双特异性抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种双特异性抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物和试剂盒及其用途。


背景技术：

2.癌症是一种严重威胁人类的生命健康的疾病，近年来全球癌症的发生率、死亡率不断上升。目前已有的癌症治疗手段，包括手术切除、放疗、化疗、小分子靶向治疗、抗体靶向治疗、大分子免疫治疗等治疗方法，但上述方法仅在部分癌症患者中发挥有限的作用，癌症仍是困扰人类生命健康的难题。
3.近年来，双特异抗体成为了免疫治疗中的研究热点。双特异抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能够在靶细胞(肿瘤细胞)和效应细胞(免疫细胞)之间架起桥梁，产生导向性杀伤肿瘤的效应功能。
4.因此，亟需开饭一种用于导向性杀伤肿瘤的双特异性抗体。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种靶向cd27和nectin-4的双特异抗体，该双特异抗体可同时与cd27和nectin-4进行结合，可有效介导表达cd27的t细胞杀伤表达nectin-4的肿瘤细胞。
6.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
7.cd27属于ngfr/tnfr基因超家族成员之一，表达于活化的t细胞、b细胞亚群和部分nk细胞。nectin-4全称为脊髓灰质炎病毒样受体4(pvrl4)，是种i型跨膜蛋白，在人体正常组织(例如皮肤、膀胱、唾液腺、食道、乳房和胃)中低表达，而在癌细胞(例如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肺癌、肝癌和甲状腺癌)中高表达。此外，有研究表明，nectin-4在肿瘤的发生、侵袭和转移中起关键作用，nectin-4过表达可能会促进机体对化疗耐药性。
8.目前，靶向nectin-4的抗体药物仅有padcev获批，padcev是种抗体偶联药物，由靶向nectin-4单克隆抗体和阻断微管蛋白聚合的强效抗有丝分裂剂mmae组成，利用单克隆抗体将化疗药物靶向递送至肿瘤。目前该药物主要用于治疗接受pd-1/pd-l1抑制剂治疗期间或治疗后病情进展的局部晚期患者或转移性尿路上皮癌患者。
9.基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：第一抗原结合区，所述第一抗原结合区具有cd27结合活性；第二抗原结合区，所述第二抗原结合区具有nectin-4结合活性。根据本发明实施例的抗体可同时与cd27和nectin-4进行结合，从而有效地介导t细胞对表达nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤作用，尤其是具有较强的肿瘤抑制作用，可有效治疗癌症。
10.在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核
酸分子编码前述的抗体。根据本发明实施例的核酸分子可编码能同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体。
11.在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体的表达，以便大量获得所述抗体。
12.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前述的抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养处理，以便获得所述抗体。根据本发明实施例的方法可以有效获得上述抗体，具有制备方法简单等优点。
13.在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前述的核酸分子，或前述的表达载体或表达前述的抗体。上述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的，该重组细胞在合适条件下可高效表达上述可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体。
14.在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体，可有效地介导t细胞对表达nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤作用，尤其是具有较强的肿瘤抑制作用，可有效治疗癌症。
15.在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。根据本发明实施例的试剂盒可与cd27蛋白和/或nectin-4蛋白结合，可有效鉴定cd27蛋白和/或nectin-4蛋白。
16.在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。根据本发明的实施例，本发明抗体或药物组合物可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体，可有效地介导t细胞杀伤表达nectin-4的肿瘤细胞的杀伤作用，具有较强的肿瘤抑制作用，可有效治疗癌症。
17.在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测cd27和/或nectin-4。根据本发明的实施例，本发明抗体或试剂盒可与cd27蛋白和/或nectin-4蛋白结合，可有效鉴定cd27蛋白和/或nectin-4蛋白。
18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
19.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
20.图1是根据本发明实施例1的双特异抗体的结构示意图；
21.图2是根据本发明实施例2的cd27
×
nectin-4双特异抗体与cho-k1-cd27细胞结合
能力的检测结果图；
22.图3是根据本发明实施例3的cd27
×
nectin-4双特异抗体与人外周血cd8 t细胞结合能力的检测结果图；
23.图4是根据本发明实施例4的cd27
×
nectin-4双特异抗体与cho-k1-nectin-4细胞结合能力的检测结果图；
24.图5是根据本发明实施例5的重组双特异抗体与人sk-br-3细胞结合能力的检测结果图；
25.图6是根据本发明实施例6的cd27
×
nectin-4双特异抗体活化jurkat-nfat-lucia-cd27报告细胞的检测结果图；
26.图7是根据本发明实施例7的重组双特异抗体促进pbmc杀伤a375-nectin-4肿瘤细胞的检测结果图。
具体实施方式
27.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
28.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
29.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
30.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
31.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”应做广义理解，例如可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
32.本文中，术语“双特异抗体”通常是指由可特异性识别两种蛋白分子的肽链分别与两条fc片段进行连接而获得的，其中，两条fc片段通过knob into hole结构进行连接。本技术中“双特异抗体”、“双特异抗体分子”和“重组抗体”可互换使用。特异性识别蛋白分子的肽链可为单链抗体；也可为通过二硫键相连的两条链，例如，一条链为识别蛋白分子的重链可变区和ch1区，另一条链为识别蛋白分子的轻链可变区和cl区。
33.本文中，术语“knob into hole结构”通常是指在抗体重链恒定区(即为fc片段)的ch3区形成钮(knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体，例如，本技术中，通过突变人igg1-fc的ch3结构域中氨基酸(一条链中为t366s、l368a、y407v、y349c突变，即“hole”；另一链中为t366w、s354c突变，即“knob”)实现。
34.在本文中，所述igg1 fc部分的氨基酸编号为根据eu编号系统编号，例如，第366位是指按eu编号系统编号第366位；所述“t366s”是指按eu编号系统编号第366位的苏氨酸被丝氨酸替代；“l368a”是指按eu编号系统编号第368位的亮氨酸被丙氨酸替代。
35.在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
36.在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的dna序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、ns/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、cap细胞(人羊水来源的细胞)、昆虫细胞、per.c6细胞和cos细胞，优选为cho细胞。
37.在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
38.在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
39.在本文中，术语“药学上可接受的辅料”可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
40.在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的重组抗体或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射或皮下注射方式被给药。
41.在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾
病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
42.需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
43.本发明提出了一种抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物和试剂盒及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
44.抗体
45.在本发明的一个方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：第一抗原结合区，所述第一抗原结合区具有cd27结合活性；第二抗原结合区，所述第二抗原结合区具有nectin-4结合活性。根据本发明实施例的抗体可同时与cd27和nectin-4进行结合，从而有效地介导t细胞对表达nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤作用，尤其是介导t细胞杀伤肿瘤细胞，具有较强的肿瘤抑制作用，可有效治疗癌症。
46.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区包括第一重链可变区和第一轻链可变区，所述第一重链可变区的c端和所述第一轻链可变区的n端相连或所述第一重链可变区的n端和所述第一轻链可变区的c端相连。
47.根据本发明的实施例，所述第一重链可变区的c端和所述第一轻链可变区的n端相连。
48.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区进一步包括第一连接肽，所述第一重链可变区的c端和所述第一连接肽的n端相连，所述第一连接肽的c端与所述第一轻链可变区的n端相连，或所述第一轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相连，所述第一连接肽的c端与所述第一重链可变区的n端相连。
49.根据本发明的实施例，所述第一重链可变区的c端和所述第一连接肽的n端相连，所述第一连接肽的c端与所述第一轻链可变区的n端相连。
50.根据本发明的实施例，所述第一重链可变区包括seq id no：1～3任一项所示的cdr序列；或所述第一轻链可变区包括seq id no：4～6任一项所示的cdr序列。由此，第一抗原结合区可有效结合cd27蛋白。
51.gftfssyd(seq id no：1)。
52.iwydgsnk(seq id no：2)。
53.argsgnwgffdy(seq id no：3)。
54.qgisrw(seq id no：4)。
55.aas(seq id no：5)。
56.qqyntyprt(seq id no：6)。
57.根据本发明的实施例，所述第一重链可变区具有分别如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3所示的cdr1、cdr2、cdr3序列。
58.根据本发明的实施例，所述第一轻链可变区具有分别如seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6所示的cdr1、cdr2、cdr3序列。
59.根据本发明的实施例，所述第一连接肽具有如seq id no：7所示的氨基酸序列。
60.ggggsggggsggggs(seq id no：7)。
61.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区进一步包括第一fc肽段，所述第一轻链可变区的c端与所述第一fc肽段的n端相连，或所述第一重链可变区的c端与所述第一fc肽段的n端相连。
62.需要说明的是，在本文中的“fc肽段”、“fc片段”或“fc”是指包含铰链区、ch2区和ch3区的肽段，例如本技术中提到的野生型igg1 fc片段、第一fc肽段和第二fc肽段。
63.例如，人源野生型igg1 fc的氨基酸序列(包括hinge-ch2-ch3)如下所示：
64.pkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:30)。
65.根据本发明的实施例，所述第一fc肽段包括第一铰链区、第一ch2区和第一ch3区。
66.根据本发明的实施例，所述第一铰链区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的铰链区片段。
67.根据本发明的实施例，所述第一ch2区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的ch2区片段；或者所述第一ch2区相比于人源野生型igg1的ch2区片段，具有l234a和/或l235a突变。
68.根据本发明的实施例，所述第一ch3区相比于人源野生型igg1的ch3区片段，具有t366w和/或s354c突变。
69.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区进一步包括第二连接肽。
70.根据本发明的实施例，所述第二连接肽的n端与所述第一轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述第一fc肽段的n端相连；或所述第二连接肽的n端与所述第一重链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述第一fc肽段的n端相连。
71.根据本发明的实施例，所述第二连接肽具有如seq id no：8所示的氨基酸序列。由此，可进一步增加第一抗原结合区与cd27蛋白的结合活性。
72.ggggs(seq id no：8)。
73.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区包括seq id no：9所示的氨基酸序列。
74.需要说明的是，本发明中的第一重链可变区、第一连接肽、第一轻链可变区和第二连接肽以单链抗体的形式存在，该单链抗体(又称cd27单链抗体)中第一重链可变区的c端与第一连接肽的n端相连，第一连接肽的c端与第一轻链可变区的n端相连，第一轻链可变区的c端与第二连接肽的n端相连，该单链抗体具有seq id no：9所示的氨基酸序列。
75.qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssydmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargsgnwgffdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgisrwlawyqqkpekapksliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyntyprtfgqgtkveikggggs(seq id no：9)。
76.根据本发明的实施例，所述第一fc肽段具有如seq id no:10所示的氨基酸序列。
77.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcreemtk
nqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：10)。
78.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区具有seq id no:11所示的氨基酸序列。
79.qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssydmhwvrqapgkglewvaviwydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargsgnwgffdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgisrwlawyqqkpekapksliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyntyprtfgqgtkveikggggspkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：11)。
80.根据本发明的实施例，所述第二抗原结合区包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽通过链间二硫键相连；所述第一多肽包括第二重链可变区、ch1区和第二fc肽段，所述第二重链可变区的c端与所述ch1区的n端相连，所述ch1区的c端与所述第二fc肽段的n端相连；所述第二多肽包括第二轻链可变区和cl区，所述第二轻链可变区的c端与所述cl区的n端相连。
81.根据本发明的实施例，所述第二fc肽段包括第二铰链区、第二ch2区和第二ch3区。
82.根据本发明的实施例，所述ch1区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的ch1区。
83.根据本发明的实施例，所述第二铰链区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的铰链区片段。
84.根据本发明的实施例，所述第二ch2区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的ch2区片段；或者所述第二ch2区相比于人源野生型igg1的ch2区片段，具有l234a和/或l235a突变。
85.根据本发明的实施例，所述第二ch3区为人源、灵长目源或鼠源野生型igg1的ch3区片段。
86.根据本发明的实施例，所述第二ch3区相比于人源野生型igg1的ch3区片段，具有t366s、l368a、y407v、y349c突变中的至少之一。
87.根据本发明的实施例，所述cl区为人源、灵长目源或鼠源野生型cl区。
88.例如，人源野生型cl区的氨基酸序列如下所示：
89.rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no：31)。
90.根据本发明的实施例，所述第二重链可变区包括seq id no：12～14任一项所示的cdr序列；或所述第二轻链可变区包括seq id no：15～17任一项所示的cdr序列。
91.gftfssyn(seq id no：12)。
92.isssssti(seq id no：13)。
93.arayyygmdv(seq id no：14)。
94.qgisgw(seq id no：15)。
95.aas(seq id no：16)。
96.qqansfppt(seq id no：17)。
97.根据本发明的实施例，所述第二重链可变区具有分别如seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14所示的cdr1、cdr2、cdr3序列。
98.根据本发明的实施例，所述第二轻链可变区具有分别如seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17所示的cdr1、cdr2、cdr3序列。
99.根据本发明的实施例，所述第二重链可变区具有如seq id no：18所示的氨基酸序列。
100.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssynmnwvrqapgkglewvsyissssstiyyadsvk grftisrdnaknslslqmnslrdedtavyycarayyygmdvwgqgttvtvss(seq id no：18)。
101.根据本发明的实施例，所述第二轻链可变区具有如seq id no：19所示的氨基酸序列。
102.diqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgisgwlawyqqkpgkapkfliyaastlqsgvpsrfsgsg sgtdftltisslqpedfatyycqqansfpptfgggtkveik(seq id no：19)。
103.根据本发明的实施例，所述ch1区和所述第二fc肽段具有如seq id no:20所示的氨基酸序列。
104.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：20)。
105.需要说明的是，seq id no:20所示的氨基酸序列的肽段是由ch1区和第二fc肽段相连组成的重链恒定区片段，其中，ch1区的c端和第二fc肽段的n端相连。
106.根据本发明的实施例，所述ch1区具有如seq id no:32所示的氨基酸序列。
107.astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkve(seq id no：32)。
108.根据本发明的实施例，所述第二fc肽段具有如seq id no:33所示的氨基酸序列。
109.pkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：33)。
110.根据本发明的实施例，所述第一多肽具有如seq id no:21所示的氨基酸序列。
111.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssynmnwvrqapgkglewvsyissssstiyyadsvkgrftisrdnaknslslqmnslrdedtavyycarayyygmdvwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：21)。
112.根据本发明的实施例，所述第二多肽具有如seq id no:22所示的氨基酸序列。
113.diqmtqspssvsasvgdrvtitcrasqgisgwlawyqqkpgkapkfliyaastlqsgvpsrfsgsgsg
tdftltisslqpedfatyycqqansfpptfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seq id no：22)。
114.根据本发明的实施例，所述第一抗原结合区和第二抗原结合区通过knob-into-hole结构进行连接。
115.根据本发明的实施例，所述knob-into-hole结构是由第一ch3区的t366w和/或s354c突变和第二ch3区的t366s、l368a、y407v、y349c至少之一的突变形成的。
116.根据本发明的实施例，所述knob-into-hole结构是由第一ch3区的t366w和s354c突变和第二ch3区的t366s、l368a、y407v、y349c的突变形成的。由此，可减少含有两条第一fc肽段的第一抗原结合区相连，以及减少含有两条第二fc肽段的第二抗原结合区相连，可提高本发明的抗体的产率。
117.核酸分子、表达载体和重组细胞
118.在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体或其抗原结合片段。
119.在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的抗体。根据本发明实施例的核酸分子可编码可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体。
120.根据本发明的实施例，所述核酸分子为dna分子。
121.在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的抗体的表达，以便大量获得所述抗体。
122.在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
123.本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体第一抗原结合区、第一多肽和第二多肽的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
124.根据本发明的实施例，所述表达载体为非致病性病毒载体。
125.根据本发明的实施例，所述表达载体为腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
126.在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前述的核酸分子，或前述的表达载体或表达前述的抗体。上述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的，该重组细胞在合适条件下可高效表达上述可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体。
127.需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞
可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
128.需要说明的是，本技术说明书中所述的“适合条件”，是指适合本技术所述抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体表达的条件。
129.根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
130.根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
131.根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为cho细胞等。
132.制备抗体的方法
133.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前述的抗体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前述的表达载体引入到细胞中；将所述细胞在适于蛋白表达和分泌的条件下进行培养处理，以便获得所述抗体。根据本发明实施例所提出的方法可以有效获得上述抗体，具有制备方法简单等优点。
134.根据本发明的实施例，所述细胞为真核细胞。
135.根据本发明的实施例，所述真核细胞为哺乳动物细胞。当所述细胞为真核细胞，如哺乳动物细胞时所述重组抗体的表达效率较高。
136.根据本发明的实施例，所述真核细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
137.药物组合物和试剂盒
138.在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物可同时靶向结合cd27和nectin-4的抗体，可有效地介导t细胞对表达nectin-4的细胞(例如肿瘤细胞)的杀伤作用，尤其是具有较强的肿瘤抑制作用，可有效治疗癌症。
139.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
140.在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。根据本发明实施例的试剂盒可与cd27蛋白和/或nectin-4蛋白结合，从而有效地鉴定cd27蛋白和/或nectin-4蛋白。
141.用途
142.在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗体、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或
fisher，a29130)、300μlenhancer(thermo fisher，a29130)，并转入32℃、5％co2条件下培养9天后收获培养上清，其中第5天添加8ml feed。利用protein a纯化柱(ge)从培养上清中亲和纯化双特异抗体，获得抗体cd27
×
nectin-4(本文中，与“cd27
×
nectin-4抗体”、“cd27
×
nectin-4双特异抗体”和“双特异性抗体”可互换使用)。经检测，抗体cd27
×
nectin-4具有如seq id no:11、seq id no:21和seq id no:22所示的氨基酸序列。
154.第一链编码基因用于编码seq id no:11，第一链编码基因包括如下所示的核苷酸序列：
155.caagtgcaattggttgaatctggcggaggcgttgttcagccaggaaggtcccttcgtttgagttgtgctgcttccggtttcacttttagttcttatgatatgcactgggtcaggcaggctcctggaaagggactggaatgggtggcagtgatctggtatgatggatctaacaaatattatgccgattccgtcaaggggagatttaccatcagtagggataattccaagaataccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaagacactgcagtgtattattgcgctcgcggtagcgggaactggggtttctttgactactgggggcagggtactctggtgaccgtctctagtggaggaggtggctcaggaggaggtggatctggtggcggtggttccgatattcagatgactcaaagtccatcctccttgtctgcttccgtgggtgaccgggttaccataacctgccgggcaagtcaggggatttctagatggttggcttggtaccagcagaagcctgagaaggcccctaaatccttgatatacgccgcttcttccttgcaaagcggagtcccttcccggttttctgggtccggttccggcaccgactttaccctgaccattagctccctgcagcctgaggacttcgcaacctattattgccaacagtacaacacataccctagaactttcggacaaggcaccaaggtcgagatcaaggggggaggaggatcccctaagagttgcgataagacacatacatgtcctccatgccctgcccctgaagctgctggaggaccatccgtcttcctttttccccccaagccaaaggatactttgatgatcagtcgtactcccgaggtgacttgtgtcgtcgtcgatgtcagccacgaggatccagaggttaagttcaattggtatgtggacggcgtggaggtacataatgccaagaccaagcctcgggaggaacagtacaactctacttatcgggtggtgtctgtgcttaccgtgttgcatcaagactggctgaacggcaaggagtacaaatgtaaagtcagcaataaagctctgccagcacccatcgaaaagaccatttccaaggctaaaggccagccacgagagccccaagtgtacacactgccaccatgtagggaggaaatgaccaagaatcaggtgtctctctggtgtttggtgaagggcttttacccttccgacatcgctgtcgagtgggaaagtaatggccaaccagagaacaactacaaaacaacccctccagtgctcgactccgatggatccttcttcctgtattcaaaactgacagtggataagtcacggtggcagcagggtaatgtcttctcctgcagtgttatgcatgaggccctgcacaaccactatacccaaaaaagtctgtccctgagccctggtaag(seq id no：23)。
156.第二链编码基因用于编码seq id no:21，第二链编码基因包括如下所示的核苷酸序列：
157.gaagttcagctcgtggaaagtggaggaggactggttcaacctggaggatcactgcgcctcagctgtgcagcatctggtttcaccttctctagctataacatgaactgggtgagacaggcccctggaaagggactggaatgggtgtcttacattagttctagctcctctactatctattatgccgactccgttaaaggaaggttcaccatctcacgtgacaatgccaaaaatagcctgtctctgcagatgaattccctgcgggatgaggatacagccgtgtactattgcgctcgagcctattattacgggatggacgtctgggggcagggtactactgtgactgtgtcttcagcatccaccaagggcccatctgtgtttcctctggctccaagctccaaaagtacctccgggggcacagctgctctgggttgtttggtcaaggactattttcctgagccagtcacagtgtcctggaactcaggcgccctgacatctggtgtccatacctttcctgccgtcctccagagctccggactgtacagtctctctagtgtggtcacagttccttcatcatctctcggcacacagacatatatttgcaacgtgaaccacaagccttcaaataccaaggttgataagaaggtcgagcccaaaagctgcgacaagactcatacttgtccaccttgtcctgctccagaagccgctggaggcccatctgtgtttttgttccctcctaaacccaaagacaccct
catgatctcacggactccagaagtcacatgtgtcgtggttgatgtgtctcacgaggacccagaagtcaagtttaactggtacgtggacggcgtagaggtgcataacgctaaaactaagccccgggaggagcagtacaatagcacatatcgagtcgtgtcagtcctcactgtgctgcatcaggactggctcaacggcaaggaatacaagtgcaaagtctccaataaggctttgcctgcccctatcgagaagacaatctccaaggcaaaggggcaacccagagaaccccaagtgtgtaccctgccaccttccagggaagaaatgaccaagaatcaggtgagtttgagctgcgctgtgaaaggattttacccctctgacattgctgtcgaatgggagtctaacggtcagccagaaaacaattataagacaactccacctgtcctcgactccgacggatccttctttcttgtctctaagctgacagtggataaatcccgctggcagcagggcaatgtcttctcatgcagcgttatgcatgaggccctccataaccattatacccagaagtccctgagcctttcaccaggcaag(seq id no：24)。
158.第三链编码基因用于编码seq id no:22，第三链编码基因包括如下所示的核苷酸序列：
159.gatatccaaatgacccaatccccctcttctgtcagcgcttccgttggcgatagggtaacaatcacttgccgcgcaagccaaggaatctccggctggctggcatggtatcagcagaaaccagggaaggctccaaagttccttatctatgccgccagtacacttcagtctggagtgccttctcgtttctctggttctgggagtggcactgactttacacttaccattagttccttgcagcccgaagacttcgccacatattactgtcagcaggcaaatagcttccctcctacattcggagggggaacaaaggtggaaatcaagaggacagttgccgcaccttccgtgtttatctttcctccaagcgatgagcagctgaagagtgggactgcctcagtcgtctgtctgttgaacaatttctatccaagagaggccaaagtgcagtggaaagtggacaatgcattgcagtccggaaactcacaggagagcgtgacagagcaggactccaaagattctacatacagcctctcctccacactgacattgtccaaggcagattacgagaagcacaaagtgtacgcttgcgaggtcacccaccagggcctgtcatcccctgtgacaaagtccttcaaccgaggcgagtgc(seq id no:25)。
160.实施例2：双特异抗体与cho-k1-cd27细胞的结合能力鉴定
161.本实施例使用流式细胞术检测实施例1获得的双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和cho-k1-cd27细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
162.hek293t细胞按照5
×
105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-ef1a-cd27-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入有cd27蛋白(seq id no:26)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem培养基中，然后加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司)，获得的cd27蛋白具有如seq id no:27所示的氨基酸序列；混匀后静置16min，然后将全部液体加入上述铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
×
104cho-k1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为cho-k1-cd27细胞。
163.atggccagacctcacccttggtggctttgtgtcttgggtactttggtgggcctctctgcaacacctgctccaaagtcctgccccgagagacattattgggcacaaggcaagctttgttgtcagatgtgcgaacctggaacatttctggtgaaagattgcgaccaacacaggaaagctgctcagtgcgacccatgtatcccaggagtatctttctctccagaccatcatacccgacctcattgcgagagctgcaggcactgtaacagtgggctgttggtgcggaactgtacaataacagctaacgccgagtgtgcctgtcgaaacggatggcagtgccgggacaaagagtgcacagaatgcgaccctctgcccaatccttctctgactgcacgttcctcccaggcattgtctccccacccacagccaacacatctcccctatgtgtctg
agatgctggaagccaggaccgctggtcatatgcaaaccctggcagactttcgccagctgcctgctaggactctgtctacccattggcctcctcaaaggagcctttgctccagcgatttcattcgcatattggtgatcttttccggcatgtttcttgtctttacattggccggggctctctttctgcatcagcgtaggaaatatcggtccaacaagggcgaaagtcccgttgagccagctgaaccatgccactatagctgtccaagagaggaagagggatcaaccatacccattcaggaggattacaggaagcccgagcctgcctgttcccct(seq id no:26)。
164.marphpwwlcvlgtlvglsatpapkscperhywaqgklccqmcepgtflvkdcdqhrkaaqcdpcipgvsfspdhhtrphcescrhcnsgllvrnctitanaecacrngwqcrdkectecdplpnpsltarssqalsphpqpthlpyvsemleartaghmqtladfrqlpartlsthwppqrslcssdfirilvifsgmflvftlagalflhqrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp(seq id no:27)。
165.用pbs将cho-k1-cd27细胞稀释为1
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管小鼠血清，于4℃封闭30min。分别加入一系列浓度梯度(0.1、1、10、30、100、300μg/ml)的cd27
×
nectin-4双特异抗体、higg(对照igg1，biolegend、qa16a12)10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100
×
g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍沉淀。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，重悬后向其中加入体积为1μl/管alexa-647标记的大鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，m1310g05)，4℃条件下避光孵育30min。用pbs洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图2所示，进一步显示本发明的双特异抗体cd27
×
nectin-4能够结合cho-k1-cd27细胞。
166.实施例3：双特异抗体与人外周血cd8 t细胞的结合能力鉴定
167.本实施例使用流式细胞术检测实施例1获得的双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和人外周血cd8 t细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
168.用pbs将人外周血单个核细胞稀释为5
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管大鼠血清，于4℃封闭30min；封闭结束后分别加入一系列浓度梯度(0.1、1、10、30、100、300μg/ml)的cd27
×
nectin-4双特异抗体、higg(对照igg1，biolegend、qa16a12)10μl/管，于4℃孵育30min后，向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100
×
g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍沉淀，离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，向其中加入1μl/管alexa-647标记的大鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，m1310g05)以及1μl/管fitc标记的小鼠抗人cd8抗体(invitrogen，okt8)，4℃避光孵育30min。用pbs洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图3所示，说明本发明双特异抗体能够结合人外周血t细胞。
169.实施例4：双特异抗体与cho-k1-nectin-4细胞的结合能力鉴定
170.本实施例使用流式细胞术检测实施例1获得的双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和cho-k1-nectin-4细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
171.hek293t细胞按照5
×
105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-ef1a-nectin-4-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入有nectin-4蛋白(seq id no:28)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem
培养基中，然后加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司)，获得的nectin-4蛋白具有如seq id no:29所示的氨基酸序列；混匀后静置16min，然后将全部液体加入上述铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
×
104cho-k1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为cho-k1-nectin-4细胞。
172.atgccacttagcttgggagctgaaatgtggggtccagaagcttggctcctccttttgctcttgttggcctcttttacaggccgttgccctgctggagaactggaaactagtgatgtggtgaccgtggtgctgggacaggacgcaaagctcccctgcttttacagaggtgattctggtgagcaggttggccaggttgcatgggctagagtcgacgcaggtgagggcgcacaggagttggcactgcttcattccaagtacggcctgcacgtttctccagcttatgaaggcagagtggaacagccaccaccacctcgtaacccactggatggcagcgtgctgctgaggaacgctgtgcaggctgacgagggcgaatatgagtgccgcgtgagcacattccccgctggtagctttcaggcacgactgagattgagggtgctggtcccacccctcccatctcttaatcctggccctgccttggaagaagggcagggacttacactggctgctagctgcacagctgaggggagtccagcaccttcagtgacttgggataccgaggttaaagggactaccagttctcgaagtttcaagcattcccgatctgctgccgtgacttcagagttccatctggttcccagcaggagcatgaatggacagccactgacatgtgtggtttcccaccctggcctgctccaggatcagaggattacccacatacttcacgtctcttttctggcagaggcatctgtgagaggtctggaggaccagaatttgtggcatatcggccgagagggcgcaatgcttaaatgtctcagcgaaggacagccaccaccaagctacaattggactagactggatggaccactgccaagcggagtgcgtgtcgatggtgatacactcggctttcccccactgactacagagcatagcggcatatacgtgtgtcatgtttctaacgaattttctagccgggactctcaggtgaccgtggatgtgctcgacccacaagaggactccggcaagcaagtcgatctggttagtgcctctgtggtggtcgtgggggtgattgcagctcttctgttttgtttgctggtcgttgtggtagtgctgatgagccgctatcaccgtcgaaaggcacagcaaatgactcagaagtatgaggaagaactgactctcactcgtgagaactcaatcaggcgcctgcacagccatcacacagacccaaggagccaacctgaggagagcgttggtcttcgagccgagggacatcctgattcactcaaagacaacagctcatgctccgtcatgtcagaggagcctgaaggacgctcctattccacattgaccaccgtgcgagaaattgaaacacagactgagctcctgtctcctggcagcggacgtgcagaggaagaggaggatcaggatgagggcattaagcaggccatgaaccattttgttcaagagaatggaaccctgcgagctaagcctaccggcaatggcatatacatcaatggacgaggccacctcgtc(seq id no:28)。
173.mplslgaemwgpeawlllllllasftgrcpageletsdvvtvvlgqdaklpcfyrgdsgeqvgqvawarvdagegaqelallhskyglhvspayegrveqpppprnpldgsvllrnavqadegeyecrvstfpagsfqarlrlrvlvpplpslnpgpaleegqgltlaasctaegspapsvtwdtevkgttssrsfkhsrsaavtsefhlvpsrsmngqpltcvvshpgllqdqrithilhvsflaeasvrgledqnlwhigregamlkclsegqpppsynwtrldgplpsgvrvdgdtlgfpplttehsgiyvchvsnefssrdsqvtvdvldpqedsgkqvdlvsasvvvvgviaallfcllvvvvvlmsryhrrkaqqmtqkyeeeltltrensirrlhshhtdprsqpeesvglraeghpdslkdnsscsvmseepegrsystlttvreietqtellspgsgraeeeedqdegikqamnhfvqengtlrakptgngiyingrghlv(seq id no:29)。
174.用pbs将cho-k1-nectin-4细胞稀释为1
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管大鼠血清，于4℃封闭30min。分别加入一系列浓度梯度(0.1、1、10、30、100、300μg/ml)的cd27
×
nectin-4双特异抗体、higg(对照igg1，biolegend、qa16a12)10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100
×
g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍沉淀。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，重
悬后向其中加入体积为1μl/管alexa-647标记的大鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，m1310g05)，4℃条件下避光孵育30min。用pbs洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图4所示，进一步显示本发明的双特异抗体cd27
×
nectin-4能够结合cho-k1-nectin-4细胞。
175.实施例5：双特异抗体与人乳腺癌sk-br-3细胞的结合能力鉴定
176.本实施例使用流式细胞术检测实施例1获得的双特异抗体的结合特性，并基于双特异抗体加入后信号的强弱用于判断双特异抗体和人乳腺癌sk-br-3细胞的结合特性。具体的实验操作如下：
177.用pbs将人乳腺癌sk-br-3细胞稀释为1
×
106/ml，以90μl/管的体积加于1.5ml ep管中，向其中加入10μl/管大鼠血清，于4℃封闭30min。分别加入一系列浓度梯度(0.1、1、10、30、100、300μg/ml)的cd27
×
nectin-4双特异抗体、higg(对照igg1，biolegend、qa16a12)10μl/管，于4℃孵育30min。孵育结束后向ep管中加入1ml pbs，于4℃、100
×
g条件下离心5min，弃尽上清，再用pbs洗一遍沉淀。离心后弃尽上清，用100μl/管pbs重悬细胞，重悬后向其中加入体积为1μl/管alexa-647标记的大鼠抗人fc抗体二抗(biolegend，m1310g05)，4℃条件下避光孵育30min。用pbs洗两遍，离心后弃尽上清。用200μl/管pbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，具体的实验结果如图6所示，进一步显示本发明的双特异抗体cd27
×
nectin-4能够结合人乳腺癌sk-br-3细胞。
178.实施例6：双特异抗体促进jurkat-nfat-lucia-cd27报告细胞活化的鉴定
179.本实施例利用jurkat-nfat-lucia-cd27报告体系方法，鉴定实施例1获得的双特异抗体交联靶细胞表面nectin-4和效应细胞表面cd27，促进t细胞活化的能力，相对化学发光信号(rlu)的强弱用于判断双特异抗体桥联靶细胞和t细胞，进而活化t细胞的能力。
180.hek293t细胞按照5
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105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-ef1a-cd27-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入有cd27蛋白(seq id no:26)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem培养基中，然后加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司)，获得的cd27蛋白具有如seq id no:27所示的氨基酸序列；混匀后静置16min，然后将全部液体加入上述铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
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104jurkat-nfat-lucia细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为jurkat-nfat-lucia-cd27细胞。
181.(1)用完全rpmi-1640培养基将实施例5获得的cho-k1-nectin-4细胞稀释为1
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105/ml，加入96孔板中，添加体积为100μl/孔。
182.(2)用完全rpmi-1640培养基将实施例1获得的cd27
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nectin-4双特异抗体分别稀释为500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml，4μg/ml、0.8μg/ml、160ng/ml、32ng/ml、6.4ng/ml，加入至步骤(1)中含有cho-k1-nectin-4细胞的96孔板中，添加体积为20μl/孔。
183.(3)用完全rpmi-1640培养基将jurkat-nfat-lucia-cd27细胞稀释为1.25
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105/ml，加入至步骤(2)中含有双特异抗体的96孔板中，添加体积为80μl/孔。
184.(4)将步骤(3)获得的反应体系于37℃、5％co2培养箱中培养24h。
185.(5)吸取50μl步骤(4)获得的培养上清，加入96孔板中，然后向板中加入荧光素酶底物，添加体积为50μl/孔。
186.(6)利用多功能酶标仪检测化学发光。
187.具体的实验结果如图6所示，进一步显示本发明的双特异抗体cd27
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nectin-4能够桥联靶细胞(cho-k1-nectin-4细胞)和t细胞(jurkat-nfat-lucia-cd27细胞)，促进t细胞活化。
188.实施例7：双特异抗体促进pbmc杀伤肿瘤细胞
189.本实施例检测实施例1获得的双特异性抗体对pbmc杀伤a375-nectin-4肿瘤细胞的影响，通过构建所述肿瘤细胞 pbmc 不同浓度双特异性抗体的反应体系进行检测，具体实验操作如下：
190.hek293t细胞按照5
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105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的dmem培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1ml新鲜的不含双抗的dmem培养基。将plvx-ef1a-nectin-4-ires-puro(plvx-ef1a-ires-puro载体的酶切位点ecori与bamhi之间插入有nectin-4蛋白(seq id no:28)的编码序列、pmd2g、pspax2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μl无血清dmem培养基中，然后加入12μg聚醚酰亚胺(pei，polysciences有限公司)，获得的nectin-4蛋白具有如seq id no:29所示的氨基酸序列；混匀后静置16min，然后将全部液体加入上述铺有hek293t细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全dmem培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1
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104a375细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/ml的聚凝胺(sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全dmem培养基。所得细胞即为a375-nectin-4细胞。
191.(1)按照50μl/孔的体积向16孔rtca板中加入完全rpmi-1640培养基，上机校准；
192.(2)用完全rpmi-1640培养基将a375-nectin-4细胞稀释为2
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105/ml，按照50μl/孔的体积分别添加至步骤(1)获得的rtca板中，然后于37℃、5％co2条件下使用xcelligence rtca tp设备检测细胞系数24h；
193.(3)用完全rpmi-1640培养基将实施例1获得的双特异抗体稀释为一系列浓度梯度(0.32、1.6、8、40、200、1000ng/ml)，加入步骤(2)获得的rtca板中，添加体积为20μl/孔；
194.(4)用完全rpmi-1640培养基将pbmc(赛笠生物)稀释为1.25
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106个/ml，加入步骤(3)获得的rtca板中，添加体积为80μl/孔；
195.(5)将步骤(4)获得的反应体系于37℃、5％co2使用xcelligence rtca tp设备检测细胞系数48h。
196.具体的实验结果如图7所示，进一步显示本发明的双特异抗体能够促进pbmc杀伤表达nectin-4阳性肿瘤细胞。
197.由以上实验结果可以看出，本发明得到的双特异抗体能够与t细胞、肿瘤细胞进行结合，桥联t细胞与肿瘤细胞，并促进t细胞杀伤肿瘤细胞。
198.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技
术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
199.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。