新冠病毒RBD特异性单克隆抗体和应用的制作方法

新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体技术领域，尤其涉及新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.抗体是由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，四条多肽链包括两条重链(h链)和两条轻链(l 链)。h链由重链可变区(vh)和重链恒定区组成，重链恒定区由三个区ch1、ch2和ch3组成。l 链由l链可变区(vl)和轻链恒定区组成，轻链恒定区由cl区组成。vh和vl可进一步分成称为互 补决定区(cdrs)的高变区和称为构架区(fr)交替分布的保守区。
3.目前研究发现：新冠病毒(sars-cov-2)具有四种主要的结构蛋白，分别为刺突蛋白(s蛋白)、 核衣壳蛋白(n蛋白)、膜蛋白(m蛋白)和包膜蛋白(e蛋白)，其中s蛋白有两个亚基：s1和 s2，受体结合位点(rbd)位于s1亚基上，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞 的融合。
[0004][0005]
申请公开号为cn111303280a的中国发明专利申请公开了一种高中和活性抗sars-cov-2全人 源单克隆抗体，上述专利提供的是识别区域为s1非rbd区的全人源单克隆抗体，但是由于新冠病 毒入侵宿主细胞是通过rbd与宿主细胞的ace2结合，所以上述专利获得的全人源单克隆抗体对病 毒的阻断效果有限，并且上述专利是通过标记浆细胞而获得抗体cdna，但是与浆细胞相比，是记忆 b细胞活化后迅速做出反应，所以记忆b细胞能够引发比初次反应更快，也更强烈的体液免疫反应， 而浆细胞所引发的体液免疫反应有限。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种针对rbd，并且能够引发更强烈体液免疫反应的新冠病毒rbd特异 性单克隆抗体和应用。
[0007]
为了达到上述目的，本发明提供了新冠病毒的rbd蛋白的特异性单克隆抗体，具体的，抗体的 重链氨基酸序列如seq id no:21所示；轻链氨基酸序列如seq id no:22所示(单抗11-cqts033)。 重链氨基酸序列还可如seq id no:23所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:24所示(单抗12-cqts034)。重链氨基酸序列还可如seq id no:25所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:26 所示(单抗13-cqts035)。重链氨基酸序列还可如seq id no:27所示；轻链氨基酸序列还可如seqid no:28所示(单抗14-cqts036)。重链氨基酸序列还可如seq id no:29所示；轻链氨基酸序列 还可如seq id no:30所示(单抗15-cqts038)。重链氨基酸序列还可如seq id no:31所示；轻链 氨基酸序列还可如seq id no:32所示(单抗16-cqts040)。重链氨基酸序列还可如seq id no:33 所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:34所示(单抗17-cqts041)。重链氨基酸序列还可如seqid no:35所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:36所示(单抗18-cqts042)。重链氨基酸序列 还可如seq id no:37所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:38所示(单抗19-cqts043)。重链 氨基酸序列还可
cov-2试剂 或药物中的应用。
[0023]
在实际生产时，可以采用本实施例得到新冠病毒rbd特异性单克隆抗体制备核酸分子，或者制 备包含该核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，或者制备药物组合物，该药物组合 物包括上述新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
[0024]
在应用时，本实施例得到新冠病毒rbd特异性单克隆抗体制备的相关产品，可具有如下(b1)
‑ꢀ
(b4)中的任一种的用途：(b1)结合新型冠状病毒sars-cov-2；(b2)检测结合新型冠状病毒 sars-cov-2；(b3)结合新型冠状病毒sars-cov-2的s蛋白；(b4)检测新型冠状病毒sars-cov-2 的s蛋白。
[0025]
实施例2-10
[0026]
实施例2-10与实施例1的区别在于：新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的氨基酸序列不同，实施 例2-10的氨基酸序列如下表所示：
[0027][0028][0029]
以上实施例1-10所提供的新冠病毒rbd特异性单克隆抗体均通过以下方法得到：首先从新冠肺 炎康复患者的外周血中分选得到单个rbd特异性记忆b细胞，然后获得rbd特异性记忆b细胞的 mrna，再通过rt-pcr和巢式pcr构建抗体可变区基因表达盒，再将抗体可变区基因表达盒转导 入293t细胞表达抗体并收集上清，用elisa法检测上清的rbd特异性，筛选得到新冠病毒rbd特 异性单克隆抗体。
[0030]
具体包括以下步骤：
[0031]
s1、采集若干名新冠肺炎康复患者外周血，分离得到pbmc，在-80℃的冰箱中冻存备用。
[0032]
s2、首先采用去死细胞染料(dead dye)去除s1得到的pbmc的死细胞，然后采用cd19、mig-g、 mig-d和s-rbd对pbmc中活的rbd特异性并且结合能力高的记忆b细胞染色标记，筛选出针对 rbd特异性记忆b细胞；使用流式细胞分选仪将特异性记忆b细胞分选到96
孔板上，每个孔内有 一个特异性记忆b细胞，在-80℃的冰箱中冻存备用。
[0033]
具体的，本实施例优选的dead dye染色时的浓度范围为1-2μg/ml，本实施例优选dead dye染 色时的浓度为1.5μg/ml；cd19为biolegend生产的b细胞标记物，染色时的浓度范围为1-2μg/ml， 本实施例优选cd19染色时的浓度为1.5μg/ml。mig-g为biolegend生产的b细胞标表面受体，染色 时的浓度范围为1-2μg/ml，本实施例优选mig-g染色时的浓度为1.5μg/ml；mig-d为biolegend生 产的b细胞表面受体，染色时的浓度范围为1-2μg/ml，本实施例优选mig-d染色时的浓度为1.5μg/ml； s-rbd为sinobiological生产的新冠病毒是蛋白受体结构域，染色时的浓度范围为1-2μg/ml，本实施 例优选s-rbd染色时的浓度为1.5μg/ml。
[0034]
通过流式细胞仪分选rbd特异性记忆b细胞的，通过cd19、mig-g、mig-d和s-rbd对pbmc 的细胞分选得到对s-rbd具有特异性记忆b细胞的细胞分选图如图1和图2所示，其中图2中的batchid 0428、0505、0522、0528是筛选批次。本实施例采用cd19、mig-g、mig-d和s-rbd筛选出针 对rbd特异性记忆b细胞的原理在于：将pbmc用去死细胞染料(dead dye)、b细胞标记物cd19、 记忆b细胞标记物mig-g阳性和mig-d阴性以及rbd特异性igg表达的记忆b细胞进行染色，然 后使用流式细胞分析仪将细胞群中cd19细胞群划分出来，再通过从cd19阳性细胞群中划分mig-g

mig-d-细胞群，再从mig-g

mig-d-细胞群划分rbd阳性的记忆b细胞，再通过流式细胞分选 仪将rbd阳性的记忆b细胞进行分选。
[0035]
s3、分选得到单个rbd特异性记忆b细胞的mrna，采用rt-pcr扩增获得抗体可变区cdna。 具体的，使用rt-pcr扩增抗体可变区cdna时，本实施例所设计的引物的引物前段设计通用leader (参见引物序列表一和引物序列表二)，有效提高了抗体基因的扩增率，实验结果如图3所示。
[0036]
s4、采用巢式pcr扩增s1-s3得到的抗体可变区cdna，构建抗体可变区基因表达盒。
[0037]
s3和s4总共通过以下六部分进行：(1)提取rbd特异性记忆b细胞的mrna；(2)单个细 胞mrna逆转录(rt)；(3)加g尾(tdt)；(4)第一轮pcr(1st pcr)；(5)第二轮pcr (2nd pcr)；(6)bcr-orf pcr扩增构建基因表达盒；(7)cmv、wpre-γ/κ/l片段扩增及cmv、 bcr-vγ/κ/l((6)的产物)、wpre-γ/κ/l重叠pcr(overlap pcr)预连接；(8)bcr-γorf、 bcr-κorf、bcr-lpcr扩增。
[0038]
各部分反应液配制及反应条件如下：
[0039]
(1)采用dynabeads
tm
mrna direct
tm
purification kit(thermo fisherscientific)进行单细胞 mrna提取，具体包括以下步骤：
[0040]
①
离心：从-80℃冰箱中取出分选有单个rbd特异性记忆b细胞的96孔板后，600
×
g离心30s， 使细胞离心于孔底部；
[0041]
②
清洗：将dynabeads oligo(dt)25微球瓶取出后涡旋混匀，按照2μl/孔吸取足量微球，放置于 磁铁块上，静置30s，弃上清，用500μl的lysis buffer重悬；
[0042]
③
配制：按照9μl/孔lysis buffer加入到50ml的离心管中，将上述500μl微球悬液加入其中， 用枪吹匀；
[0043]
④
分装：用八连管分装微球，随后采用排枪将其按照9μl/孔加入到细胞板中；
[0044]
⑤
润洗：96孔板贴膜，随后润洗管壁四周，共2个循环；
[0045]
⑥
孵育：室温静置5min，使rbd特异性记忆b细胞的mrna充分释放并结合到微球上，
孵育 结束后，600
×
g瞬时离心，使微球离心于孔底部。将96孔板放置于dynamag
tm-96side magnet磁板上， 用排枪吸弃上清；
[0046]
⑦
wash a清洗：按照8μl/孔加入washing buffer a，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清；
[0047]
⑧
wash b清洗：按照8μl/孔加入washing buffer b，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清， 随后按照10μl/孔加入预先配制的逆转录(rt)反应液。试剂配制及反应条件如下述(2)描述。
[0048]
(2)逆转录(rt)(10μl体系)
[0049]
所需配制的试剂如下表1所示：
[0050]
试剂名称体积depc-h2o4.5μl5
×
primerscript buffer2.0μl2.5mm dntp2.0μlrnase inhibitor1μlsamplebeadsprimerscriptⅱrtase0.5μl总体积10μl
[0051]
反应条件：42℃for 60min(每20min混合一次)；
[0052]
反应结束后，600
×
g瞬时离心96孔板，然后将96孔板放置于dynamag
tm-96side magnet磁板上，用 排枪吸弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的tdt反应液，试剂配制及反应条件如下述(3)描述。
[0053]
(3)加g尾(tdt)(10μl体系)
[0054]
所需配制的试剂如下表2所示：
[0055]
试剂名称体积h2o6.4μl5
×
tdt buffer2.0μl10mm dgtp0.5μl0.1％bsa1.0μlsamplebeadstdt0.1μl总体积10μl
[0056]
反应条件：37℃for 40min(每20min混合一次)。
[0057]
反应结束，600
×
g瞬时离心96孔板，然后将其放置于dynamag
tm-96side magnet磁板上，用排枪吸 弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的第一轮pcr(1st pcr)反应液，试剂配制及反应条件如下 述(4)描述。
[0058]
(4)1st pcr(10μl体系)(引物序列参见引物序列表)
[0059]
所需配制的试剂如下表3所示：
[0060]
[0061][0062]
基于pcr原理，1st pcr的实验反应条件为：
①
95℃预变性3min；
②
95℃变性15sec，60℃退火5sec， 72℃延伸1min，30-35cycles，本实施例优选30cycles；
③
72℃循环外延伸5min，4℃保存。
[0063]
(5)第二轮pcr(2nd pcr)(10μl体系)(引物序列参见引物序列表一和引物序列表二)
[0064]
所需配制的试剂如下表4所示：
[0065]
试剂名称体积h2o1.5μl2
×
gc buffer5μl2.5mm dntp1μlfp:mac-ap3/ap3(10μm)0.5μlrp:cg-nest/k20/ci-nest(10μm)0.5μlprimestar0.5μlsample1μl总体积10μl
[0066]
基于pcr原理，2nd pcr的实验反应条件为：
①
95℃预变性3min；
②
95℃变性15sec，60℃退火5s， 72℃延伸1min，30-35cycles，本实施例优选35cycles；72℃循环外延伸5min，4℃保存。
[0067]
pcr结束后：每孔取4μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。将gamma链与kappa链或lamada链配对的细 胞孔送测序。
[0068]
(6)抗体表达盒(bcr-orf)的扩增和构建。
[0069]
pcr扩增启动子区(cmv启动子)、wpre-γ(抗体gamma链)和wpre-κ(抗体kappa链)， pcr扩增体系如下表5所示：
[0070][0071]
pcr扩增条件为：
①
95℃预变性3min；
②
95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，30cycles；
ꢀ③
72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0072]
(7)cmv、wpre-γ/κ/l片段扩增及cmv、bcr-vγ/κ/l、wpre-γ/κ/l重叠pcr(overlap pcr) 预连接
[0073]
实验体系如下表6所示：
[0074][0075]
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，50℃退火15sec，72℃延伸1.5min，10cycles； 72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0076]
(8)bcr-γorf、bcr-κorf、bcr-l pcr扩增
[0077]
实验体系如下表7所示：
[0078][0079][0080]
pcr扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸
1.5min，30cycles； 72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0081]
扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析得到的抗体可变区基因大小是否正确，实验结果如 图4所示，marker在中间位置，条带在5000bp处。
[0082]
bcr-γorf和bcr-κ/orf乙醇沉淀：bcr-γorf和bcr-κorf的pcr产物各取30μl置于8 连管中，再加入120μl无水乙醇，6μl醋酸钠溶液，充分混匀，-80℃静置30min；10000rpm，离心20min， 弃上清，依次用200μl的70％乙醇和无水乙醇各漂洗一次，于56℃乙醇充分挥发，加入40μl无菌水， 振荡，使沉淀充分溶解，检测抗体可变区基因的浓度。
[0083]
s3和s4所用到的leader引物参见如下的引物序列表一：
[0084]
[0085]
[0086][0087]
s3和s4所用到的所用到j-region引物参见如下的引物序列表二：
[0088]
primer idsequenceighj_01gatgggcccttggtggagggtgaggagacggtgaccagggtgccctggccccagtighj_02gatgggcccttggtggagggtgaggagacagtgaccagggtgccacggccccagaighj_03gatgggcccttggtggagggtgaagagacggtgaccattgtcccttggccccagaighj_04gatgggcccttggtggagggtgaggagacggtgaccgtggtcccttgcccccagaigkj_01gatggtgcagccacagttcgtttgatttccaccttggtcccttggccgaacgtccigkj_02gatggtgcagccacagttcgtttgatttccaccttggtcccttggccgaacgtccigkj_03gatggtgcagccacagttcgtttgatatccactttggtcccagggccgaaagtgaigkj_04gatggtgcagccacagttcgtttgatctccaccttggtccctccgccgaaagtgaigkj_05gatggtgcagccacagttcgtttaatctccagtcgtgtcccttggccgaaggtgaiglj_01ggggcagccttgggctgacctaggacggtgaccttggtcccagttccgaagacatiglj_02ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagcttggtccctccgccgaataccaiglj_03ggggcagccttgggctgacctaaaatgatcagctgggttcctccaccaaatacaaiglj_04ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagctcggtcccctcaccaaacaccciglj_05ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagctccgtcccctcaccaaacaccciglj_06ggggcagccttgggctgaccgaggacggtcaccttggtgccactgccgaacacatiglj_07ggggcagccttgggctgaccgaggacggtcagctgggtgcctcctccgaacacagiglj_08ggggcagccttgggctgaccgagggcggtcagctgggtgcctcctccgaacacag
[0089]
s5、将s4得到的抗体可变区基因表达盒转导入293t细胞48小时内表达抗体并收集上清，用 elisa法检测上清的rbd特异性，筛选rbd特异性全人源单克隆抗体。
[0090]
(a)使用pbs稀释抗原(终浓度2μg/ml)，10μl/孔，包被384孔elisa板4℃过夜或37℃包被 2h(本实施例优选4℃过夜)。note：加完后瞬时离心保证液体在底部。
[0091]
实验体系如下表8所示：
[0092]
试剂名称货号原浓度终浓度稀释比sars-cov-2rbdcat:40592-v08h200μg/ml2μg/ml1:100goat pab to hu igg－alpcat:ab972211mg/ml2μg/ml1:500
[0093] (b)配制pbst(0.05％tween 20，cat#tb220)：1l的pbs加入0.5ml的tween 20；
[0094]
pbst机洗板子(thermoscientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使 用微孔板离心机(mpc-p25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)。
[0095]
封闭：80μl的5％bsa(biofroxx，cat.no:4240gr100)(pbst配制)加入上述洗好的
板子里， 放置于37℃的孵育箱孵育1h。pbst机洗板子或者手洗。
[0096]
(c)加样及标准品。其中，标准品：10μl/well原浓度1μg/ml，梯度稀释为250ng/ml、125ng/ml、 62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.9ng/ml和1.95ng/ml。(封闭液稀释)；样品： 转染抗体基因的细胞上清液。阴性对照/空白孔：封闭液10μl/well。
[0097]
在37℃孵育30min。pbst机洗板子或者手洗。
[0098]
(d)加二抗，加入的浓度为10μl/well，然后在37℃下孵育30min。
[0099]
实验体系如下表9所示：
[0100]
二抗名称货号原浓度终浓度稀释比goat-anti-human igg-alpa188081.5mg/ml0.3μg/ml1:5000goat pab to hu igg-alpab985320.5mg/ml0.25μg/ml1:2000
[0101]
pbst机洗板子或者手洗。10μl/well的pnpp(对硝基苯磷酸二钠)，使用(thermoscientific muttiskango)检测5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min和 60min的od(450mm)值。50mg的pnpp粉末(thermo，prod#34045) 40ml的ddh2o 10ml的 diethanol aminesubstrate buffer(5x)，pnpp避光4℃储存。
[0102]
实验结果如图5所示，图5中od值大于0.1为阳性。
[0103]
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技 术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更， 但都将落入本发明的保护范围内。