一种线照明调制多色成像系统

1.本发明涉及多色成像技术领域，特别涉及一种线照明调制多色成像系统。


背景技术：

2.使用不同颜色的荧光团选择性标记生物组织中的不同结构，并利用多色显微成像技术同时获取多色荧光信号，能够更好地解析生物组织中细胞、细胞器与分子之间的空间关系和相互作用。
3.目前的多色成像方法通常利用二向色镜将各个通道的信号在空间上进行分离，并传递到不同的黑白相机上进行探测，但这种方法存在一些问题：对于发射谱相互重叠的荧光团，通过二向色镜无法完全分离不同通道的荧光信号，因此会存在通道间的串扰；采用多个黑白相机进行探测，各个通道的图像在横向上存在偏移，在轴向上存在探测焦面的差异，因此需要对原始图像进行复杂的配准处理；每个通道都需要一个单独的黑白相机，受限于系统的体积大小和复杂程度，多色成像的通道数量受到限制；系统的制作成本随着黑白相机的数量增多而升高。


技术实现要素：

4.为了克服现有多色成像方法存在的问题，本发明实施例提供了一种线照明调制多色成像系统。所述技术方案如下：
5.线照明调制多色成像系统包括：
6.线照明调制模块，包括m个单色光源和调制光路，每个所述单色光源发出的光束的波长不同；每个所述光束经过所述调制光路形成一个在物镜焦面上聚焦的线光斑，所述线光斑在所述物镜焦面上照明强度在第一方向上呈高斯分布，所述第一方向与所述线光斑的延伸方向垂直，每个所述线光斑的位置参数不同，m个通道的所述线光斑叠加形成m色线照明光，所述m≥2，且为正整数；
7.成像模块，用于采用具有n行像素的多元探测器沿第一方向连续扫描成像，获得至少m张在所述m色线照明光照射下的混合图像，每张所述混合图像对应一行像素，每张所述混合图像包含m个通道的信号，所述n≥m，且为正整数；
8.图像解调模块，用于利用频域解调算法或空域解调算法，从所述混合图像中解调出单色图像，所述单色图像对应一个通道的信号。
9.进一步地，所述调制光路包括用于将光束整形成线光束的整形光路，用于调节每个线光斑的位置参数的位置调节光路，以及用于将所述线光斑叠加形成m色线照明光的投影光路。
10.进一步地，所述整形光路包括用于将m个光源合束的第一二向色镜组，以及沿合束后光束传递方向依次设置的第一扩束镜、第二扩束镜和柱透镜，所述第一二向色镜组包括m-1个二向色镜。
11.进一步地，所述位置调节光路位于所述第二扩束镜和所述柱透镜之间，包括第二
二色镜组、第三二色镜组、第一反射镜和第二反射镜，所述第二二色镜组包含m-1个二向色镜，所述第三二色镜组包含m-1个二向色镜，光束每经过所述第二二向色镜组中的一个二向色镜分离出一条光路，分离出的光路经过所述第三二向色镜组中的对应二向色镜进行合束，通过所述第二二色镜组后的剩余光束经由所述第一反射镜、所述第二反射镜进入所述第三二色镜组进行合束。
12.进一步地，所述位置调节光路还包括设置在所述第三二色镜组和所述柱透镜之间光路上的第三反射镜和第四反射镜。
13.进一步地，每个所述线光斑的位置参数之间间距大于或等于所述多元探测器单个像素在物空间对应的宽度。
14.进一步地，所述成像模块包括：
15.扫描单元，用于采用具有n行像素的多元探测器沿第一方向连续扫描成像，所述n≥m；
16.图像块获取单元，获取按时间顺序所得的一个样本的每帧图像中的第i个像素行的条带图像块；
17.拼接单元，将一个样本的每帧图像中的第i个像素行的条带图像块依次拼接获得第i像素行的混合图像，i∈n；重复至少m次，获得m张混合图像。
18.进一步地，所述图像解调模块用于利用频域解调算法从m张所述混合图像中解调出m张单色图像，每个所述单色图像对应一个通道的信号，具体包括：
19.傅里叶变换单元，用于对m张所述混合图像的原始空间域图像进行傅里叶变换，得到m张混合频域图像；
20.第一解调单元，用于结合相应像素行的有效光学传递函数作为其解调系数，对m张所述混合频域图像进行线性消元运算，解调出m张单色频域图像，每个所述单色频域图像包含一个通道的信号；
21.傅里叶反变换单元，用于对m张单色频域图像进行傅里叶反变换，得到m张单色图像。
22.进一步地，所述图像解调模块用于利用空域解调算法从m张所述混合图像中通过平移对齐和线性消元运算，依次消去m-1个非目标通道的信号解调出1张单色图像，所述单色图像对应一个目标通道的信号。
23.进一步地，所述图像解调模块包括：
24.第一循环控制单元，用于将通道计数器k的数值置1，并重复执行第二解调单元，每执行一次控制通道计数器数值加1，直至通道计数器k的数值等于m-1；
25.第二解调单元，用于将图像计数器p的数值置1，并通过以下子模块重复执行直至图像计数器的数值等于m-k；
26.平移子单元，用于将混合图像ik平移，使其与混合图像i
k p
中的k通道的信号基本重叠；
27.消元子单元，用于对混合图像ik与混合图像i
k p
进行线性消元运算，消除混合图像i
k p
中的k通道的信号，并仍然记为i
k p
；
28.计数子单元，用于图像计数器p的数值加1。
29.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果至少包括：
30.本发明实施例提供的线照明调制多色成像系统采用单个多元探测器进行扫描成像，相比需要使用多个相机的成像方法，降低了系统成本和复杂度，同时，采用多个像素行进行探测成像，各个通道间的图像为天然配准关系，无需进行额外的配准处理，实现了多通道的多色成像。在荧光成像中，本线照明调制多色成像系统利用不同波长的照明光差异性激发不同种颜色的荧光信号，避免了发射谱串扰的问题。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是本发明线照明调制多色成像系统的功能模块图；
33.图2是本发明的线照明调制多色成像的光路结构示意图；
34.图3是本发明的另一种线照明调制多色成像的光路结构示意图；
35.图4是本发明的线照明光分布示意图；
36.图5是本发明的样本成像采集过程示意图；
37.图6是本发明的一种图像解调模块的功能模块图；
38.图7是本发明的多通道信号的频域解调算法流程图；
39.图8是本发明的另一种图像解调模块的功能模块图；
40.图9是本发明的多通道信号的空域解调算法流程图。
具体实施方式
41.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
42.如图1所示，本发明实施例提供了一种线照明调制多色成像系统，包括线照明调制模块10、成像模块20和图像解调模块30。
43.线照明调制模块10包括m个(m≥2，m为正整数)单色光源和调制光路，每个单色光源发出的光束的波长不同，每个光束经过调制光路形成在物镜焦平面上聚焦的线光斑，并且该线光斑在物镜焦面上照明强度在第一方向上呈高斯分布，第一方向与所述线光斑的延伸方向垂直。不同激光光束被调制后形成的线光斑的位置参数不同，m个通道的线光斑叠加形成m色线照明光。
44.成像模块20用于采用具有n行像素的多元探测器沿第一方向连续扫描成像，获得至少m张在所述m色线照明光照射下的混合图像，每张所述混合图像对应一行像素，每张所述混合图像包含m个通道的信号，所述n≥m，且为正整数。
45.图像解调模块30，用于利用频域解调算法或空域解调算法，从混合图像中解调出单色图像，每张单色图像对应一个通道的信号。
46.本发明实施例提供的线照明调制多色成像系统。采用单个多元探测器进行扫描成
像，相比需要使用多个相机的成像方法，降低了系统成本和复杂度，同时，采用多个像素行进行探测成像，各个通道间的图像为天然配准关系，无需进行额外的配准处理，实现了多通道的多色成像。在荧光成像中，本线照明调制多色成像系统利用不同波长的照明光差异性激发不同种颜色的荧光信号，避免了发射谱串扰的问题。
47.需要说明的是，本线照明调制多色成像系统中的单色光源指的是波长一定的光源，既可以是单色激光光源，也可以是单色led(light-emitting diode，发光二极管)光源，还可以是宽谱光源配合窄波滤波片获得的单色光源。另外，本线照明调制多色成像系统可以适用于荧光显微成像，也可以适用于非荧光显微成像(即照明波长与探测波长相同)的多种场景，本技术不对此进行限制。
48.进一步地，调制光路包括用于将激光光束整形成线光束的整形光路、用于调节每个线光斑位置参数的位置调节光路、用于将线光斑叠加形成m色线照明光的投影光路。
49.参照图2，为本技术的线照明调制多色成像在荧光显微成像中的光路结构，整形光路包括用于将m个激光光源合束的第一二向色镜组3.1、3.2、
……
、3.(m-1)，以及沿合束后光束传递方向依次设置的第一扩束镜4、第二扩束镜5和柱透镜12。位置调节光路位于第二扩束镜5和柱透镜12之间，包括第二二色镜组6.1、6.2、
……
、6.(m-1)、第三二色镜组7.1、7.2、
……
、7.(m-1)、第一反射镜8和第二反射镜9，光束每经过第二二向色镜组中的一个二向色镜分离出一条光路，分离出的光路经过第三二向色镜组中的对应二向色镜进行合束，通过第二二色镜组后的剩余光束经由第一反射镜8、第二反射镜9进入第三二色镜组进行合束。投影光路包括照明筒镜13、物镜14和第四二色镜17(在非荧光成像中，需更换为半反半透分束器或偏振分束器和四分之一玻片组成的联合器件,或其它可实现既可以反射照明光又可以透射与照明光波长相同的探测光的器件)，用于将所述线光斑叠加形成多色线照明光。线照明调制多色成像系统还包括成像光路，具体包括物镜14、第四二色镜17、发射滤光片18(在非荧光成像中，不需要该器件)、探测筒镜19和多元探测器20。
50.具体地，第一二向色镜组3.1、3.2、
……
、3.(m-1)沿激光光束传递方向布置，第二激光光源2.1、第三激光光源2.2、
……
、第m激光光源2.(m-1)发出的激光光束通过第一二向色镜组中的一个二向色镜汇入第一激光光源1发出的激光光束形成合束光，并由第一扩束镜4和第二扩束镜5进行扩束，接着利用第二二色镜组6.1、6.2、
……
、6.(m-1)将不同通道的照明光束彼此分离并分别进入不同的光路，光束经过第二二色镜6.1分离出的光路经过第三二色镜7.1后进行合束，通过第二二色镜6.1后的剩余光束经过第二二色镜6.2再次分离，分离出的光路经过第三二色镜7.2、7.1后进行合束，通过第二二色镜6.2后的剩余光束经过第二二色镜6.3再次分离，分离出的光路经过第三二色镜7.3、7.2、7.1后进行合束，以此类推，光束通过第二二色镜6.(m-1)被分离出的光路通过第三二色镜7.(m-1)、
……
、7.2、7.1后进行合束，剩余光束经由第一反射镜8、第二反射镜9进入第三二色镜7.(m-1)、
……
、7.2、7.1进行合束。合束后的光束通过柱透镜12整形为线光束，并经由照明筒镜13、第四二色镜17和物镜14，将线光束投射到物镜焦平面上，用于激发电动平移台16上样本15的荧光信号，荧光信号依次经过物镜14、第四二色镜17、发射滤光片18和探测筒镜19，最终被多元探测器20接收进行成像。
51.在一些实施例中，位置调节光路还包括设置在第三二色镜组7和柱透镜12之间的第三反射镜10和第四反射镜11。
52.具体地，可以通过调节位置调节光路中的第二二色镜组6、第三二色镜组7、第一反射镜8和第二反射镜9中任意一个或多个的角度，对从被调节器件上反射的线光斑在x方向位置进行调节，也可以调节第三反射镜10或第四反射镜11的角度，对所有通道的线光斑在x方向位置进行同时调节。优选地，每个线光斑的位置参数之间间距大于或等于多元探测器单个像素在物空间对应的宽度。
53.在另一些实施例中，调制光路可由不同发射波长的线状led直接生成不同波长的线光束，然后在经过投影光路投射到物镜焦面。通过调节不同线状led的位置即可改变物镜焦面线光斑的位置参数。
54.每个激光光源发出的激光光束的波长不同，每个激光光束经过调制光路在物镜焦面上聚焦的线光斑的位置参数不同，通过位置调节光路的精确调节，可以使m个通道上的线光斑在x方向存在一定的错位，达到分离不同通道线光斑在x方向位置的目的。
55.为了更好地理解本技术，下面以两个激光光源的情况为例，介绍本技术的一种线照明调制多色成像在荧光显微成像中的光路结构，如图3所示，该光路结构中只有2个激光光源，因此整形光路中用于将激光光束进行合束的第一二向色镜组中只有一个二向色镜，位置调节光路中的第二二色镜组和第三二色镜组也只需一个二向色镜。
56.具体地，第一激光光源1、第二激光光源2两个通道的激光光源发出的激光光束首先通过第一二向色镜3进行合束，并由第一扩束镜4和第二扩束镜5进行扩束，接着利用第二二色镜6将不同通道的照明光束彼此分离并分别进入两条光路，一条光路经过第二二色镜6和第三二色镜7，另一条光路依次经过第二二色镜6、第一反射镜8、第二反射镜9和第三二色镜7，然后通过第三二色镜7将两条光路的照明光束再次合束，最后通过柱透镜12将合束后的照明光束整形为线光束，并经由照明筒镜13、第四二色镜17和物镜14，将线光束投射到物镜焦平面上，用于激发电动平移台16上样本15的荧光信号，荧光信号依次经过物镜14、第四二色镜17、发射滤光片18和探测筒镜19，最终被多元探测器20接收进行成像。
57.图4为本发明的线照明光束分布示意图。在一些实施例中，如图4所示，线光斑的延伸方向为y方向，第一方向为与线光斑的延伸方向垂直的x方向。多元探测器的成像区域为沿x方向布置的n个像素行，两个通道的线照明光的照明强度均在x方向上成高斯分布，两个通道的线光斑的位置参数之间间距为1个像素。
58.本实施例中的多元探测器可以是具有sub-array(子阵列)或roi(region of interest，感兴趣区)功能的面阵ccd(charge-coupled device，电荷耦合元件)或面阵cmos(complementary metal oxide semiconductor，互补金属氧化物半导体)相机，也可采用具有面阵模式功能的线阵ccd或线阵cmos相机。
59.进一步地，参照图1，成像模块20包括：
60.扫描单元201，用于采用具有n行像素的多元探测器沿第一方向连续扫描成像，所述n大于等于m；
61.图像块获取单元202，获取按时间顺序所得的一个样本的每帧图像中的第i行像素的条带图像块；
62.拼接单元203，将一个样本的每帧图像中的第i行像素的条带图像块依次拼接获得第i行像素的混合图像，i∈n。
63.图5为本发明的样本成像采集过程示意图，下面结合图5对成像模块20的功能进行
介绍。为了便于后续的图像解调，本实施例中相机的成像区域为沿x方向布置的n个像素行，样本的运动方向也沿x方向，从而便于样本在不同像素下分别扫描成像，实现m通道的多色成像，拓宽多色成像的通道数量。
64.参照图5(a)，在成像采集过程中，扫描单元201采用具有n行像素的多元探测器沿x方向连续扫描成像。具体地，电动平移台16带动样本15沿着x方向匀速运动，且相机的单帧曝光时间与样本移动一个像素在物空间对应宽度的时间相等。若设定任意一像素行在一帧图像中对应的图像为一个条带图像块，则该像素行在多帧图像中对应的多个条带图像块为该样本的各个部分的依次连续成像。
65.参照图5(b)，对这些按时间顺序所得的连续成像得到的条带图像块进行拼接，即可得到每一像素行对应的混合图像，每张混合图像中包含m个通道的荧光信号。具体地，从n个像素行中选取第i行像素行，图像块获取单元202获取按时间顺序所得的一个样本的每帧图像中的第i行像素的条带图像块。拼接单元203将一个样本的每帧图像中的第i行像素的条带图像块依次拼接获得第i行像素的混合图像。选取不同的像素行，重复至少m次，获得m张不同像素行的混合图像。
66.以下主要说明荧光成像情况下的解调原理与解调过程。非荧光成像解调原理与解调过程与荧光成像的解调原理与解调过程基本相同，主要区别仅是探测波长的不同，致使系统有效psf有细微不同，可以忽略不计，仍适用此方法。
67.与线扫描共聚焦显微镜的成像原理类似，本方法中每一像素行对应的混合图像为系统的有效psf(point spread function，点扩散函数)和样本上荧光信号分布的卷积，其中，系统的有效psf为照明系统psf和探测系统psf的乘积。
68.以单个通道的荧光信号为例，第j个通道在第i像素行的有效psf为：
[0069][0070]
其中，表示照明系统psf，表示探测系统psf，i表示成像区域上各个像素行的序号，且i∈n，j表示荧光蛋白的种类序号，也表示通道序号，x和y代表物空间的横向坐标，其方向如图2、3所示，x方向为样本的运动方向，y方向为与样本运动方向垂直的方向，b
i,j
表示第i像素行与第j通道线光斑位置参数之间的距离。
[0071]
因此，第i像素行对应得到混合图像中所包含的第j个通道的信号可表示为
[0072][0073]
其中，fj(x,y)表示样本上第j种荧光蛋白的相对浓度分布，“*”表示卷积运算。从公式(2)可以看出，样本的荧光信号受到照明系统psf和探测系统psf的共同调制，而相机每一个像素的探测系统psf是相同的，所以线照明调制模块调制的差异性主要体现在照明系统psf上。
[0074]
在多色照明下，混合图像包含了m个通道荧光信号。由于不同通道的线光斑存在错位，对于同一像素行，不同通道的样本荧光信号受到的线照明调制不同，第i像素行的混合图像可以表示为：
[0075]ii
(x,y)＝h
i,1
(x,y)*f1(x,y) h
i,2
(x,y)*f2(x,y) (3)
[0076]
类似地，第i 1像素行的混合图像可以表示为：
[0077]ii 1
(x,y)＝h
i 1,1
(x,y)*f1(x,y) h
i 1,2
(x,y)*f2(x,y) (4)
[0078]
基于以上原理，通过频域解调算法和空域解调算法对混合图像进行处理，即可从m张混合图像中解调出m张单色图像，每个单色图像对应一个通道荧光信号，每个单色图像对应的通道均不相同。
[0079]
在一些实施例中，采用频域解调算法，以光学传递函数为其调制系数，在频域对混合图像进行线性消元运算，从中解调出单色图像。参照图6，图像解调模块30包括：
[0080]
傅里叶变换单元301，用于对m张所述混合图像的原始空间域图像进行傅里叶变换，得到m张混合频域图像；
[0081]
第一解调单元302，用于结合相应像素行的有效光学传递函数作为其解调系数，对m张所述混合频域图像进行线性消元运算，解调出m张单色频域图像，每个所述单色频域图像包含一个通道的荧光信号；
[0082]
傅里叶反变换单元303，用于对m张单色频域图像进行傅里叶反变换，得到m张单色图像。
[0083]
如图7所示，为多通道荧光信号的频域解调算法流程，具体包括：
[0084]
首先通过傅里叶变换单元301，对m张混合图像的原始空间域图像进行傅里叶变换，得到m张混合频域图像，然后通过第一解调单元302，结合相应像素行的有效光学传递函数作为其解调系数，对m张混合频域图像进行线性消元运算，解调出m张单色频域图像，该单色频域图像包含一个通道的荧光信号，最后通过傅里叶反变换单元303对m张单色频域图像进行傅里叶反变换，得到m张单色图像，每个单色图像包含一个通道的荧光信号。
[0085]
在另一些实施例中，也可选取s(n≥s＞m)张混合图像用于解调m个通道的单色图像。具体来说，先从s张里选取第1至第m张混合图像(记为第1组混合图像)，按照上述频域解调算法流程，解调出第1组m个通道的单色图像，然后将s张混合图像中的第m 1张图像替换第1组图像中的任意1张图像，并记为第2组混合图像，接着按照上述频域解调算法流程，解调出第2组m个通道的单色图像，接下来用s张混合图像中的第m 2张图像替换第2组图像中任意1张图
……
如此循环，直至解调出第s-m 1组m个通道的单色图像。最后将解调出的s-m 1组图像中相同通道序号的图像加起来，即可得到信噪比更高的m个通道的单色图像。
[0086]
下面以两个通道的情况为例具体说明。对公式(3)和公式(4)的空间域图像做傅里叶变换，可得第i像素行和第i 1像素行的混合图像的频域图像分别为：
[0087]
oi(u,v)＝h
i,1
(u,v)
×
f1(u,v) h
i,2
(u,v)
×
f2(u,v) (5)
[0088]oi 1
(u,v)＝h
i 1,1
(u,v)
×
f1(u,v) h
i 1,2
(u,v)
×
f2(u,v) (6)
[0089]
其中h
i,1
(u,v)、h
i 1,1
(u,v)、h
i,2
(u,v)、h
i 1,2
(u,v)、f1(u,v)和f2(u,v)分别表示h
i,1
(x,y)、h
i 1,1
(x,y)、h
i,2
(x,y)、h
i 1,2
(x,y)、f1(x,y)和f2(x,y)的傅里叶变换结果，h
i,1
(u,v)、h
i 1,1
(u,v)、h
i,2
(u,v)和h
i 1,2
(u,v)可通过理论仿真得到或者实验测得。
[0090]
可选地，可以采用理论仿真方式，具体为：通过公式(1)结合psf理论表达式以及实际系统的相关参数计算得到h
i,1
(x,y)、h
i 1,1
(x,y)、h
i,2
(x,y)和h
i 1,2
(x,y)，然后对它们分别做傅里叶变换即可。
[0091]
可选地，可以采用实验测得方式，具体为：测量不同通道在不同像素行的有效psfh
i,1
(x,y)、h
i 1,1
(x,y)、h
i,2
(x,y)和h
i 1,2
(x,y)，然后对它们分别做傅里叶变换即可。
[0092]
因此，在公式(5)和公式(6)中，只有f1(u,v)和f2(u,v)两个未知量，通过对上述混合频域图像进行线性消元运算，即可解调出通道1和通道2的单色频域图像。具体地，包括：
[0093][0094][0095]
进一步地，对单色频域图像f1(u,v)和f2(u,v)傅里叶反变换，即可解调出通道1和通道2的单色图像。
[0096]
同理可得，当通道数m》2时，仿照公式(5)和公式(6)，可列出m个线性方程，每个方程中含有m个未知量，通过求解这m个线性方程，即可解调出m个通道的单色图像。
[0097]
在另一些实施例中，还可以采用空域解调算法。空域解调算法是一种近似解调算法，以照明光强为其调制系数，在空域对混合图像进行线性消元运算，最终实现多色解调。在公式(1)中，由成高斯分布的照明psf和探测psf相乘得到的有效psf依然可近似看做高斯分布，且其强度随偏离中心的距离增加而迅速衰减，因此可以只考虑有效psf中心区域对成像的贡献，忽略有效psf周围区域的强度值，则有效psf可近似表示为冲激函数。另外，由于照明psf与探测psf之间存在一定位移，导致有效psf中心不再固定于原点，会产生一定位移，其位移方向和大小随照明psf与探测psf之间的位移方向和大小变化而变化。
[0098]
以通道1在第i个像素行的有效psf为例，其可表示为：
[0099][0100]
其中，表示该有效psf强度最大值对应的x方向坐标，δ(x,y)表示单位冲激函数。
[0101]
同理可得：
[0102][0103][0104][0105]
令
[0106][0107][0108][0109][0110]
将公式(9)-公式(16)带入公式(3)和公式(4)，即可得：
[0111][0112]
[0113]
其中l
i,1
、l
i,2
、l
i 1,1
、l
i 1,2
和可以通过仿真或者实验测得。
[0114]
可选地，可以采用仿真方式，具体为：通过公式(1)结合psf理论表达式以及系统的相关参数计算得到各有效psfh
i,1
(x,y)、h
i 1,1
(x,y)、h
i,2
(x,y)和h
i 1,2
(x,y)，各有效psf中心最强点强度值即为l
i,1
、l
i,2
、l
i 1,1
、l
i 1,2
，各有效psf中心最强点相对于原点的位移即为，各有效psf中心最强点相对于原点的位移即为
[0115]
可选地，可以采用实验测得，具体为：单独开启通道1的光源，将样本沿x方向扫描，相机第i像素行和第i 1像素行各采集一张样本图像，计算这两张图像沿x轴的距离，即为并计算两张图像之间的平均灰度值的比值，即为l
i,1
/l
i 1,1
。仿照上述测量过程，也可测得和l
i,2
/l
i 1,2
，由于与与可通过平移变换成相同的变量，相互等价。因此，在公式(17)和公式(18)中等效为只有两个未知变量，通过对混合图像进行平移变换和线性消元，即可消去其中一个通道的信号，解调出只包含单个通道信号的单色图像。
[0116]
基于以上原理，在实现时，采用空域解调算法从m张混合图像中通过平移对齐和线性消元运算，依次消除m-1个非目标通道的荧光信号，从而解调出仅对应一个目标通道的1张单色图像。
[0117]
具体地，参照图8，图像解调模块30包括：
[0118]
第一循环控制单元304，用于将通道计数器k的数值置1，并重复执行第二解调单元，每执行一次控制通道计数器数值加1，直至通道计数器k的数值等于m-1；
[0119]
第二解调单元305，用于将图像计数器p的数值置1，并通过以下子模块重复执行直至图像计数器的数值等于m-k；
[0120]
平移子单元3051，用于将混合图像ik平移，使其与混合图像i
k p
中的k通道的荧光信号基本重叠；
[0121]
消元子单元3052，用于对混合图像ik与混合图像i
k p
进行线性消元运算，消除混合图像i
k p
中的k通道的荧光信号；
[0122]
计数子单元3053，用于图像计数器p的数值加1。
[0123]
如图9所示，为本发明多通道荧光信号的空域解调算法流程。具体过程为：
[0124]
将通道计数器k的数值置1，图像计数器p的数值置1，平移第1像素行对应的混合图像，使其中的第1通道的荧光信号与第2像素行对应的混合图像中的第1通道的荧光信号基本重叠，对两张混合图像进行线性消元运算，消除第2像素行对应的混合图像中的第1通道的荧光信号，并仍然将其记为第2像素行对应的混合图像。此时，将图像计数器p的数值加1。然后再次平移第1像素行对应的混合图像，使其中的第1通道的荧光信号与第3像素行对应的混合图像中的第1通道的荧光信号基本重叠，再次进行线性消元运算，消除第3像素行对应的混合图像中的第1通道的荧光信号，并仍然将其记为第3像素行对应的混合图像。此时，将图像计数器p的数值再加1。不断重复上述步骤，直至图像计数器p的数值等于m-1，完成第1像素行对应的混合图像与第m张混合图像的线性消元运算，得到m-1张消除了第1通道的荧光信号的混合图像。
[0125]
进一步地，将通道计数器k数值加1，并重置图像计数器p的数值为1，重复以上步
骤，进行包含第2通道的荧光信号的混合图像的平移变换和线性消元运算，直至图像计数器p的数值等于m-2，得到m-2张消除了第1通道荧光信号和第2通道荧光信号的混合图像。
[0126]
再次执行通道计数器k数值加1、重置图像计数器p的数值为1的步骤，并重复进行上述混合图像平移变换和线性消元运算的过程，直至图像计数器p的数值等于m-k。
[0127]
不断重复上述步骤，直至通道计数器k的数值等于m-1，最终得到1张仅包含第m通道荧光信号的单色图像。
[0128]
这里m个通道序号是人为定义的，即m种荧光蛋白中任意一种都可当做第m通道。所以可根据解调的目标荧光蛋白的不同，调整每种荧光蛋白的通道序号，并将解调的目标荧光蛋白当做第m通道，然后按照上述解调过程解调。
[0129]
基于以上办法，通过对不同混合图像的选择，可以消去不同的非目标通道荧光信号，从而可以获得仅包含任一目标通道荧光信号的单色图像。
[0130]
在另一些实施例中，也可选取s(n≥s＞m)张混合图像用于解调m个通道的单色图像。具体来说，先从s张里选取第1至第m张混合图像(记为第1组混合图像)，按照上述空域解调算法流程，解调出第1组m个通道的单色图像，然后将s张混合图像中的第m 1张图像替换第1组图像中的任意1张图像，并记为第2组混合图像，接着按照上述空域解调算法流程，解调出第2组m个通道的单色图像，接下来用s张混合图像中的第m 2张图像替换第2组图像中任意1张图
……
如此循环，直至解调出第s-m 1组m个通道的单色图像。最后将解调出的s-m 1组图像中相同通道序号的图像加起来，即可得到信噪比更高的m个通道的单色图像。
[0131]
同样地，以两个通道的情况为例，只包含通道1和通道2单个通道信号的图像g1(x,y)和g2(x,y)，可以表示为：
[0132][0133][0134]
其中，在公式(19)中和之间可以通过沿x方向的平移实现相互转换，平移距离为：
[0135][0136]
由于和符号相同、数值很小且接近，故d值接近于0，因此可忽略和之间的错位，即可认为：
[0137][0138]
同理有
[0139][0140]
进一步，将公式(22)和公式(23)代入到公式(19)和公式(20)中，可得：
[0141][0142][0143]
由此可见，解调结果gj(x,y)与原始荧光信号fj(x,y)之间除了有一定的位移以外，只相差一个常数系数因子，而常数系数因子只会改变图像的整体灰度值，所以可认为解调结果gj(x,y)即为样本上各通道信号的实际分布结果。
[0144]
在单个相机上实现同步的多色成像，各个通道间的图像为天然配准关系，无需进行额外的配准处理，只需通过解调算法对混合图像进行处理，即可得到包含单个通道荧光信号的单色图像，极大降低了系统的复杂度。
[0145]
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。