一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法与流程

1.本发明涉及一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，属于脐带间充质干细胞保存和运输技术领域。


背景技术：

2.间充质干细胞，是一类具有自我更新，在一定条件下具有多向分化潜能的多能干细胞；脐带来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的全部特性，而且其具有来源更加广泛、获取容易、不涉及伦理等优势，现在已广泛应用到临床试验阶段；脐带间充质干细胞在临床移植治疗中，不能将新鲜分离的干细胞直接输注于人体内，它需要先存放在可以输注的保存液(如0.9％氯化钠注射液)中一定时间，再输注入体内，目前临床常用的保存液有0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液，1％人血白蛋白液等，但脐带间充质干细胞在这些保存液中活性会下降，影响临床的治疗效果，需要一种能够保持较高细胞活率、易于操作、低成本的适合实验研究和临床应用的脐带间充质干细胞保存液。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，具使在运输途中脐带间充质干细胞处于悬浮状态，在运输途中维持较高的细胞活率的优点。
5.本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，包括基础保存液，所述基础保存液中添加5％人ab血清和医用纯水，所述基础保存液组分包括葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水，所述葡萄糖、所述磷酸二氢钠、所述腺嘌呤、所述枸橼酸钠和所述枸橼酸按重量记分别为3.19g、0.222g、0.0275g、2.63g和0.327g。
6.进一步的，为了能够保证保存液的合理配比，能够满足等量不同组保存实验的进行，所述基础保存液、所述5％人ab血清和所述医用纯水的混合液为100ml。
7.进一步的，为了能够防止外接细菌和温度对保存液内所述脐带间充质干细胞的保存造成影响，所述基础保存液、所述5％人ab血清和所述医用纯水在无菌条件下混合配置，且所述基础保存液、所述5％人ab血清和所述医用纯水混合液保存温度为4℃。
8.进一步的，为了能够对所述脐带间充质干细胞进行预处理，防止所述脐带间充质干细胞自身对保存效果造成影响，脐带间充质干细胞保存方法，包括如下步骤：
9.步骤1：取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；
10.步骤2：用所述基础保存液、所述5％人ab血清和所述医用纯水混合液将所述脐带间充质干细胞重悬。
11.进一步的，为了达到所述脐带间充质干细胞最优的保存效果，所述脐带间充质干
细胞密度为1x106/ml。
12.进一步的，为了能够将所述脐带间充质干细胞在恒定温度下进行保存，所述脐带间充质干细胞、所述基础保存液、所述5％人ab血清和所述医用纯水混匀后放置于4℃冰箱内保存。
13.进一步的，为了说明该保存液支持4℃条件下的长途运输，能够使此保存液的保存效果在15天后仍能使细胞活率维持在75％以上，分别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的所述脐带间充质干细胞悬液中取出少量所述脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul所述脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul所述脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数所述脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余所述脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的所述脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
14.本发明的技术效果和优点：通过在葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水组成的基础保存液中加入5％人ab血清，能够使脐带间充质干细胞本发明所提出的保存液中保存时，使得在运输途中脐带间充质干细胞处于悬浮状态，能够在运输途中维持较高的细胞活率。
附图说明
15.图1为本发明脐带间充质干细胞放大100倍和放大200倍的示意图；
16.图2为本发明各组脐带间充质干细胞活率统计示意图；
17.图3为本发明保存15天后将脐带间充质干细胞接种回培养瓶，4天后脐带间充质干细胞状态示意图；
18.图4为本发明每组保存液组分表。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1
21.一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，包括基础保存液，基础保存液中添加5％人ab血清和医用纯水，基础保存液组分包括葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水，葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠和枸橼酸按重量记分别为3.19g、0.222g、0.0275g、2.63g和0.327g，基础保存液、5％人ab血清和医用纯水的混合液为100ml，基础保存液、5％人ab血清和医用纯水在无菌条件下混合配置，且基础保存液、5％人ab血清和医用纯水混合液保存温度为4℃。
22.脐带间充质干细胞保存方法为，首先取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；用基础保存液、5％人ab血清和医用纯水混合液将脐带间充质干细胞重悬，脐带间充质干细胞密度为1x106/ml，脐带间充质干细胞、基础保存液、5％人ab血清和医用纯水混匀后放置于4℃冰箱内保存，分
别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的脐带间充质干细胞悬液中取出少量脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
23.实施例2
24.一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，包括基础保存液，基础保存液中添加10％人ab血清和医用纯水，基础保存液组分包括葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水，葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠和枸橼酸按重量记分别为3.19g、0.222g、0.0275g、2.63g和0.327g，基础保存液、10％人ab血清和医用纯水的混合液为100ml，基础保存液、10％人ab血清和医用纯水在无菌条件下混合配置，且基础保存液、10％人ab血清和医用纯水混合液保存温度为4℃。
25.脐带间充质干细胞保存方法为，首先取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；用基础保存液、10％人ab血清和医用纯水混合液将脐带间充质干细胞重悬，脐带间充质干细胞密度为1x106/ml，脐带间充质干细胞、基础保存液、10％人ab血清和医用纯水混匀后放置于4℃冰箱内保存，分别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的脐带间充质干细胞悬液中取出少量脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
26.实施例3
27.一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，包括基础保存液，基础保存液中添加15％人ab血清和医用纯水，基础保存液组分包括葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水，葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠和枸橼酸按重量记分别为3.19g、0.222g、0.0275g、2.63g和0.327g，基础保存液、15％人ab血清和医用纯水的混合液为100ml，基础保存液、15％人ab血清和医用纯水在无菌条件下混合配置，且基础保存液、15％人ab血清和医用纯水混合液保存温度为4℃。
28.脐带间充质干细胞保存方法为，首先取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；用基础保存液、15％人ab血清和医用纯水混合液将脐带间充质干细胞重悬，脐带间充质干细胞密度为1x106/ml，脐带间充质干细胞、基础保存液、15％人ab血清和医用纯水混匀后放置于4℃冰箱内保存，分别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的脐带间充质干细胞悬液中取出少量脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
29.实施例4
30.一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，首先取生长状态良好且处于对数生长
期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；用dmem/f-12空白培养液将脐带间充质干细胞重悬，脐带间充质干细胞密度为1x106/ml，脐带间充质干细胞和dmem/f-12空白培养液混匀后放置于4℃冰箱内保存，分别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的脐带间充质干细胞悬液中取出少量脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
31.实施例5
32.一种脐带间充质干细胞保存液及保存方法，包括基础保存液，基础保存液组分包括葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠、枸橼酸和注射用水，葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、枸橼酸钠和枸橼酸按重量记分别为3.19g、0.222g、0.0275g、2.63g和0.327g，基础保存液混合液为100ml，基础保存液在无菌条件下混合配置，且基础保存液、5％人ab血清和医用纯水混合液保存温度为4℃。
33.脐带间充质干细胞保存方法为，首先取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，并用生理盐水反复清洗两次；用基础保存液将脐带间充质干细胞重悬，脐带间充质干细胞密度为1x106/ml，脐带间充质干细胞和基础保存液混匀后放置于4℃冰箱内保存，分别在1天、5天、7天、9天、11天和15天的脐带间充质干细胞悬液中取出少量脐带间充质干细胞，并将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul脐带间充质干细胞悬液混匀，静置30s后取10ul脐带间充质干细胞悬液加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，重复三次，并将剩余脐带间充质干细胞继续放回4℃冰箱保存，将最后一次计数完成后的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶进行培养观察。
34.基础保存液的配置为，葡萄糖：3.19g，磷酸二氢钠：0.222g，腺嘌呤：0.0275g，枸橼酸钠：2.63g，枸橼酸：0.327g，注射用水：适量；按照配方称取对应质量的组分，并向其中分别加入5％、10％、15％人ab血清，在无菌条件下用医用纯水配置成100ml的脐带间充质干细胞保存液，放置于4℃冰箱内保存备用，取生长状态良好且处于对数生长期的脐带间充质干细胞用无edta的胰酶小心消化，用生理盐水反复清洗两次，设置五组实验分组：
①
dmem/f-12空白培养液组；
②
基础保存液；
③
5％人ab血清 基础保存液；
④
10％人ab血清 基础保存液；
⑤
15％人ab血清 基础保存液；用配制好的各组保存液将脐带间充质干细胞重悬，使细胞密度为1x106/ml，混匀后放置于4℃冰箱内保存，分别于1、5、7、9、11、15天从中取出少量脐带间充质干细胞，将10ul浓度为0.4％的台盼蓝染料与90ul细胞悬液混匀，静置30s后取10ul加入细胞计数板内计数脐带间充质干细胞活率，每组重复三次；剩余细胞继续放回4℃冰箱保存，最后一次计数完成的脐带间充质干细胞离心后放入培养瓶培养，观察脐带间充质干细胞是否贴壁。
35.开始存放实验前脐带间充质干细胞状态良好，细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，且计数后细胞活率达90％以上；在保存15天后，五组脐带间充质干细胞中，基础保存液 5％ab血清的保存效果最好，在15天后细胞活率仍可达到75％以上，且优于基础保存液；在保存15天后，dmem/f-12培养液保存的细胞仍可贴壁生长，保存液保存的细胞无法贴壁生长，表明当脐带间充质干细胞用保存液保存时，在运输途中细胞处于悬浮状态，不会附着在
运输管表面贴壁造成细胞损耗。
36.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
37.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。