a/an）”和“该/所述（the）”包括复数指代物。因此，例如，提及“抗体”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。

5、如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围，例如± 20%、± 10%或± 5%在所列举值的预期含义内。

6、“油”是非极性液体，将花粉添加到其中形成悬浮液。“油”可以是指来源于植物的甘油三酯混合物、来源于石油的烃混合物、或具有与植物来源的甘油三酯混合物和石油来源的烃混合物类似的特性的合成物质。在每个概述的实验中列出了具体油类型。在给定部分中进一步使用的术语“油”是指最初陈述的类型的油。

7、如本文所用，“澄清”是指处理油以从油中去除某些组分的过程。处理过程包括将油与具有高比表面积的粉末混合或将油通过相同粉末过滤。具有高比表面积的粉末可以包括酸或碱组分以辅助澄清。可以包括使油通过过滤器以去除粉末的步骤。通过过滤器或粉末床过滤可以通过重力或在真空泵的辅助下完成。用于澄清的粉末包括但不限于活性炭、magnesol®和florisil®。

8、如本文所用，“容器”或“器皿”是指能够将花粉保持在其中的物体。例如，容器可以是指magenta ga7盒。所述容器或器皿还包括透气屏障。如本文所用，“透气屏障”是指用于玉蜀黍花粉的储存容器或器皿的部件。容器或器皿的透气屏障部件允许足够的气体交换和最小的水蒸气透过。透气屏障可以包括但不限于石蜡膜、tyvek、微孔胶带、在除此之外气密的储存容器或器皿（例如，梅森罐（mason jar）和盖）中的穿孔，或使用制造至指定总表面积的具有用于气体交换的口孔的非气密容器或器皿（例如，蛤壳式容器、magenta ga7盒、vwr®细胞培养烧瓶25-850 ml容量）。对于细胞培养烧瓶，通常参见us.vwr.com/store/product/12585790/vwr-cell-culture-flasks。非气密容器还可以包括例如梅森罐并且具有穿孔盖。

9、如本文所用，“载体”意指充当伴随收集的花粉的试剂的化合物，优选呈粉末状形式。合适的载体化合物可以是但不限于滑石粉末、二氧化硅粉末、微晶纤维素等。

10、如本文所用，“结块”、“聚集”和类似术语是指在不存在载体和/或合适的储存条件的情况下花粉结合在一起的趋势，无论是由于过量的水分还是其他原因。结块的花粉是不可流动的并且不能被空气吹到花丝上。结块的花粉不太可能充分附着到花丝以引起授粉。

11、如本文所用，术语“包含（comprising）”或“包含（comprise）”是开放式的。当与包括一系列步骤的方法结合使用时，即使进行了另外的步骤，但是只要进行了所述一系列步骤，该方法仍然被实践。

12、如本文所用，“结晶二氧化硅”是指来源于石英或其他天然岩层的粉末状形式的二氧化硅。术语“结晶二氧化硅”、“sio2”和“多晶二氧化硅”在全文可互换使用。与滑石或无定形二氧化硅相比，结晶二氧化硅具有不同的结构特性，所述特性包括但不限于更高的莫氏矿物硬度、更高的堆积密度和更低的比表面积。在一个实施例中，结晶二氧化硅具有在1纳米（1 nm）与100微米（100 µm）之间的平均粒度。在另一个实施例中，结晶二氧化硅具有在1微米（1 µm）与10微米（10 µm）之间的平均粒度。除非另有规定，否则本文提供的粒度值是平均尺寸。

13、如本文所用，“活性硅酸镁”是指合成粉末状硅酸镁。术语“活性硅酸镁”、“合成无定形活性硅酸镁”和“mgo3si”在全文中可互换使用。“florisil®”是可商购的活性硅酸镁源。参见www.ussilica.com/products/florisil。活性硅酸镁的特征在于无定形结构和高比表面积。在一个实施例中，活性硅酸镁具有在1纳米（1 nm）与100微米（100 µm）之间的平均粒度。在另一个实施例中，活性硅酸镁具有在1微米（1 µm）与10微米（10 µm）之间的平均粒度。

14、如本文所用，“微晶纤维素”是指来源于α纤维素原料的合成聚合物。“avicel®”是可商购的微晶纤维素源（参见例如pharma.iff.com/industry-segments/pharma-solutions/products/avicel）。微晶纤维素的特征在于晶体结构和低比表面积。在一个实施例中，微晶纤维素具有42微米（42 µm）的平均粒度。在另一个实施例中，微晶纤维素具有167微米（167 µm）的平均粒度。在另一个实施例中，粒度表示为通过75微米筛（75 µm，us200筛目）的颗粒的百分比。粒度可以使用如astm e11-22（www.astm.org/e0011-22.html）所定义的标准筛目大小来描述。

15、如本文所用，“可流动”意指粉末样物质通过施加空气、风、声音而容易移动或以不间断的连续性倾倒并且稳定且容易进行的能力。

16、如本文所用，术语“气体”是指气体混合物（例如，正常空气组成或富氧空气的气体组合）或基本上纯的气体（例如，纯氧）。在一个实施例中，当提及气体时，可以是指氧气和二氧化碳。

17、术语“种质”是指群体或其他个体组（例如，物种或植物品系）的基因型的总体。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；因此，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体的一部分并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。

18、如本文所用，“杂种优势群”是指近交系的育种分类。“杂种优势群”和“杂种优势库”可互换地使用并且是指玉蜀黍群体的育种库之间的关系。概括地说，杂种优势库的主要名称是：硬茎（stiff stalk）（“ss”，也称为爱荷华硬茎合成（iowa stiff stalksynthetic）或“bsss”）、非硬茎（non stiff stalk）（“nss”）和爱华马齿（iodent）（“idt”）。参见j. v. hweerwaarden等人, historical genomics of north american maize [北美玉蜀黍的历史基因组学], proc. nat’l acad. sci. u.s.a. [美国国家科学院院刊] 109(31): 12420-25 (2012)。然而，这些不是排他性的，并且已知有其他名称，例如，兰卡斯特修尔作物（lancaster sure crop）（“lsc”）。参见，例如，c. livini等人, geneticdiversity of maize inbred lines with and among heterotic groups revealed byrflps [通过rflp揭示的具有杂种优势群和杂优势群之间的玉米自交系的遗传多样性]，theor. appl. genet[理论与应用遗传学]. 84: 17-25 (1992)。还参见hallauer等人(1998) com breeding [组合育种], 第463-564页；g.f. sprague和j.w. dudley（编辑）corn and corn improvement [玉米和玉米改良]；smith等人 (1990) theor. appl. gen.[理论和应用遗传学] 80:833-840；mikel和dudley (2006) crop set [作物集] 46:1193-1205。还参见wo 2020/205334和wo 2021/041077。

19、“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。特别地，在本披露的上下文中，植物是指玉蜀黍植株。如本文所用，术语“植物品系”指单一植物材料或遗传上相同的一组材料。

20、如本文所用，“冷藏环境”意指温度低于环境温度（或室温）但不低于水冻结的温度的任何条件。换句话说，如果环境温度为25°c，则冷藏环境包括大于0°c且低于25°c的温度。同样，冷藏环境包括在2°c与10°c之间的温度。

21、如本文所用，“精炼的”是指油在其生产中在分销之前的加工。这包括螺旋压榨、冷榨、自然精炼、烘焙、热处理、以及冬化处理。所测试的油具有不同的精炼程度，范围从未精炼的（加工最少的）到轻度精炼的（加工程度中等的）到精炼的（加工最多的）。

22、如本文所用，“可密封容器”意指能够形成气密密封的任何容器。优选地，可密封容器还能够保持真空。

23、如本文所用，“结实”意指由于成功授粉事件而在穗轴上产生的籽粒的数量。结实可以定性地（例如，低、良好或高）或定量地表示。在定量测量中，测量值可以以每穗种子的百分比或数量。该术语通常是指正常籽粒（即，非败育的、有胚乳活力的籽粒）的百分比或数量。实现良好的结实是受控授粉事件的目标。

24、如本文所用，“储存”是指将花粉储存合适的时间段的行为。

25、如本文所用，“鼓泡”是指使气体通过油，或通过油和花粉混合物产生气泡。用于鼓泡的气体可以是但不限于大气空气、100%氧气或100%氮气。鼓泡可以在不同的气体压力和流速下进行。

26、如本文所用，“处理”意指对花粉有意施用化合物或环境约束。特别地，花粉处理可以包括向花粉添加载体化合物，以保留花粉的可流动性和生活力。

27、如本文所用，“有活力的”是指给定对象按预期执行，完全执行其预期作用并保持生产力的能力。有活力的花粉是存活的并且能够萌发的花粉。有活力的油是支持花粉存活并促进花粉粒萌发的油。

28、如本文所用，“生活力（vigor）”意指花粉附着花丝、萌发花粉管并且成功使卵细胞受精的能力。“有活力的”、“活力”及类似术语可与“生活力”互换使用。

29、如本文所用，“卡诺拉油”是指来源于针对低芥酸含量育种的油菜栽培品种的食品级油。假定产生食品级油的油菜栽培品种来源于甘蓝型油菜和白菜型油菜遗传学背景，其油芥酸含量≤2%。

30、如本文所用，术语转基因“事件”是指通过用异源dna（例如，包含目的基因的表达盒）转化和再生单个植物细胞而产生的重组植物。术语“事件”是指包括异源dna的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也是指通过转化体与另一种玉米品系之间进行有性异交而产生的子代。即使在重复回交至轮回亲本后，来自转化的亲本的插入dna和侧翼dna存在于在杂交子代的同样的染色体位置。通常，植物组织的转化产生多个事件，其中每个事件代表dna构建体插入植物细胞基因组的不同位置。基于转基因的表达或其他希望特征，选择特定事件。因此，例如，如本文所用，“事件3272”、“3272”或“3272事件”意指原始3272转化体和/或3272转化体的子代和/或以任何方式来源于原始3272转化体的植物。对于3272，参见wo 06/098952。

31、转基因事件的其他例子包括但不限于mir162（参见wo 07142840）、bt11（参见us6114608（构建体）和wo 8705629（基因））、ga21（参见wo 9704103（基因），wo 9844140（盒））、mir604（参见wo 05103301）、mzir098（参见wo 18231890）、5307（参见wo 10077816）、das40278（参见us 8598413）、tc1507（参见wo 04099447）、das-59122-7（参见wo 06/039376）、nk603（参见us 6825400）、mon810（参见us 6713259）、mon863（参见us 7705216）、mon89034（参见wo 07140256）、mon88017（参见wo 05059103）、dp-4114（参见wo 11084621）和mon87411（参见wo 13169923）。

32、如本文所用，“花粉:载体比率”意指与载体的混合物中存在的花粉的比例。例如而非通过限制的方式，花粉:载体比率为2:1的花粉和载体的混合物包含按重量或体积测量的两份花粉以及按重量或体积测量的一份载体化合物，例如滑石。