一种抗病强的辣椒组培育种方法

本发明涉及辣椒组培育种，具体为一种抗病强的辣椒组培育种方法。

背景技术：

1、辣椒是重要的蔬菜作物，组织培养育种能够利用外植体在无菌条件下完成愈伤组织形成、芽分化、生根和再生植株获得，并可用于辣椒种质扩繁及育种材料获得。现有辣椒组织培养通常以ms基础培养基为基础，通过加入蔗糖、凝固剂及植物生长调节相关组分进行培养，但在外植体诱导培养过程中仍容易出现褐变、氧化损伤及再生状态不稳定等现象，进而影响再生芽形成、生根以及正常再生植株获得，且所得再生植株的抗病表现仍有进一步改善空间。

2、现有培养基制备过程中，各组分通常按照既定配方完成混合、ph调节、灭菌和冷却，但对peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵等组分的加入顺序以及高压蒸汽灭菌后的温度处理缺少进一步控制，容易使培养过程中水杨酸含量和以sio2计的可溶性硅含量发生较快变化，进而影响外植体的褐变程度、h2o2含量、mda含量、ppo活性以及后续再生状态，同时，灭菌结束后直接降温形成固体培养基，也不利于培养基在后续培养过程中维持适宜的水杨酸和可溶性硅含量变化状态。

3、此外，辣椒组培育种过程通常需要依次经历初代培养、诱导培养、恢复培养、生根培养、炼苗处理和移栽，各培养阶段的培养温度、光照时间、黑暗时间、光照强度及培养时间会直接影响外植体成活、愈伤组织形成、芽分化、生根和辣椒再生植株获得，而现有方法中培养基组成、培养基制备方式与各培养阶段之间的配合仍存在不足，难以兼顾外植体较低褐变、较好的再生表现以及所得辣椒再生植株的抗病表现，因此，如何通过培养基组成、培养基制备过程及组培培养条件的协同控制，降低辣椒外植体培养过程中的褐变和氧化损伤，提高再生芽形成、生根及辣椒再生植株获得情况，并改善辣椒再生植株的抗病表现，是本领域需要解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗病强的辣椒组培育种方法，解决了现有辣椒组培过程中外植体易发生褐变和氧化损伤、再生芽形成及生根效果受限、正常再生植株获得率较低、培养基组分与制备过程配合不足以及所得辣椒再生植株抗病表现有待提高的问题。

2、为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供一种抗病强的辣椒组培育种方法，采用如下的技术方案：

4、一种抗病强的辣椒组培育种方法，包括以下步骤：

5、选取辣椒植株材料的子叶作为外植体，对所述外植体进行表面消毒处理，并在无菌条件下将所述外植体接种于初代培养基中进行培养，获得无菌外植体；

6、将所述无菌外植体转接至抗病诱导型固体培养基中进行诱导培养，获得再生芽；

7、将所述再生芽转移至恢复培养基中进行恢复培养，获得恢复培养后的再生芽；

8、将所述恢复培养后的再生芽转移至生根培养基中进行生根培养，获得辣椒组培苗；

9、将所述辣椒组培苗进行炼苗处理，随后将所述辣椒组培苗移栽至栽培基质中继续培养，获得辣椒再生植株；

10、所述抗病诱导型固体培养基包括1×ms基础培养基、质量体积浓度为2.5%～3.5%的蔗糖、质量体积浓度为2.0%～4.0%的peg-4000、质量体积浓度为0.0015%～0.0025%的水杨酸、以sio2计的质量体积浓度为0.010%～0.015%的硅酸钾、质量体积浓度为0.066%～0.396%的硫酸铵和质量体积浓度为0.6%～0.8%的琼脂粉，所述抗病诱导型固体培养基的ph为5.6～5.8。

11、通过采用上述技术方案，在1×ms基础培养基和蔗糖构成的基础培养条件中加入peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵，使所述无菌外植体在诱导培养阶段处于含有peg-4000、水杨酸和硅源的培养环境中。peg-4000与水杨酸共同存在时，能够降低单独加入水杨酸条件下培养过程中h2o2含量、mda含量、ppo活性及外植体褐变率的升高程度；硅酸钾能够为所述抗病诱导型固体培养基提供可溶性硅。

12、peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵按照上述浓度共同存在于所述抗病诱导型固体培养基中，能够使培养过程中水杨酸含量和以sio2计的可溶性硅含量保持相应的变化状态，降低辣椒外植体的褐变程度和氧化损伤程度，并改善芽分化、生根及正常再生植株获得情况。所述辣椒再生植株在接种辣椒炭疽病菌后能够表现出较低的病情指数和发病率，从而获得辣椒炭疽病抗性表现较好的辣椒再生植株。

13、优选的，所述抗病诱导型固体培养基按照以下方法制备：

14、按照最终培养基体积计，加入去离子水，再加入1×ms基础培养基和蔗糖并进行搅拌，得到基础培养液；

15、将所述基础培养液升温并保持恒温，加入peg-4000和水杨酸并进行搅拌，得到培养液；

16、保持所述培养液的温度，向所述培养液中加入作为所述硅酸钾加入形式的硅酸钾水溶液，其中，所述硅酸钾的用量按照所述硅酸钾水溶液所含sio2的质量折算；

17、所述硅酸钾水溶液加入完成后，采用盐酸水溶液对所述培养液进行ph调节；

18、保持所述培养液的温度，向所述培养液中加入硫酸铵并进行搅拌；

19、向加入所述硫酸铵后的培养液中加入去离子水定容，再加入琼脂粉并进行搅拌；

20、将加入所述琼脂粉后的培养液分装至组培容器中，对所述组培容器中的培养液进行高压蒸汽灭菌；

21、高压蒸汽灭菌结束后，将所述组培容器中的培养液降温并进行等温保温，等温保温结束后，将所述组培容器中的培养液置于室温条件下自然冷却，得到所述抗病诱导型固体培养基。

22、通过采用上述技术方案，先在去离子水中加入1×ms基础培养基和蔗糖形成所述基础培养液，再将peg-4000和水杨酸加入所述基础培养液中进行分散，随后加入硅酸钾水溶液并进行ph调节，再加入硫酸铵，使peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵按照确定的先后顺序进入培养液。

23、与将peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵同时加入基础培养液后统一调节ph的方式相比，上述分步加入方式能够使培养过程中水杨酸含量和以sio2计的可溶性硅含量保持不同的变化状态，并与较低的外植体褐变率以及较高的再生、生根和正常再生植株获得指标相对应。高压蒸汽灭菌结束后再进行等温保温，使培养液在自然冷却形成固体培养基之前经历确定的温度保持过程，有利于维持培养过程中水杨酸含量和以sio2计的可溶性硅含量，并改善辣椒外植体后续再生培养状态。

24、优选的，制备所述基础培养液时：

25、按照最终培养基体积计，所述去离子水占最终培养基体积的75%～80%；

26、加入所述1×ms基础培养基和所述蔗糖后的搅拌速度为100～150rpm。

27、通过采用上述技术方案，在占最终培养基体积75%～80%的去离子水中加入1×ms基础培养基和蔗糖，并以100～150rpm进行搅拌，使1×ms基础培养基和蔗糖在后续加入peg-4000、水杨酸、硅酸钾水溶液和硫酸铵之前完成分散，同时为后续加入去离子水定容保留体积调节空间，使培养基中各组分的质量体积浓度按照最终培养基体积进行控制。

28、优选的，向所述基础培养液中加入所述peg-4000和所述水杨酸时：

29、将所述基础培养液升温至45～55℃并保持恒温；

30、加入所述peg-4000和所述水杨酸后，在150～200rpm条件下持续搅拌25～35min。

31、通过采用上述技术方案，在45～55℃条件下向所述基础培养液中加入peg-4000和水杨酸，并在150～200rpm条件下持续搅拌25～35min，使peg-4000和水杨酸在加入硅酸钾水溶液之前完成分散。peg-4000与水杨酸共同存在于培养液中时，能够降低培养过程中辣椒外植体的h2o2含量、mda含量、ppo活性和褐变程度，从而减轻辣椒外植体在培养过程中的氧化损伤。

32、优选的，向所述培养液中加入所述硅酸钾水溶液并进行ph调节时：

33、加入所述硅酸钾水溶液时，所述培养液的温度保持为45～55℃；

34、所述硅酸钾水溶液的加入时间为5～10min；

35、所述硅酸钾水溶液加入完成后，采用1mol/l盐酸水溶液对所述培养液进行ph调节，ph调节时间为10～15min。

36、通过采用上述技术方案，在45～55℃条件下将所述硅酸钾水溶液在5～10min内加入所述培养液，并在所述硅酸钾水溶液加入完成后采用1mol/l盐酸水溶液对所述培养液进行ph调节，使硅酸钾的加入与培养液ph调节按照确定的先后顺序进行。硅酸钾为所述培养液提供可溶性硅来源，使所得抗病诱导型固体培养基在培养过程中保持相应的以sio2计的可溶性硅含量，并与辣椒外植体的再生及正常再生植株获得情况相对应。

37、优选的，向所述培养液中加入所述硫酸铵时：

38、所述培养液的温度保持为45～55℃；

39、加入所述硫酸铵后，将搅拌速度调整至100～150rpm，继续搅拌12～18min。

40、通过采用上述技术方案，在完成peg-4000、水杨酸和硅酸钾加入以及ph调节后，在45～55℃条件下向所述培养液中加入硫酸铵，并以100～150rpm继续搅拌12～18min，使硫酸铵在所述培养液中充分分散，并使硫酸铵在完成硅酸钾加入及ph调节之后进入所述培养液，从而保持培养基组分的既定加入顺序。

41、优选的，加入所述琼脂粉、进行所述高压蒸汽灭菌和进行所述等温保温时：

42、向加入所述硫酸铵后的培养液中加入去离子水定容，再加入所述琼脂粉，加入所述琼脂粉后的搅拌速度为100～150rpm；

43、对分装至所述组培容器中的培养液进行所述高压蒸汽灭菌时，所述高压蒸汽灭菌的温度为121℃、压力为0.1mpa、时间为20～25min；

44、所述高压蒸汽灭菌结束后，将所述组培容器中的培养液降温至68～72℃，并在68～72℃条件下进行等温保温45～60min。

45、通过采用上述技术方案，在完成硫酸铵加入后采用去离子水定容，再加入琼脂粉并进行搅拌，使培养基中各组分达到按照最终培养基体积确定的浓度，并形成能够在冷却后凝胶化的培养液。将所述培养液在121℃、0.1mpa条件下进行20～25min高压蒸汽灭菌，灭菌结束后将所述培养液降温至68～72℃并等温保温45～60min，使所述培养液在自然冷却形成固体培养基之前经过确定的温度保持过程。

46、与高压蒸汽灭菌后直接降温至室温相比，进行上述等温保温能够使培养过程中水杨酸含量和以sio2计的可溶性硅含量保持不同的变化状态，并与较高的正常再生植株获得率相对应。

47、优选的，选取所述辣椒植株材料的子叶作为所述外植体并将所述外植体接种于所述初代培养基中时：

48、选取所述辣椒植株材料的子叶作为所述外植体时，所述外植体的长度为8～12mm；

49、在无菌条件下将所述外植体接种于所述初代培养基中时，所述外植体的接种数量为30个。

50、通过采用上述技术方案，将所述外植体的长度控制为8～12mm，并按照30个外植体进行接种，使进入初代培养和后续诱导培养的辣椒外植体具有相应的组织尺寸和接种数量。经表面消毒处理和初代培养后获得所述无菌外植体，为后续转接至所述抗病诱导型固体培养基进行诱导培养提供无菌植物组织材料。

51、优选的，将所述无菌外植体转接至所述抗病诱导型固体培养基中进行所述诱导培养时：

52、将所述无菌外植体转接至所述抗病诱导型固体培养基中进行所述诱导培养，培养温度为23～27℃，每日光照时间为14～16h，黑暗时间为8～10h，且每日所述光照时间和所述黑暗时间和为24h，光照强度为2000～3000lx，培养时间为14～28d。

53、通过采用上述技术方案，将所述无菌外植体在23～27℃、每日光照14～16h、黑暗8～10h、光照强度2000～3000lx的条件下，在所述抗病诱导型固体培养基中培养14～28d，使所述无菌外植体在所述抗病诱导型固体培养基提供的培养环境中完成愈伤组织形成和芽分化并获得再生芽，同时保持相应的外植体成活状态，为后续恢复培养和生根培养提供再生材料。

54、优选的，对所述再生芽进行所述恢复培养、对所述恢复培养后的再生芽进行所述生根培养以及对所述辣椒组培苗进行所述炼苗处理时：

55、将所述再生芽转移至所述恢复培养基中进行所述恢复培养时，恢复培养温度为23～27℃，每日光照时间为14～16h，黑暗时间为8～10h，且每日所述光照时间和所述黑暗时间和为24h，培养时间为10～20d；

56、将所述恢复培养后的再生芽转移至所述生根培养基中进行所述生根培养时，生根培养温度为23～27℃，每日光照时间为14～16h，黑暗时间为8～10h，培养时间为15～25d；

57、将所述辣椒组培苗进行所述炼苗处理时，炼苗温度为23～27℃，炼苗时间为5～10d。

58、通过采用上述技术方案，将所述再生芽依次进行恢复培养和生根培养，使经过诱导培养的所述再生芽继续生长并形成完整根系，获得所述辣椒组培苗；随后对所述辣椒组培苗进行炼苗处理，并将完成炼苗处理的所述辣椒组培苗移栽至栽培基质中继续培养，使所述辣椒组培苗完成由组织培养条件向栽培条件的过渡，获得所述辣椒再生植株。

59、通过诱导培养、恢复培养、生根培养、炼苗处理和移栽依次进行，使辣椒外植体完成由无菌外植体至辣椒再生植株的连续培养过程，并使所得辣椒再生植株具有较好的辣椒炭疽病抗性表现。

60、本发明提供了一种抗病强的辣椒组培育种方法。具备以下有益效果：

61、1、本发明通过在抗病诱导型固体培养基中加入1×ms基础培养基、蔗糖、peg-4000、水杨酸、硅酸钾、硫酸铵和琼脂粉，并控制ph，使外植体在诱导培养过程中降低褐变，促进再生芽形成和生根培养，并提高辣椒组培苗获得、辣椒再生植株获得情况及抗病效果。

62、2、本发明通过按顺序加入1×ms基础培养基、蔗糖、peg-4000、水杨酸、硅酸钾水溶液、硫酸铵和琼脂粉，并在高压蒸汽灭菌结束后进行等温保温，使peg-4000、水杨酸、硅酸钾和硫酸铵依次进入培养液，降低外植体褐变，改善再生芽形成、生根培养及辣椒再生植株获得情况。

63、3、本发明通过选取辣椒植株材料的子叶作为外植体，并依次进行初代培养、诱导培养、恢复培养、生根培养和炼苗处理，控制各培养阶段的温度、光照时间、黑暗时间及培养时间，使外植体完成再生芽形成、辣椒组培苗获得以及移栽至栽培基质中继续培养的过程，并提高辣椒再生植株获得情况。