细胞的制作方法

细胞
发明领域
1.本发明涉及特异性结合靶免疫细胞的抗原识别受体的效应免疫细胞，尤其涉及控制靶细胞杀伤此类效应免疫细胞的方法。
2.发明背景
3.预防排斥
4.在实体器官移植或造血干细胞移植(hsct)中，受体和供体之间的hla错配可分别导致器官排斥或移植物抗宿主病(gvhd)。免疫抑制药物可以减轻这些后果，但由于它们对免疫细胞具有广泛的抑制作用，它们会增加机会性感染的风险。
5.经由其t细胞受体(tcr)识别错配hla的同种异体反应性t细胞是排斥和gvhd的主要介导物。cd8 t细胞特异性由克隆型tcr决定，该克隆型tcr可识别mhc i类分子上呈递的短抗原肽。mhc i类分子是非共价异二聚体，其由膜整合的高度多态性α链和非膜附接的非多态性β2微球蛋白(β2m)组成。
6.margalit等人((2002)international immunology 15:1379-1387)描述了将tcr配体转化为t细胞激活受体的方法。他们描述了表达β2微球蛋白多肽的t细胞，该多肽包含跨膜结构域和附接到c末端的cd3ζ衍生的胞内域和经由接头附接到n末端的抗原肽。发现此类细胞表达高水平的表面肽i类复合物，并以肽特异性方式对抗体和靶t细胞作出响应。通过在t细胞中表达此类肽-接头-β2m-tm-cd3ζ多肽，可能特异性靶向识别特定抗原肽的致病性cd8＝t细胞。
7.car-t细胞
8.传统上，抗原特异性t细胞是通过选择性扩增对靶抗原具有天然特异性的外周血t细胞而产生的。然而，选择和扩增对大多数癌症抗原特异的大量t细胞是困难的，而且通常是不可能的。使用整合载体的基因疗法为这一问题提供了解决方案，因为嵌合抗原受体(car)的转基因表达允许通过体外病毒载体转导大量外周血t细胞而产生大量对任何表面抗原特异的t细胞。
9.嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mab)的特异性移植到t细胞的效应功能上的蛋白质。它们通常的形式是i型跨膜结构域蛋白，具有抗原识别性氨基末端、间隔物、跨膜结构域，所有这些都与传递t细胞存活和激活信号的复合胞内域连接。
10.这些分子的最常见形式是经由间隔物和跨膜结构域与信号传导胞内域融合的衍生自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的融合体。此类分子导致t细胞响应于scfv对其靶标的识别而激活。当t细胞表达此类car时，它们会识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的car，并且使用此类表达car的t细胞的过继转移方法目前正在临床试验中用于治疗各种癌症。
11.输注后，car t细胞在受体体内植入并在遇到靶标承载细胞后增殖。然后car t细胞会持续存在，并且它们的群体会随着时间的推移而缓慢缩小。在临床研究中，car t细胞的持久性可以通过血液样本中转基因的实时pcr或血液样本中car的流式细胞术来确定，临床研究人员发现持久性和持续响应之间存在相关性。这种相关性在b型急性淋巴母细胞白
血病(all)的cd19 car治疗中尤为明显。通常在这种情况下，car t细胞移植的丧失预示着白血病的复发。
12.car t细胞可导致细胞介导的免疫应答的激活，其可以引发对car t细胞的排斥。这是由于工程化到细胞中的组分的免疫原性，通过非自身蛋白或通过由用于制造受体的自身蛋白和其他工程化组分之间的连接形成的非自身序列。
13.car是人工蛋白质，通常由靶向结构域、间隔物结构域、跨膜结构域和信号传导结构域构成。靶向结构域通常来源于可以是鼠类的scfv。虽然此类scfv可以是人的或人源化的并且其他组分单独来源于自身蛋白，但它们之间的连接仍然可以是免疫原性的。例如，在scfv中，重链与接头之间以及接头与轻链之间存在连接。然后在scfv和间隔物结构域之间存在连接。如果跨膜结构域与间隔物不连续，则那里有另一个连接。类似地，如果跨膜结构域与胞内域的氨基末端部分不连续，则那里还有一个连接点。最后，大多数胞内域至少有两个组分并且有时更多，并且每个组分之间都有连接。
14.此外，car t细胞通常经工程化而具有其他组分。这些组分包括自杀基因(例如hsv-tk酶)。发现这种酶具有高度免疫原性，并在单倍体相合造血干细胞移植的深度免疫抑制背景之外导致car t细胞的细胞免疫耗竭。其他免疫原性较低的自杀基因仍可能提供一些免疫原性，因为几乎每一种涉及两个蛋白质之间的融合或异种蛋白质的使用的工程化组分都能够具有免疫原性。
15.在许多情况下，car t细胞是由自体t细胞产生的。在这种情况下，不会发生同种异体反应(allo-responses)。在一些情况下，使用来自同种异体供体的t细胞。例如，如果患者已经进行了同种异体造血干细胞移植就会发生这种情况。在这种情况下，收获的t细胞将是同种异体的。否则，由于化疗引起的淋巴细胞减少，患者可能没有足够的t细胞来产生car t细胞产品。
16.同种异体细胞的排斥可以由于次要错配或主要错配。在同种异体t细胞是人类白细胞抗原(hla)与受体匹配的情况下会发生次要错配。在这种情况下，由于次要组织相容性抗原发生排斥，这些抗原是个体之间的非hla差异，导致在hla上呈递非自身(供体)表位/免疫原性肽。在供体和受体错配或仅部分匹配的情况下，受体内源性t细胞上的t细胞受体(tcr)可以以非特异性方式与错配的hla相互作用，因此导致排斥。次要和主要形式的同种异体排斥都是由hla与tcr相互作用引起的。
17.wo2019/073248和gb申请号904971.7描述了一种方法，其涉及将表达car的细胞上的i类或ii类mhc与t细胞上的tcr的结合偶联，以直接或间接诱导表达car的细胞中的信号传导。当向受试者施用表达car的细胞时，该细胞上的mhc i类或ii类通过识别肽/mhc复合物与受试者中存在的任何内源性反应性t细胞相互作用。受试者中的任何此类反应性t细胞都会因表达car的细胞激活细胞毒性介导的细胞杀伤而耗竭。
18.car介导的治疗t细胞恶性肿瘤的方法
19.淋巴样恶性肿瘤主要可分为来源于t细胞或b细胞的恶性肿瘤。t细胞恶性肿瘤是一组临床上和生物学上异质性病症，共包括10-20％的非霍奇金淋巴瘤和20％的急性白血病。最常鉴定的组织学亚型是非特指型外周t细胞淋巴瘤(ptcl-nos)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)和间变性大细胞淋巴瘤(alcl)。在所有急性淋巴母细胞白血病(all)中，约20％是t细胞表型。
20.与例如b细胞恶性肿瘤相比，这些疾病通常表现得具有攻击性，预计5年生存率仅为30％。在t细胞淋巴瘤的情况下，它们与高比例的患者出现播散性疾病、不利的国际预后指标(ipi)评分和结外疾病的患病率有关。单独的化疗通常不是有效的，并且少于30％的患者通过目前的治疗治愈。
21.wo2015/132598描述了一种方法，由此可能耗竭受试者体内的恶性t细胞，而不影响很大一部分的健康t细胞。具体地，wo2015/132598描述了特异性结合tcrβ恒定区1(trbc1)或trbc2的car。
22.上述所有方法都涉及靶t细胞上的t细胞受体的特异性结合。在这种情况下，靶向的t细胞可以由于其tcr的连接而“反击”，导致移植的/期望的t细胞的耗竭。
附图说明
23.图1—(a)mhc i类分子复合物，其由mhc和b2m构成；(b)tcr复合物，其由cd3组分包围的tcrα/β链构成。
24.图2—(a)b2m-z构建体：b2m构建体在框架内与跨膜结构域和cd3-ζ胞内域融合；(b)b2m-tcr双特异性构建体：识别b2m的scfv与识别cd3/tcr复合物的第二scfv用接头融合。然后经由跨膜结构域将其锚定在膜上；(c)b2m和cd3/tcr之间的融合：作为示例，显示了b2m经由柔性接头与cd3ε之间的融合。
25.图3—(a)示出经典的car的示意图。(b)至(d)：car胞内域的不同代和排列：(b)最初的设计通过fcεr1-γ或cd3ζ胞内域单独传输itam信号，而后来的设计在相同的复合胞内域中传输另外的(c)一个或(d)两个共刺激信号。
26.图4—示出mhc i类car的示意图
27.主要组织相容性复合物(mhc)i类car是由两条非共价连接的多肽链α和β2-微球蛋白(β2m)构成的异二聚体。α1和α2亚基与负载肽一起与t细胞表面上表达的t细胞受体(tcr)结合。β2-微球蛋白与将分子锚定在细胞膜中的跨膜结构域连接，并进一步与向细胞传输细胞内信号的胞内域连接。胞内域可以由一个或多个信号传导结构域构成。
28.图5—示出三种可能的基于β2m的car设计的示意图
29.在第一个car(a)中，β2-微球蛋白经由桥连接于cd3ζ跨膜结构域，然后cd3ζ跨膜结构域与cd3ζ胞内结构域连接。其他两种car设计(b和c)分别添加了41bb或cd28共刺激结构域。
30.图6—(a)由α链和β链构成的天然存在的mhc ii类分子复合物，例如hla-drα和hla-drβ以及呈递肽；(b)与cd79相联的包含α和β链的mhc ii类分子，其包含cd79α和cd79β，它们可以都含有信号传导结构域；(c)包含α链和β链的工程化mhc ii类分子，其中α链包含信号传导结构域。
31.图7—mhc i类和tcr
32.(a)mhc i类分子是由α和β2-微球蛋白(b2m)两条多肽链组成的异二聚体；(b)由经cd3组分包围的tcrα/β链构成的tcr复合物。
33.图8—不同的mhciα/tcr融合构建体
34.(a)mhciα-cd3z构建体：mhc i类α链在框内与tm结构域和cd3-ζ胞内域融合；(b)ab-cd3z构建体：对mhc i类α链有特异性的抗体或抗体样结合物与tm结构域和cd3ζ胞内域
融合；(c)mhciα和cd3/tcr之间的融合：作为示例，显示了mhc i类α链经由柔性接头与cd3ε之间的融合；(d)mhciα-tcr bite构建体：识别mhc i类α链的scfv与识别cd3/tcr复合物的第二scfv用接头融合。然后经由跨膜结构域将其锚定在膜上。
35.图9—mhc ii类和tcr
36.(a)mhc ii类分子是由α链和β链组成的异二聚体；(b)由经cd3组分包围的tcrα/β链构成的tcr复合物。
37.图10—不同mhcii/tcr融合构建体
38.(a)mhcii-cd3z构建体：mhc ii类α或β链与tm结构域和cd3-ζ内胞内域融合；(b)ab-cd3z构建体：对mhc ii类α或β链有特异性的抗体或抗体样结合物与tm结构域和cd3ζ胞内域融合；(c)mhcii和cd3/tcr之间的融合：mhc i类α或β链经由柔性接头与tcr/cd3复合物的组分融合。例如，显示了cd3ε；(d)mhcii-tcr bite构建体：识别mhc ii类α或β链的scfv与识别cd3/tcr复合物的第二scfv用接头融合。然后经由跨膜结构域将其锚定在膜上。
39.图11—cd4/cd8融合分子
40.cd4和cd8是tcr共受体。cd4的细胞外结构域与mhc ii类的β2区域结合；而cd8的细胞外结构域结合i类mhc分子的α3部分。(a)cd4-cd3z构建体：cd4的mhc ii类结合结构域与tm结构域和cd3-ζ胞内域融合；(b)cd8-cd3z构建体：cd8的mhc i类结合结构域与tm结构域和cd3ζ胞内域融合。
41.图12—数据显示trbc1 靶t细胞杀伤(反向杀伤)表达缺乏信号传导结构域的截短版本的trbc1特异性car的细胞。
42.图13—数据显示在有或没有dpdl1(或dpdl2)的情况下jovi(或djovi)car t细胞的持久性。
43.图14—示出csk和各种dncsk构建体的示意图
44.a—具有sh3结构域、sh2结构域和蛋白质酪氨酸激酶结构域的野生型csk。
45.b—缺乏激酶结构域的dncsk。
46.c—缺乏激酶结构域和sh3结构域的dncsk。
47.d—具有突变k222r的dncsk。
48.图15—示出以下机制的示意图：(a)t细胞激活；和(b)通过抑制性免疫受体抑制t细胞激活。
49.图16—显示在不存在他克莫司(tacrolimus)的情况下，与jurkat ko、jurkat trbc1和jurkat trbc2靶细胞共培养96小时后表达car(rqr8阳性)的细胞增殖的(a)百分比和(b)数量的图表。
50.图17—显示在存在20ng/ml他克莫司的情况下，与jurkat ko、jurkat trbc1和jurkat trbc2靶细胞共培养96小时后表达car(rqr8阳性)的细胞增殖的(a)百分比和(b)数量的图表。
51.图18—显示在不存在他克莫司的情况下，与jurkat ko、jurkat trbc1和jurkat trbc2靶细胞共培养后每次分裂中表达car(rqr8阳性)的细胞数量的图表。使用flowjo
tm
增殖工具对单个/活/细胞痕量紫阳性细胞计算进行增殖分析，并将cd19 car用作所有条件的阴性对照。对于每个car 目标组合，将每次分裂中的细胞数量绘图。
52.图19—显示在存在20ng/ml他克莫司的情况下，与jurkat ko、jurkat trbc1和
jurkat trbc2靶细胞共培养后每次分裂中表达car(rqr8阳性)的细胞数量的图表。使用flowjo
tm
增殖工具对单个/活/细胞痕量紫阳性细胞计算进行增殖分析，并将cd19 car用作所有条件的阴性对照。对于每个car 目标组合，将每次分裂中的细胞数量绘图。
53.图20—直方图显示在添加或不添加20ng/ml他克莫司的情况下，与jurkat ko、jurkat trbc1和jurkat trbc2靶细胞共培养后表达car(rqr8阳性)的细胞的增殖。使用flowjo
tm
增殖工具对单个/活/细胞痕量紫阳性细胞计算进行增殖分析，并将cd19 car用作所有条件的阴性对照。使用来自两个不同供体的细胞显示结果。
54.图21—图表显示在添加或不添加20ng/ml他克莫司的情况下，与trbc2靶标共培养之前(第0天)和之后(第4天)非转导细胞(nt)和表达trbc2 car(rqr8阳性)的细胞的细胞计数。
55.图22—图表显示在添加或不添加20ng/ml他克莫司的情况下，与trbc2靶标共培养之前(第0天)和之后(第4天)表达trbc2 car(rqr8阳性)的细胞的百分比。
56.图23—图表显示在与转导表达cd19 car、trbc2 car或共表达trbc2 car和钙调磷酸酶突变体模块(trbc2 cnb30)的pbmcs共培养后，表达trbc2的pbmcs的杀伤。在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，以1:1或1:4的e:t比例建立共培养物。
57.图24—图表显示在与表达trbc2的pbmc共培养后，转导表达cd19 car、trbc2 car或共表达trbc2 car和钙调磷酸酶突变体模块(trbc2 cnb30)的pbmc的存活/增殖。在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，以1:1或1:4的e:t比例建立共培养物。
58.图25—图表显示表达trbc2的pbmc在与转导表达cd19 car、trbc2 car或共表达trbc2 car和钙调磷酸酶突变体模块(trbc2 cnb30)的pbmc共培养后的ifnγ分泌。在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，以1:1或1:4的e:t比例建立共培养物。
59.图26—图表显示表达trbc2的pbmc在与转导以表达cd19 car、trbc2 car或共表达trbc2 car和钙调磷酸酶突变体模块(trbc2 cnb30)的pbmc共培养后的il-2分泌。在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，以1:1或1:4的e:t比例建立共培养物。
60.发明概述
61.本发明的发明人已经开发了用于工程化效应免疫细胞(细胞a)的方法，使得当靶向自身反应性或致病性免疫细胞(细胞b)时，工程化的免疫细胞具有选择性优势，并且细胞a杀伤细胞b与细胞b杀伤细胞a之间的平衡倾向于细胞a杀伤细胞b。
62.因此，在第一方面，本发明提供了效应免疫细胞，其表达特异性结合靶免疫细胞的抗原识别受体的细胞表面受体或受体复合物，该效应免疫细胞是工程化的，使得当效应免疫细胞和靶免疫细胞之间形成突触时，效应免疫细胞杀伤靶免疫细胞的能力大于靶免疫细胞杀伤效应免疫细胞的能力。
63.在本发明第一方面的第一个实施方案中，效应免疫细胞是工程化的以对免疫抑制剂有抗性。
64.例如，效应免疫细胞可以是工程化的以对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂有抗性。
65.在这一方面，效应免疫细胞可以表达：
66.钙调磷酸酶a，其包含参照如seq id no.65所示的突变t351e和l354a；
67.钙调磷酸酶a，其包含参照如seq id no.65所示的突变v314r和y341f；或
68.钙调磷酸酶b，其包含参照如seq id no.66所示的突变l124t和k-125-la-ins。
69.效应免疫细胞可以是工程化的以对雷帕霉素有抗性。
70.效应免疫细胞可以表达显性负性的c末端src激酶(dncsk)，其赋予对多种免疫抑制剂的抗性。
71.在本发明第一方面的第二个实施方案中，效应免疫细胞是工程化的以表达或过表达免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白。
72.免疫抑制分子可以结合：pd-1、lag3、tim-3、tigit、btla、vista、ceacam1-r、kir2dl4、b7-h3或b7-h4。
73.免疫抑制分子可以选自：pd-l1、pd-l2、hvem、cd155、vsig-3、半乳糖凝集素-9、hla-g、ceacam-1、lsectin、fgl1、b7-h3和b7-h4。
74.效应免疫细胞可以是工程化的以表达包含免疫抑制分子的细胞外结构域和膜定位结构域的融合蛋白。
75.效应免疫细胞可以是工程化的以表达包含免疫抑制分子的细胞外结构域和共刺激胞内域的融合蛋白，如共刺激胞内域选自下组中的一种：cd28、icos、ctla4、41bb、cd27、cd30、ox-40、taci、cd2、cd27和gitr。
76.靶免疫细胞的抗原识别受体可以是，例如，t细胞受体(tcr)或激活杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kar)。
77.效应免疫细胞的细胞表面受体可以是，例如，嵌合抗原受体(car)并且抗原识别受体是t细胞受体(tcr)。
78.在效应免疫细胞表达tcr特异性car的情况下，该car可以结合tcrβ恒定区1(trbc1)或trbc2。
79.可替代地，效应免疫细胞的细胞表面受体复合物可以是工程化的mhc i类或工程化的mhc ii类复合物。
80.例如，细胞表面受体复合体可以包含：与细胞内信号传导结构域连接的mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白。
81.细胞表面受体复合物可以是工程化的mhc i类复合物，其包含具有以下结构的分子：
82.肽-l-b2m-endo
83.其中：
[0084]“肽”是结合mhc i类α链的肽结合沟的肽；
[0085]“l”是接头；
[0086]“b2m”是β-2微球蛋白；并且
[0087]“endo”是细胞内信号传导结构域。
[0088]
效应免疫细胞可以包含与tcr/cd3复合物的组分连接的mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白。
[0089]
效应免疫细胞可以包含mhc i类多肽：经由接头肽与cd3-ζ、cd3-ε、cd3-γ或cd3-δ连接的mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白。
[0090]
效应免疫细胞可以表达双特异性多肽，该双特异性多肽包含：(i)结合mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白的第一结合结构域；和(ii)与tcr/cd3复合物的组分结合的第二结合结构域。
[0091]
效应免疫细胞可以表达工程化的多肽，该多肽包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79α和/或cd79β链。
[0092]
效应免疫细胞可以表达工程化的多肽，该多肽包含与细胞内信号传导结构域连接的结合mhc i类多肽或mhc ii类多肽的结合结构域。该结合结构域可以是抗体样结合结构域。
[0093]
效应免疫细胞可以表达工程化的多肽，该多肽包含与细胞内信号传导结构域连接的cd4的mhc ii类结合结构域或cd8的mhc i类结合结构域。
[0094]
本发明的第一方面的效应免疫细胞可以是工程化的以表达细胞表面受体(诸如car)或受体复合物(诸如工程化的mhc i类或工程化的mhc ii类复合物)，然后进一步工程化，使得当效应免疫细胞与靶免疫细胞之间形成突触时，效应免疫细胞杀伤靶免疫细胞的能力大于靶免疫细胞杀伤效应免疫细胞的能力。
[0095]
进一步工程化效应免疫细胞可以涉及：
[0096]
(i)工程化改造该细胞以对免疫抑制剂有抗性，或
[0097]
(ii)工程化改造该细胞以表达或过表达免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白
[0098]
如上文所述。
[0099]
效应免疫细胞与靶免疫细胞之间形成的突触是当效应免疫细胞的细胞表面受体或受体复合物特异性结合靶免疫细胞的抗原识别受体而形成的。
[0100]
在第二方面，提供了核酸构建体，其包含：
[0101]
(i)第一核酸序列，其编码如本文所定义的细胞表面受体或细胞表面受体复合物的部分；和
[0102]
(ii)第二核酸序列，其当在细胞中表达时，赋予该细胞以对免疫抑制剂的抗性；和/或
[0103]
(iii)第三核酸序列，其编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白。
[0104]
在第三方面，提供了载体，其包含根据本发明第二方面的核酸构建体。
[0105]
在第四方面，提供了载体试剂盒，其包含：
[0106]
(i)第一载体，其包含编码如本文所定义的细胞表面受体或细胞表面受体复合物的部分的核酸序列；和
[0107]
(ii)第二载体，其包含当在细胞中表达时，赋予该细胞以对免疫抑制剂的抗性的核酸序列；和/或
[0108]
(iii)第三载体，其包含编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白的核酸序列。
[0109]
在第五方面，提供了药物组合物，其包含多个根据本发明第五方面的效应免疫细胞。
[0110]
在第六方面，提供了根据本发明第五方面的药物组合物用于治疗疾病。
[0111]
在第七方面，提供了治疗疾病的方法，其包含向受试者施用根据本发明第五方面的药物组合物的步骤。
[0112]
该方法可以包括以下步骤：
[0113]
(i)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含多个根据本发明第一方面的工程化的以对免疫抑制剂有抗性的效应免疫细胞；和
[0114]
(ii)向受试者施用免疫抑制剂。
[0115]
在第八方面，提供了根据本发明第一方面的多个效应免疫细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
[0116]
疾病可以是癌症。
[0117]
在第九方面，提供了制备根据本发明第一方面的效应免疫细胞的方法，其包括将根据本发明第二方面的核酸构建体、根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的载体试剂盒离体引入细胞的步骤。
[0118]
在第十方面，提供了从免疫细胞群中耗竭同种异体反应性免疫细胞的方法，其包括使免疫细胞群与多个根据本发明第一方面的效应免疫细胞接触的步骤，其中多个效应免疫细胞表达如本文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物。
[0119]
在第十一方面，提供了治疗或预防同种异体移植后移植物排斥的方法，其包括将来源于供体受试者的多个效应免疫细胞施用给受体受试者以进行同种异体移植的步骤，其中多个效应免疫细胞表达如本文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物。
[0120]
在第十二方面，提供了治疗或预防与同种异体移植相关的移植物抗宿主病(gvhd)的方法，其包括使同种异体移植物与施用多个根据本发明第一方面的效应免疫细胞接触的步骤，其中多个效应免疫细胞表达如本文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物。
[0121]
同种异体移植可以包括同种异体或自体免疫细胞的过继转移。
[0122]
在第十三方面，提供了同种异体移植物，其已通过根据本发明第十二方面的方法耗竭同种异体反应性免疫细胞。
[0123]
发明详述
[0124]
一些临床应用涉及生成效应免疫细胞，该效应免疫细胞通过识别其抗原识别受体来识别和耗竭一部分正常免疫细胞。
[0125]
在这种情况下，靶向的正常的免疫细胞可以“反击”，导致该效应免疫细胞耗竭。本发明涉及对效应免疫细胞进行工程改造，使得其比靶免疫细胞具有免疫学“优势”，使得当效应免疫细胞和靶免疫细胞之间形成突触时，效应免疫细胞将占优势。
[0126]
存在该效应细胞可以发生“反击”的多种情况，包括：
[0127]
(i)效应免疫细胞表达特异性结合t细胞的t细胞受体的car的情况；
[0128]
(ii)效应免疫细胞表达工程化的mhc i或ii复合物，使得其耗竭同种异体反应性或自身反应性t细胞的情况。
[0129]
下文将更详细地解释这些情况。
[0130]
针对tcr复合物的嵌合抗原受体
[0131]
本发明的效应免疫细胞可以表达嵌合抗原受体(car)。具体地，它可以表达特异性结合t细胞受体(tcr)或tcr:cd3复合物的组分的car。
[0132]
经典的嵌合抗原受体(car)是嵌合i型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)与细胞内信号传导结构域(胞内域)连接(参见图3)。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但它可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。间隔物结构域可用于将结合物与膜分离并允许其具有合适的取向。常用的间隔物结构域是igg1的
fc。更紧凑的间隔物可以足够，例如来自cd8α的茎(stalk)，甚至只是igg1铰链，这取决于抗原。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔物连接到胞内域。
[0133]
早期的car设计具有衍生自fcεr1或cd3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输的免疫信号1，足以触发t细胞杀伤同源靶细胞，但未能完全激活t细胞以增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：将t细胞共刺激分子的细胞内部分与cd3ζ的胞内域融合产生第二代受体，该受体可以在抗原识别后同时传输激活和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是cd28的共刺激结构域。这提供了最有效的共刺激信号——即触发t细胞增殖的免疫信号2。还描述了一些受体，其包括tnf受体家族胞内域，诸如密切相关的传输生存信号的ox40和41bb。现在已经描述了甚至更有效的第三代car，其具有能够传输激活、增殖和存活信号的胞内域。
[0134]
当car结合靶抗原时，这会导致激活信号传输到该car在上其表达的t细胞。因此，car将t细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶抗原的肿瘤细胞。
[0135]
因此，car通常包含：(i)抗原结合结构域；(ii)间隔物；(iii)跨膜结构域；(iii)胞内域，其包含信号传导结构域或与信号传导结构域相连。
[0136]
car可以具有通式结构：
[0137]
抗原结合结构域-间隔物结构域-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域(胞内域)。
[0138]
抗原结合结构域
[0139]
抗原结合结构域是car的识别抗原的部分。在经典car中，抗原结合结构域包含：衍生自单克隆的单链可变片段(scfv)。也已经用结构域抗体(dab)、vhh或基于fab的抗原结合结构域生产car。
[0140]
可替代地，car可以包含靶抗原的配体。例如，已经描述了结合b细胞成熟抗原(bcma)的car，其具有基于配体增殖诱导配体(april)的抗原结合结构域。
[0141]
间隔物
[0142]
经典的car包含间隔物序列，以连接抗原结合结构域和跨膜结构域，并将抗原结合结构域与胞内域在空间上分开。柔性的间隔物允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进结合。
[0143]
多种序列通常用作car的间隔物，例如igg1 fc区、igg1铰链或人cd8茎。
[0144]
wo2016/151315描述了形成卷曲螺旋结构域并形成多聚体car的间隔物。例如，其描述了基于形成五聚体的软骨寡聚基质蛋白(comp)的间隔物。comp间隔物可以包含如seq id no.1所示的序列或其保留形成卷曲螺旋并因此形成多聚体的能力的截短形式。
[0145]
seq id no.1(comp间隔物)
[0146]
dlgpqmlrelqetnaalqdvrellrqqvreitflkntvmecdacg
[0147]
跨膜结构域
[0148]
跨膜结构域是car的跨越膜的部分。跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的α螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域都可用于提供car的跨膜部分。本领域技术人员可以使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)确定蛋白质跨膜结构域的存在和跨度。可替代地，可以使用人工设计的tm结构域。
[0149]
胞内域
[0150]
胞内域是car的信号传输部分。它可以是car细胞内结构域的一部分或与car细胞内结构域相关。抗原识别后，受体簇、天然的cd45和cd148被排除在突触之外，并将信号传输给细胞。最常用的胞内域组分是包含3个itam的cd3ζ的胞内域组分。其在抗原结合后将激活信号传输给t细胞。cd3ζ可能无法提供完全有效的激活信号，并且可能需要另外的共刺激信号。共刺激信号促进t细胞增殖和存活。有两种主要类型的共刺激信号：属于ig家族(cd28、icos)和tnf家族(ox40、41bb、cd27、gitr等)的共刺激信号。例如，嵌合的cd28和ox40可与cd3ζ一起使用以传输增殖/存活信号，或三者可以一起使用。
[0151]
胞内域可以包含：
[0152]
(i)含有itam的胞内域，诸如来自cd3ζ的胞内域；和/或
[0153]
(ii)共刺激结构域，诸如来自cd28或icos的胞内域；和/或
[0154]
(iii)传输生存信号的结构域，例如tnf受体家族胞内域，诸如ox-40、4-1bb、cd27或gitr。
[0155]
已描述许多系统，其中抗原识别部分位于与信号传输部分分开的分子上，诸如wo015/150771、wo2016/124930和wo2016/030691所描述的那些。因此，本发明的car可以包含抗原结合组分，该抗原结合组分包含抗原结合结构域和跨膜结构域；其能够与分开的包含信号传导结构域的细胞内信号传导组分相互作用。本发明的载体可以表达包含此类抗原结合组分和细胞内信号传导组分的car信号传导系统。
[0156]
car可以包含信号肽，使得当它在细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后被引导至其所表达的细胞表面。信号肽可以在分子的氨基末端。
[0157]
靶抗原
[0158]“靶抗原”是被car的抗原结合结构域特异性识别和结合的实体。
[0159]
靶抗原可以是癌细胞上存在的抗原，例如肿瘤相关抗原。
[0160]
多种肿瘤相关抗原(taa)是已知的，如以下表1所示。car可以能够结合此类taa。
[0161]
表1
[0162]
癌症类型taa弥漫性大b细胞淋巴瘤cd19、cd20、cd22乳腺癌erbb2、muc1amlcd13、cd33神经母细胞瘤gd2、ncam、alk、gd2b-cllcd19、cd52、cd160结直肠癌叶酸结合蛋白、ca-125慢性淋巴细胞白血病cd5、cd19神经胶质瘤egfr、波形蛋白多发性骨髓瘤bcma、cd138肾细胞癌碳酸酐酶ix、g250前列腺癌psma肠癌a33
[0163]
本发明的效应免疫细胞可以与靶t细胞上的t细胞受体(tcr)复合物结合。具体地，本发明的效应免疫细胞可以与靶t细胞上的tcr复合物的tcrβ-恒定区(trbc)结合。
[0164]
t细胞受体(tcr)在t淋巴细胞表面表达，负责识别与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的抗原。当tcr与抗原性的肽和mhc(肽/mhc)结合时，t淋巴细胞通过相关酶、共受体、特化的衔接分子、以及激活的或释放的转录因子介导的一系列生化事件而被激活。
[0165]
tcr是一种二硫键连接的膜锚定异二聚体，通常由高度可变的αlpha(α)和beta(β)链组成，表达为与不变的cd3链分子一起形成的复合物的一部分。表达该受体的t细胞称为α:β(或αβ)t细胞(～95％的总t细胞)。少数t细胞表达备选的由可变的gamma(γ)和delta(δ)链形成的受体，称为γδt细胞(～5％的总t细胞)。
[0166]
每个α和β链由两个细胞外结构域组成：可变(v)区和恒定(c)区，两个免疫球蛋白超家族(igsf)结构域都形成反向平行的β-折叠。恒定区接近细胞膜，然后是跨膜区和短的细胞质尾部，而可变区与肽/mhc复合物结合。tcr的恒定区由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。
[0167]
tcrα链和β链的可变结构域都具有三个高变区或互补决定区(cdr)。β链的可变区也有一个另外的高变区(hv4)，然而，这通常不接触抗原，因此不被认为是cdr。
[0168]
tcr还包含最多五个不变链γ、δ、ε(统称为cd3)和ζ。cd3和ζ亚基通过特定的细胞质结构域介导tcr信号传导，这些特定的细胞质结构域在αβ或γδ识别抗原后与第二信使和衔接分子相互作用。tcr复合物的细胞表面表达以亚基的成对组装为先导，其中tcrα和β以及cd3γ和δ的跨膜域和细胞外结构域都起作用。
[0169]
因此，tcr通常由cd3复合物和tcrα和β链组成，它们又由可变区和恒定区组成。
[0170]
提供tcrβ-恒定区(trbc)的基因座(chr7:q34)在进化历史中重复产生了两个几乎相同且功能上等同的基因：trbc1和trbc2，它们在成熟蛋白质中相差4个氨基酸。每个tcr将以互相排斥的方式包含trbc1或trbc2，因此，每个αβt细胞将以互相排斥的方式表达trbc1或trbc2。
[0171]
效应免疫细胞可以能够以互相排斥的方式选择性地结合trbc1或trbc2。
[0172]
如上文所述，每个αβt细胞表达包含trbc1或trbc2的tcr。在克隆性t细胞病症中，诸如t细胞淋巴瘤或白血病，衍生自同一克隆的恶性t细胞将全部表达trbc1或trbc2。
[0173]
当向患有t细胞淋巴瘤或白血病的患者施用trbc1或trbc2特异性car-t细胞时，结果是恶性t细胞以及与恶性t细胞表达相同trbc的正常t细胞的选择性耗竭，但此类治疗不会引起表达与恶性t细胞不同的另一种trbc的正常t细胞显著耗竭。
[0174]
因为trbc选择性car-t细胞不会引起表达与恶性t细胞不同的另一种trbc的正常t细胞显著耗竭，它不会引起整个t细胞区室的耗竭。保留一定比例的受试者t细胞区室(即不表达与恶性t细胞相同的trbc的t细胞)导致降低的毒性以及降低的细胞和体液免疫缺陷，从而降低感染风险。
[0175]
结合trbc1的car-t细胞
[0176]
对trbc1和trbc2特异的car-t细胞在国际申请号wo2015/132598中描述。
[0177]
选择性结合trbc1的car可具有可变重链(vh)和可变轻链(vl)，其包含以下互补决定区(cdr)：
[0178]
vh cdr1:gytftgy(seq id no.2)；
[0179]
vh cdr2:npyndd(seq id no.3)；
[0180]
vh cdr3:gagynfdgayrffdf(seq id no.4)；
[0181]
vl cdr1:rssqrlvhsngntylh(seq id no.5)；
[0182]
vlcdr2:rvsnrfp(seq id no.6)；和
[0183]
vl cdr3:sqsthvpyt(seq id no.7)。
[0184]
与seq id no.8至13给出的序列相比，一个或多个cdr各自独立地可以或可以不包含一个或多个氨基酸突变(例如取代)，条件是所得抗体保留选择性结合trbc1的能力。
[0185]
trbc1选择性car的抗原结合结构域可以包含具有如seq id no.8所示氨基酸序列的可变重链(vh)和具有如seq id no.9所示氨基酸序列的可变轻链(vl)。
[0186]
seq id no.8(hjovi-1 vh)
[0187]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyvmhwvrqapgqglewmgfinpynddiqsnerfrgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycargagynfdgayrffdfwgqgtmvtvss
[0188]
seq id no.9(hjovi-1 vl)
[0189]
divmtqsplslpvtpgepasiscrssqrlvhsngntylhwylqkpgqsprlliyrvsnrfpgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycsqsthvpytfgqgtkleik
[0190]
car可以包含具有如seq id no.10所示的氨基酸序列的scfv。
[0191]
seq_id_10jovi-1scfv
[0192]
evrlqqsgpdlikpgasvkmsckasgytftgyvmhwvkqrpgqglewigfinpynddiqsnerfrgkatltsdkssttaymelssltsedsavyycargagynfdgayrffdfwgqgttltvssggggsggggsggggsdvvmtqsplslpvslgdqasiscrssqrlvhsngntylhwylqkpgqspklliyrvsnrfpgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgiyfcsqsthvpytfgggtkleikr
[0193]
结合trbc2的car-t细胞
[0194]
对trbc2特异性的car-t细胞在国际申请号pct/gb2019/053100中描述。
[0195]
trbc 2特异性car可以具有与具有具有seq id no:7所示序列的vh结构域和具有seq id no:8所示序列的vl结构域的参考抗体相比在vh结构域中包含至少一个突变的抗原结合结构域，其中vh结构域中的至少一个突变选自t28k、y32k和a100n。此类抗原结合结构域应显示出高于结合trbc-1的参考抗体jovi-1的对trbc2的亲和力。
[0196]
变体抗原结合结构域可以包含vh结构域中选自t28k、y32k和a100n的至少两个突变。例如，它可以包含突变y32k和a100n。变体抗原结合结构域可进一步包含vh结构域中的突变t28r，或者，可替代地，vh结构域中的突变g31k。
[0197]
变体抗原结合结构域可以包含t28k、y32k和a100n突变。
[0198]
变体抗原结合结构域可进一步包含至少一个突变，该突变位点选自：vh结构域中的v2、y27、g31、r98、y102、n103和a107、vl结构域中的n35和vl结构域中的r55。至少一个进一步的突变可以选自：
[0199]
a)vh结构域中的：
[0200]-v2k、v2r，
[0201]-y27f、y27m、y27n、y27w，
[0202]-g31k、g31r、g31s，
[0203]-r98k、
[0204]-y102f、y102l，
[0205]-n103a、n103e、n103f、n103h、n103l、n103m、n103q、n103s、n103w、n103y，
[0206]-a107s，
[0207]
和
[0208]
b)vl结构域中的：
[0209]-n35m、n35f、n35y、n35k、n35r和
[0210]-r55k。
[0211]
变体抗原结合结构域可以选自包含以下突变组合的变体抗原结合结构域：
[0212]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n和vl结构域中的n35k，
[0213]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n，
[0214]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y27n，
[0215]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、g31k，
[0216]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y27m，
[0217]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y27w，
[0218]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n和vl结构域中的r55k，
[0219]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103h，
[0220]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103a，
[0221]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103y，
[0222]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n和vl结构域中的n35r，
[0223]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s和vl结构域中的n35m，
[0224]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103m，
[0225]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103w和vl结构域中的n35r，
[0226]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n和vl结构域中的n35f，
[0227]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s和vl结构域中的n35k，
[0228]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、r98k，
[0229]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s和vl结构域中的n35r，
[0230]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l，
[0231]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s和vl结构域中的n35f，
[0232]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s和vl结构域中的n35y，
[0233]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l和vl结构域中的n35m，
[0234]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l和vl结构域中的n35r，
[0235]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103w和vl结构域中的n35k，
[0236]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l和vl结构域中的n35y，
[0237]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103f，
[0238]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103w，
[0239]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l和vl结构域中的n35k，
[0240]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103l和vl结构域中的n35f，
[0241]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103w和vl结构域中的n35m，
[0242]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103f和vl结构域中的n35y，
[0243]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y27f，
[0244]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103q，
[0245]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103s，
[0246]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103m和vl结构域中的n35f，
[0247]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103f和vl结构域中的n35m，
[0248]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103f和vl结构域中的n35f，
[0249]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、g31r，
[0250]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103w和vl结构域中的n35f，
[0251]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、v2r，
[0252]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、g31s，
[0253]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、a107s，
[0254]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103e和vl结构域中的n35m，
[0255]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、v2k，
[0256]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103e，
[0257]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102f、n103m和vl结构域中的n35k，
[0258]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102f、n103m和vl结构域中的n35f，
[0259]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102f、n103m和vl结构域中的n35r，
[0260]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102f和vl结构域中的n35r，
[0261]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103m和vl结构域中的n35m，
[0262]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103m和vl结构域中的n35y，
[0263]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103m和vl结构域中的n35r，
[0264]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、n103f和vl结构域中的n35k，
[0265]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102l、n103w和vl结构域中的n35r，
[0266]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102l、n103w和vl结构域中的n35k，
[0267]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102f，和
[0268]-vh结构域中的t28k、y32f、a100n、y102l、n103m和vl结构域中的n35r。
[0269]
变体抗原结合结构域可以包含vh结构域中的t28k、y32f、a100n突变和vl结构域中的n35k突变。
[0270]
变体抗原结合结构域可以包含vh结构域中的t28k、y32f和a100n突变。
[0271]
工程化的mhc i或ii复合物
[0272]
主要组织相容性复合物(mhc)是脊椎动物dna上的一个大基因座，其含有一组紧密连接的多态基因，这些基因编码对获得性免疫系统至关重要的细胞表面蛋白质。mhc是允许免疫系统(更具体地说是t细胞)结合、识别和耐受自身(自我识别)的组织抗原。mhc还是与mhc复合并作为潜在外来抗原呈递给t细胞受体(tcr)的细胞内肽的分子伴侣。mhc与tcr及其共受体相互作用，以在抗原结合亲和力和特异性以及信号转导有效性方面优化tcr-抗原相互作用的结合条件。
[0273]
基本上，mhc-肽复合物是自身抗原/同种异体抗原的复合物。结合后，t细胞原则上应该耐受自身抗原，但在暴露于同种异体抗原时会激活。
[0274]
mhc分子与t淋巴细胞上的t细胞受体和cd4/cd8共受体结合，mhc分子的肽结合沟中的抗原表位与tcr的可变ig样结构域相互作用以触发t细胞激活。
[0275]
mhc i类分子在所有有核细胞和血小板中都有表达—实质上是除红细胞外的所有
细胞。mhc i类将肽表位呈递给细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。除tcr外，ctl还表达cd8受体。当ctl的cd8受体与mhc i类分子对接时，如果ctl的tcr与mhc i类分子内的表位匹配，则ctl触发细胞通过凋亡进行程序性细胞死亡。因此，mhc i类帮助介导细胞免疫，这是解决细胞内病原体诸如病毒和某些细菌的主要方法。在人中，mhc i类包括hla-a、hla-b和hla-c分子。
[0276]
mhc-i分子是异二聚体，它们具有基因出现在mhc基因座内的多态性重α亚基以及基因通常位于mhc基因座外部的小的不变的β2微球蛋白亚基。mhc-i分子的多态性重链包含由三个结构域α1、α2和α3构成的n端细胞外区域、将mhc-i分子固定在细胞表面的跨膜螺旋、以及短的细胞质尾部。两个结构域α1和α2在两个长α螺旋之间形成一个深的肽结合沟，沟的底部由8个β链形成。免疫球蛋白样结构域α3参与与cd8共受体的相互作用。β2微球蛋白提供复合物的稳定性，并参与cd8共受体对肽-mhc i类复合物的识别。该肽与mhc-i非共价结合，它由肽结合沟底部的几个口袋固定。人等位基因中最具多态性的氨基酸侧链填充了结合沟的中央和最宽的部分，而保守的侧链则聚集在沟的较窄端。
[0277]
mhc ii类可以由所有细胞类型有条件地表达，但通常仅发生在“专业的”抗原呈递细胞(apc)上：巨噬细胞、b细胞，尤其是树突状细胞(dc)。apc摄取抗原蛋白，实施抗原加工，并返回该蛋白质的分子部分—抗原表位—并将其展示在mhc ii类内部偶联的apc的表面上(抗原呈递)。在细胞表面，t细胞受体(tcr)等免疫结构可以识别表位。
[0278]
辅助t细胞表面有cd4受体以及tcr。当初始辅助t细胞的cd4分子与apc的mhc ii类分子对接时，它的tcr可以遇到并结合在mhc ii类内部偶联的表位。该事件启动初始t细胞。
[0279]
ii类mhc分子也是异二聚体，α和β亚基的基因都是多态性的，并且位于mhc ii类亚区域内。mhc-ii分子的肽结合沟由异二聚体α1和β1两个亚基的n端结构域形成；这与mhc-i分子不同，mhc-i分子涉及相同链的两个结构域。此外，mhc-ii的两个亚基都含有可被cd4共受体识别的跨膜螺旋结构域和免疫球蛋白结构域α2或β2。以这种方式，这种类型的淋巴细胞的mhc分子伴侣决定哪种类型的淋巴细胞以高亲和力结合给定的抗原，因为不同的淋巴细胞表达不同的t细胞受体(tcr)共受体。
[0280]
本发明的效应免疫细胞可以包含与细胞内信号传导结构域连接的mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白。
[0281]
肽特异性方法
[0282]
cd8 t细胞是移植物排斥和移植物抗宿主病的关键介导物，并促成自身免疫性疾病的发病机制。如上文所述，它是通过表达β2微球蛋白多肽将tcr配体转化为t细胞激活受体，该β2微球蛋白多肽包括附接到一端的细胞内信号传导结构域和经由接头附接到另一端的抗原肽。发现经工程化改造以表达此类分子的细胞表达高水平的表面肽-i类复合物，呈递抗原肽并以肽特异性方式对抗体和靶t细胞作出反应。通过在效应免疫细胞诸如t细胞中表达此类肽-接头-信号传导结构域多肽，可能特异性靶向识别特定抗原肽的致病性cd8-t细胞。
[0283]
因此，本发明的效应免疫细胞可以包含工程化的mhc i类复合物，其包含具有以下结构的分子：
[0284]
肽-l-b2m-endo
[0285]
其中：
[0286]“肽”是结合mhc i类α链的肽结合沟的肽；
[0287]“l”是接头；
[0288]“b2m”是β-2微球蛋白；并且
[0289]“endo”是细胞内信号传导结构域。
[0290]
肽可以是同种异体抗原或自身抗原。
[0291]
自身免疫性病症的特征在于免疫系统对内源性抗原的反应性，从而损伤组织。已经表征，超过80种慢性自身免疫性疾病事实上几乎影响到身体的每个器官系统。最常见的自身免疫性疾病是胰岛素依赖型糖尿病(iddm)、多发性硬化症(ms)、系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎、几种形式的贫血(恶性的(pernicious)、可塑性的(plastic)、溶血性的)、甲状腺炎和葡萄膜炎。
[0292]
同种异体移植物排斥通常是由针对外来器官或组织的压倒性适应性免疫应答引起的。它是器官移植的主要危险因素，也是移植后并发症的原因。与骨髓(bm)移植相关的主要并发症，称为移植物抗宿主(gvh)反应或移植物抗宿主病(gvhd)发生在至少一半的患者身上，此时在移植的供体淋巴细胞注射到免疫系统受损的同种异体受体，开始攻击宿主组织，而宿主的受损状态阻止了针对移植物的免疫应答。
[0293]
接头将肽连接到β-2微球蛋白并提供柔性，使得肽可以结合相关mhc分子的肽结合沟。例如，它可以包含5-20个氨基酸，或10-15个氨基酸。
[0294]
分子还可以包含肽桥以将β-2微球蛋白桥连到细胞膜。肽桥可以包含hla-a2的细胞外部分的13个近膜氨基酸，其具有序列lrwepssnptipi(seq id no.11)。
[0295]
分子可以包含膜靶向结构域，诸如跨膜结构域。举例来说，cd8α和cd28的跨膜结构域分别如seq id no:12和seq id no:13所示。
[0296]
seq id no:12(cd8α跨膜结构域)
[0297]
iyiwaplagtcgvlllslvitly
[0298]
seq id no:13(cd28跨膜结构域)
[0299]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvr
[0300]
人β-2微球蛋白的氨基酸序列可从uniprot登录号p61769获得，并且如下文seq id no.14所示。
[0301]
seq id no.14(人β-2微球蛋白)
[0302]
msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdll
[0303]
kngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm
[0304]
工程化的mhc i类复合物可以包含如seq id no.14所示的β-2微球蛋白序列的变体，例如与seq id 14所示序列具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸同一性的变体，条件是所得的肽-l-b2m-endo分子保留与mhc i类α链结合的能力。
[0305]
来自人cd3ζ的胞内域具有如seq id no.15所示的序列。
[0306]
seq id no.15(人cd3ζ胞内域)
[0307]
srsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0308]
工程化的mhc i类复合物可以包含具有如seq id no.15所示序列的细胞内信号传导结构域或与如seq id 15所示序列具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸同一性的变体，条件是所得的肽-l-b2m-endo分子保留在tcr识别后触发效应免疫细胞激活的能力。
[0309]
下文描述了进一步的细胞内信号传导结构域和共刺激结构域。
[0310]
肽不可知(agnostic)的方法
[0311]
可以将效应免疫细胞上的mhc i类或ii类与靶免疫细胞上的tcr结合偶联，以直接或间接地在效应细胞中诱导信号传导。在这些方法中，mhc信号传导系统能够呈递与相应的内源mhc i类和ii类分子相同范围的肽。因此，任何由mhc i类或ii类分子天然呈递的肽都由工程化的mhc复合物呈递。这包括可以是免疫原性的的衍生自任何异种或连接序列的肽，例如可衍生自细胞表达的嵌合抗原受体。在同种异体环境中，这也可能包括次要组织相容性抗原。因此，此类工程化的mhc类复合物将通过肽/mhc复合物的识别而与工程化细胞的受体中存在的任何内源性、反应性t细胞相互作用。因此，可通过本发明的细胞激活细胞毒性介导的细胞杀伤来耗竭反应性t细胞。因此，可以降低针对本发明的细胞的细胞免疫应答。
[0312]
在这方面，效应免疫细胞可以包含能够共定位的多肽：mhc i类多肽、mhc ii类多肽或具有细胞内信号传导结构域的β-2微球蛋白。
[0313]
效应免疫细胞可以包含：
[0314]
(i)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的来自mhc i类多肽的胞外域或来自mhc ii类多肽的胞外域；或与细胞内信号传导结构域连接的β-2微球蛋白(参见图2a、4、5、6c、8a和10a)；
[0315]
(ii)工程化的多肽，其包含与cd3/tcr复合物的组分(诸如cd3ζ、cd3ε、cd3γ或cd3δ)连接的mhc i类多肽或mhc ii类多肽或β-2微球蛋白(参见图2c、8c和10c)；
[0316]
(iii)工程化的多肽，其包含结合结构域，诸如抗体样结合结构域，其与与细胞内信号传导结构域连接的mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白结合(参见图8b和10b)；
[0317]
(iv)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79α或cd79β(参见图6b)；
[0318]
(v)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的cd4的mhc ii类结合结构域；或与细胞内信号传导结构域连接的cd8的mhc i类结合结构域(参见图11)。
[0319]
可替代地，效应免疫细胞可被工程化以表达双特异性多肽，所述双特异性多肽包含：(i)结合mhc i类多肽、mhc ii类多肽、β-2微球蛋白的第一结合结构域；和(ii)与tcr/cd3复合物的组分结合的第二结合结构域(参见图2b、8d和10d)。
[0320]
hla i类
[0321]
mhc i类分子是由α多肽和β2-微球蛋白(b2m)两条多肽链组成的异二聚体。两条链经由b2m和α3结构域的相互作用非共价连接。α链是多态的，并且在人中，由人类白细胞抗原基因复合物(hla)编码。b2m亚基不是多态的，由β-e巨球蛋白基因编码。hla基因。对应于mhc i类的hla是hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g。
[0322]
hla-a、hla-b和hla-c通常是非常多态的，而hla-e、hla-f、hla-g的多态性较低。
[0323]
本发明的效应细胞的工程化的多肽可以包含hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g的细胞外结构域。
[0324]
由本发明的效应细胞表达的工程化的多肽或双特异性多肽可以结合hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。
[0325]
最常见的单倍型在群体中有所不同。因此，根据本发明的效应免疫细胞可以被设计用于具有特定常见单倍型的特定群体。下表总结了示例性的i类单倍型：
[0326]
表2.示例性常见单倍型
[0327]
hla-ahla-bhla-chla-a02hla-b08hla-c01hla-a03hla-b07 hla-a01hla-b44 hla-a29hla-b15 hla-a30hla-b35 [0328]
hla i类—hla-a的氨基酸序列是如seq id no:16所示的hla-a01：
[0329]
seq id no:16
[0330][0331]
在如seq id no.16至22所示的序列中：
[0332]
胞外域＝无格式文本
[0333]
粗体/下划线＝跨膜
[0334]
斜体＝胞内域
[0335]
hla i类—hla-a的氨基酸序列是如seq id no:17所示的hla-a02：
[0336]
seq id no:17
[0337][0338]
hla i类—hla-a的氨基酸序列是如seq id no:18所示的hla-a03：
[0339]
seq id no:18
[0340][0341]
hla i类—hla-b的氨基酸序列是如seq id no:19所示的hla-b07：
[0342]
seq id no:19
[0343][0344][0345]
hla i类—hla-b的氨基酸序列是如seq id no:20所示的hla-b08：
[0346]
seq id no:20
[0347][0348]
hla i类—hla-b的例示性的氨基酸序列是如seq id no:21所示的hla-b44：
[0349]
seq id no:21
[0350][0351]
hla i类—hla-c的氨基酸序列是如seq id no:22所示的hla-c01：
[0352]
seq id no:22
[0353][0354][0355]
本发明的效应细胞的工程化的多肽可以包含seq id nos 16至22中任一项的细胞外结构域，或其具有至少80、85、90、95、98或99％同一性的变体，条件是该变体保留与β2-微球蛋白链组装并促进mhc i类复合物的生产性肽呈递的能力。
[0356]
工程化的多肽还可以包含跨膜结构域。
[0357]
跨膜结构域可以是能够插入并跨越细胞膜的任何肽结构域。跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的α螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域都可用于提供本发明的跨膜部分。本领域技术人员可以使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)确定蛋白质跨膜结构域的存在和跨度。此外，鉴于蛋白质的跨膜结构域是相对简单的结构，即预测形成长度足以跨越膜的疏水性α螺旋的多肽序列，也可以使用人工设计的tm结构域(us 7052906 b1描述了合成的跨膜组分)。例如，跨膜结构域可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以例如衍生自cd8α或cd28。
[0358]
hla ii类
[0359]
在人中，mhc ii类蛋白质复合物由人类白细胞抗原基因复合物(hla)编码。对应于mhc ii类的hla是hla-dp、hla-dm、hla-doa、hla-dob、hla-dq和hla-dr。
[0360]
激活的人t细胞在其表面表达所有同种型(hla-dr、hla-dq和hla-dp)的mhc ii类分子。发现mhc ii类分子的表达大约在t细胞激活后3至5天，与t细胞受体(tcr)触发和共刺激后各种其他效应分子的诱导相比，这是一个相对较晚的事件。由于过继转移的免疫效应物预计会在输注后的某个时间点被激活，hla ii类的表达可导致同种异体排斥。
[0361]
hla ii类分子形成为两条多肽链：α和β。这些通常是从一个个体到另一个个体高度多态的，尽管一些单倍型在某些群体中比其他更常见。
[0362]
用于任何单倍型或任何单倍型组合的多肽可以用于本发明中，包括下表中列举的任何多肽：
[0363]
表3.示例性常见单倍型
[0364]
hla-drbhla-drb03hla-drb15hla-drb04hla-drb07hla-drb01
[0365]
hla-dr具有非常小的多态性，使其特别适用于本发明。在一个实施方案中，工程化的多肽包含来自hla-dr的胞外域和细胞内信号传导结构域。胞外域可以来自hla-drα或hla-drβ。
[0366]
hla ii类组织相容性抗原，drα链(其具有uniprotkb登录号p01903)的氨基酸序列如seq id no:23所示：
[0367]
seq id no:23
[0368][0369]
粗体下划线＝该hladrα序列的胞外域对应于该序列的氨基酸位置26-216。
[0370]
工程化的多肽可以包含来自如seq id no:23所示的hla-drα的胞外域(诸如从seq id no:23的约氨基酸26至约氨基酸216)或其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的变体，条件是该变体保留与β链组装并促进mhc ii类复合物的生产性肽呈递的能力。
[0371]
hla ii类组织相容性抗原，drβ链(其具有uniprotkb登录号q04826)的氨基酸序列如seq id no:24所示：
[0372]
seq id no:24
[0373]
[0374][0375]
粗体下划线＝该hla-drβ序列的胞外域并且对应于该序列的氨基酸位置25-308。
[0376]
工程化的多肽可以包含来自如seq id no:24所示的hla-drβ的胞外域(诸如从seq id no:24的约氨基酸25至约氨基酸308)或其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的变体，条件是该变体保留与α链组装并促进mhc ii类复合物的生产性肽呈递的能力。
[0377]
hla-dp和hla-dq具有多态的α和β链。因此，可以选择常见的hla-dp或hla-dqα或β链，并仅从具有该单倍型的受体中限制同种异体产生。合适地，受体可以是该单倍型的纯合子。当受体对于单倍型不是纯合的时，可以使用两个hla-dp和两个hla-dq(任选地与hla-dr例如hla-drα组合)。
[0378]
hla ii类组织相容性抗原dp(其具有uniprotkb登录号q30058)的氨基酸序列如seq id no:25所示：
[0379]
seq id no.25
[0380][0381]
斜体＝跨膜区并且对应于氨基酸位置225至244。
[0382]
粗体下划线＝该hla-dp序列的胞外域并且对应于该序列的氨基酸位置29-224。
[0383]
工程化的多肽可以包含来自如seq id no:25所示的hla-dp的胞外域(诸如从seq id no:25的约氨基酸29至约氨基酸224)或其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的变体，条件是该变体保留组装并促进mhc ii类复合物的生产性肽呈递的能力。
[0384]
hla ii类组织相容性抗原dq(其具有uniprotkb登录号o19764)的氨基酸序列如seq id no:26所示：
[0385]
seq id no.26
[0386][0387]
斜体＝跨膜区并且对应于氨基酸位置229至249。
[0388]
粗体下划线＝该hla-dq序列的胞外域并且对应于该序列的氨基酸位置32-228。
[0389]
工程化的多肽可以包含来自如seq id no:26所示的hla-dq的胞外域(诸如从seq id no:26的约氨基酸32至约氨基酸228)或其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性的变体，条件是该变体保留组装并促进mhc ii类复合物的生产性肽呈递的能力。
[0390]
工程化的多肽可以包含来自seq id no.23至26中任一项的细胞外结构域。工程化的多肽还可以包含跨膜结构域，如上文所述。
[0391]
immunogenetics(imgt)数据库中提供了mhc多肽的序列(lefranc,m.-p.等人,nucleic acids res.,27:209-212(1999)；doi:10.1093/nar/27.1.209)。
[0392]
两个多肽序列之间的百分比同一性可以很容易地通过程序诸如blast确定，该程序可在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得。适当地，百分比同一性是跨越整个参考和/或查询序列确定的。
[0393]
如本文所用，“能够将mhc i类多肽或mhc ii类多肽与细胞内的细胞内信号传导结构域共定位”是指，当靶t细胞结合本发明的效应免疫细胞上的肽/mhc复合物时，多肽将mhc i类多肽或mhc ii类多肽与细胞内信号传导结构域共定位，使得细胞内信号传导结构域在本发明的效应免疫细胞中传输激活信号。
[0394]
cd79
[0395]
cd79由两条链cd79α和cd79β组成，这两条链在b细胞表面形成异二聚体。cd79αa/β与膜结合的免疫球蛋白组装形成与b细胞受体(bcr)的复合物。cd79α和cd79β是免疫球蛋白超家族的成员，并且含有itam信号传导基序，这些基序可实现b细胞信号传导以响应bcr对同源抗原的识别。
[0396]
cd79α和cd79β也与hla ii类相关，允许hla ii类以类似于膜结合免疫球蛋白的方式通过cd79传递信号(lang,p.等人,science 291,1537
–
1540(2001)和jin,l.等人,immunol.lett.116,184
–
194(2008)。
[0397]
在一方面，本发明提供了细胞，其包含：
[0398]
(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和
[0399]
(ii)至少一条能够将mhc i类多肽或mhc ii类多肽与细胞内的细胞内信号传导结构域共定位的多肽；其中该至少一条能够将mhc i类多肽或mhc ii类多肽与细胞内信号传导结构域共定位的多肽是cd79或其变体。
[0400]
细胞可以包含工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79α或cd79β。该细胞可以包含两种工程化的多肽：一种包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79α；一种包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79β。
[0401]
人cd79α(其具有uniprotkb登录号p11912)的氨基酸序列如seq id no:27所示:
[0402]
seq id no.27
[0403][0404]
下划线＝信号肽(氨基酸1-32)
[0405]
粗体＝细胞外的(氨基酸33-143)
[0406]
无格式＝跨膜结构域(氨基酸144-165)
[0407]
斜体＝细胞质结构域(氨基酸166-226)
[0408]
用于本发明的cd79α序列可以包含如seq id no:27所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体，条件是该变体保留与hla i类和/或hla ii类组装并促进信号传导的能力。
[0409]
工程化的多肽可以包含cd79α的胞外域、跨膜域和细胞内信号传导结构域。工程化的多肽可以包含cd79α的胞外域，其对应于seq id no.27的约氨基酸33至约氨基酸143。
[0410]
工程化的多肽可以包含cd79α的跨膜结构域，其对应于seq id no.27的约氨基酸144至约氨基酸165。
[0411]
工程化的多肽可以包含cd79α的细胞内信号传导结构域，其对应于seq id no.27的约氨基酸166至约氨基酸226。
[0412]
人cd79β(其具有uniprotkb登录号p40259)的氨基酸序列如seq id no:28所示:
[0413]
seq id no.28
[0414][0415]
下划线＝信号肽(氨基酸1-28)
[0416]
粗体＝细胞外的(氨基酸29-159)
[0417]
无格式＝跨膜结构域(氨基酸160-180)
[0418]
斜体＝细胞质的(氨基酸181-229)
[0419]
用于本发明的cd79β序列可以包含如seq id no:8所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体，条件是该变体保留与hla i类和/或hla ii类组装并促进信号传导的能力。
[0420]
工程化的多肽可以包含cd79β的胞外域、跨膜域和细胞内信号传导结构域。工程化的多肽可以包含cd79β的胞外域，其对应于seq id no.28的约氨基酸29至约氨基酸159。
[0421]
工程化的多肽可以包含cd79β的跨膜结构域，其对应于seq id no.28的约氨基酸
160至约氨基酸180。
[0422]
工程化的多肽可以包含cd79β的细胞内信号传导结构域，其对应于seq id no.28的约氨基酸181至约氨基酸229。
[0423]
效应免疫细胞可以表达两种工程化的多肽：一种包含cd79α的细胞外结构域，一种包含cd79β的细胞外结构域。
[0424]
连接cd3的多肽
[0425]
效应免疫细胞可以包含:
[0426]
(i)嵌合抗原受体(car)或转基因t细胞受体(tcr)；和
[0427]
(ii)工程化的多肽，其包含与cd3/tcr复合物的组分连接的mhc i类多肽或mhc ii类多肽。
[0428]
cd3是t细胞共受体，其参与细胞毒性t细胞和t辅助细胞的激活。它由由四个不同的链组成的蛋白质复合物形成。如本文所用，术语“cd3复合物”还包括cd3ζ-链。在哺乳动物中，该复合物包含一条cd3γ链、一条cd3δ链和两条cd3ε链。这些链与tcr缔合以生成能够在t淋巴细胞中产生激活信号的tcr复合物。
[0429]
cd3ζ、cd3γ、cd3δ和cd3ε链是含有单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cd3链的跨膜区含有许多带负电荷的天冬氨酸残基，这一特性允许这些链与带正电荷的tcr链缔合。cd3分子的细胞内尾部含有被称为免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的单个的保守基序，其涉及tcr信号传导。
[0430]
与tcr复合物的组分连接的多肽能够组装并促进细胞表面的mhc i类或mhc ii类复合物的生产性肽呈递。此外，tcr/cd3组分能够与tcr/cd3复合物组装。因此，tcr与包含与tcr复合物的组分连接的多肽的肽/mhc复合物的结合将触发通过cd3/tcr复合物的信号传导。
[0431]
多肽可以连接到tcr或cd3复合物的组分。多肽可以连接到缺乏可变结构域的工程化的tcr多肽。
[0432]
工程化的多肽可以连接到cd3复合物的组分，例如选自cd3-ζ、cd3-ε、cd3-γ和cd3-δ。
[0433]
人cd3ζ、cd3γ、cd3δ和cd3ε氨基酸序列的实例分别如seq id no:29-32所示。
[0434]
seq id no:29(cd3ζ
–
氨基酸1-21提供了可以被排除的信号肽，跨膜结构域加下划线)
[0435]
mkwkalftaailqaqlpiteaqsfglldpklcylldgilfiygviltalflrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0436]
seq id no:30(cd3γ
–
氨基酸1-22提供了可以被排除的信号肽)meqgkglavlilaiillqgtlaqsikgnhlvkvydyqedgsvlltcdaeaknitwfkdgkmigfltedkkkwnlgsnakdprgmyqckgsqnkskplqvyyrmcqncielnaatisgflfaeivsifvlavgvyfiagqdgvrqsrasdkqtllpndqlyqplkdreddqyshlqgnqlrrn
[0437]
seq id no:31(cd3δ
–
氨基酸1-21提供了可以被排除的信号肽)mehstflsglvlatllsqvspfkipieeledrvfvncntsitwvegtvgtllsditrldlgkrildprgiyrcngtdiykdkestvqvhyrmcqscveldpatvagiivtdviatlllalgvfcfaghetgrlsgaadtqallrndqvyqplrdrddaqyshlggnwar
nk
[0438]
seq id no:32(cd3ε
–
氨基酸1-22提供了可以被排除的信号肽)mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwqhndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarvcencmemdvmsvativivdicitggllllvyywsknrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerpppvpnpdyepirkgqrdlysglnqrri
[0439]
mhc i类/mhc ii类或b2m多肽可以通过任何合适的方式与cd3组分连接。例如，多肽可以通过接头肽与cd3复合物的组分融合。
[0440]
合适的接头肽是本领域已知的。例如，chen等人(adv drug deliv rev.2013october 15；65(10):1357
–
1369
–
具体参见表3)描述了一系列合适的接头肽。
[0441]
合适的接头是(sgggg)n(seq id no:33)，其包含一个或多个拷贝的seq id no:33。例如，合适的接头肽如seq id no:34所示。
[0442]
seq id no:34-sggggsggggsggggs
[0443]
多肽可以连接到cd3复合物的组分的胞外域。它可以与cd3复合物的组分的n端连接。
[0444]
用于本发明的示例性的多肽如seq id no:35所示。
[0445]
metdtlllwvlllwvpgstgikeehviiqaefylnpdqsgefmfdfdgdeifhvdmakketvwrleefgrfasfeaqgalaniavdkanleimtkrsnytpitnvppevtvltnspvelrepnvlicfidkftppvvnvtwlrngkpvttgvsetvflpredhlfrkfhylpflpstedvydcrvehwgldepllkhwefdapsplpettenvvcalgltvglvgiiigtifiirvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppra
[0446]
该多肽序列包含来自hla-drα的胞外域、跨膜结构域细胞内cd3-ζ胞内域。
[0447]
用于本发明的示例性的多肽如seq id no:36所示。
[0448]
metdtlllwvlllwvpgstgikeehviiqaefylnpdqsgefmfdfdgdeifhvdmakketvwrleefgrfasfeaqgalaniavdkanleimtkrsnytpitnvppevtvltnspvelrepnvlicfidkftppvvnvtwlrngkpvttgvsetvflpredhlfrkfhylpflpstedvydcrvehwgldepllkhwefdapsplpettenvvcalgltvglvgiiigtifiikrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppra
[0449]
该多肽序列包含来自hla-drα的胞外域、跨膜结构域、41bb胞内域和细胞内cd3-ζ胞内域。
[0450]
用于本发明的是示例性的多肽如seq id no:37所示。
[0451]
metdtlllwvlllwvpgstgikeehviiqaefylnpdqsgefmfdfdgdeifhvdmakketvwrleefgrfasfeaqgalaniavdkanleimtkrsnytpitnvppevtvltnspvelrepnvlicfidkftppvvnvtwlrngkpvttgvsetvflpredhlfrkfhylpflpstedvydcrvehwgldepllkhwefdapsplpettenvvcalgltvglvgiiigtifiirskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppra
[0452]
该多肽序列包含来自hla-drα的胞外域、跨膜结构域、cd28胞内域和细胞内cd3-ζ胞内域。
ii类复合物的生产性肽呈递，并在tcr与包含多肽的肽/mhc复合物结合后传输激活信号的能力。
[0471]
细胞内信号传导结构域
[0472]
本发明涉及提供至少一种能够将mhc i类多肽或mhc ii类多肽与细胞内的细胞内信号传导结构域共定位的多肽。
[0473]
本发明的工程化的多肽可以包含细胞内信号传导结构域。
[0474]
如本文所用的细胞内信号传导结构域是指胞内域的信号传输部分。
[0475]
细胞内信号传导结构域可以是或包含t细胞信号传导结构域。
[0476]
细胞内信号传导结构域可以包含一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序(itam)。itam是四个氨基酸的保守序列，在免疫系统的某些细胞表面蛋白的细胞质尾部中重复两次。该基序包含一个酪氨酸，该酪氨酸通过任何两个其他的氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸隔开，产生特征yxxl/i。这些特征中的两个通常由分子尾部的6到8个氨基酸隔开(yxxl/ix
(6-8)
yxxl/i)。
[0477]
itam对于免疫细胞中的信号转导很重要。因此，它们存在于重要的细胞信号传导分子(诸如t细胞受体复合物的cd3和ζ-链、b细胞受体复合物的cd79α和β链、以及某些fc受体)的尾部。这些基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并为参与细胞的信号传导通路的其他蛋白质形成对接位点。
[0478]
优选地，细胞内信号传导结构域组分包含含有三个itam的cd3-ζ胞内域、基本上由含有三个itam的cd3-ζ胞内域组成或由含有三个itam的cd3-ζ胞内域组成。经典地，cd3-ζ胞内域在抗原结合后将激活信号传输给t细胞。然而，在本发明的上下文中，在其mhc复合物与相邻的t细胞上的tcr相互作用后，cd3-ζ胞内域将激活信号传输给效应细胞。
[0479]
细胞内信号传导结构域可以包含另外的共刺激信号传导。例如，4-1bb(也称为cd137)可以与cd3-ζ一起使用，或cd28和ox40可以与cd3-ζ一起使用以传输增殖/生存信号。
[0480]
因此，细胞内信号传导结构域可以包含单独的cd3-ζ胞内域、cd3-ζ胞内域与一种或多种选自4-1bb、cd28或ox40胞内域的共刺激结构域的组合和/或4-1bb、cd28或ox40的部分或全部的组合。
[0481]
胞内域可以包含以下项的一种或多种：icos胞内域、cd2胞内域、cd27胞内域或cd40胞内域。
[0482]
胞内域可以包含如seq id no:44-47所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体，条件是该变体序列保留向细胞传输激活信号的能力。
[0483]
seq id no:44-cd3-ζ胞内域
[0484]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0485]
seq id no:45-4-1bb和cd3-ζ胞内域
[0486]
mgnscynivatlllvlnfertrslqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0487]
seq id no:46-cd28和cd3-ζ胞内域
[0488]
skrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0489]
seq id no:47-cd28、ox40和cd3-ζ胞内域
[0490]
skrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakirvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0491]
与信号传导结构域连接的抗原结合结构域
[0492]
本发明的工程化的多肽可以包含与mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β2微球蛋白结合的结合结构域，其与细胞内信号传导结构域连接。
[0493]
结合结构域可以是或包含抗体或抗体样分子。
[0494]
如本文所用，术语“抗体”是指具有抗原结合位点的多肽，该抗原结合位点包含至少一个互补决定区或cdr。抗体可以包含3个cdr并且具有与单结构域抗体(dab)、重链抗体(vhh)或纳米抗体等同的抗原结合位点。抗体可以包含6个cdr并且具有与经典抗体分子等同的抗原结合位点。多肽的剩余部分可以是为抗原结合位点提供合适的支架并以适当的方式展示它以使其结合抗原的任何序列。
[0495]
全长抗体或免疫球蛋白通常由四条多肽组成：两个相同拷贝的重(h)链多肽和两个相同拷贝的轻(l)链多肽。每条重链含有一个n端可变(vh)区和三个c端恒定(ch1、ch2和ch3)区，每条轻链含有一个n端可变(vl)区和一个c端恒定(cl)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。它们的特征在于相同的通式结构，由称为框架(fr)的相对保守的区域与称为互补决定区(cdr)的三个高变区连接组成。如本文所用，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体内与抗原的形状互补的区域。因此，cdr决定了蛋白质对特定抗原的亲和力和特异性。每对的两条链的cdr通过框架区对齐，获得结合特定表位的功能。因此，在vh和vl结构域的情况下，重链和轻链的特征都在于三个cdr，分别为cdrh1、cdrh2、cdrh3和cdrl1、cdrl2、cdrl3。
[0496]
本发明的工程化的多肽可以包含全长抗体或其抗原结合片段。
[0497]
全长抗体可以是，例如igg、igm、iga、igd或ige。
[0498]“抗体片段”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分。抗体片段可以包含，例如一个或多个cdr、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的示例包括但不限于fab片段、f(ab’)2片段、fv片段、单链fv(scfv)、结构域抗体(dab或vh)、单结构域抗体(sdab)、vhh、纳米抗体、双抗体、三抗体、三体(trimerbody)和单体(monobody)。
[0499]
本发明的工程化的多肽可以包含基于非免疫球蛋白支架的抗原结合结构域。这些抗体结合结构域也称为抗体模拟物。非免疫球蛋白抗原结合结构域的非限制性示例包括亲合体(affibody)、纤连蛋白人工抗体支架、anticalin、affilin、darpin、vnar、ibody、affimer、fynomeran、abdurin/纳米抗体、centyrin、alphabody、nanofitin和d结构域。
[0500]
已经描述了几种特异性结合mhc i类或mhc ii类的抗体。
[0501]
例如，以引用方式并入的wo05/023299描述了结合mhc ii类抗原的抗体，特别是针
对hla-drα链的抗体。该文件的表1包含以下克隆的序列特征：ms-gpc-1(scfv-17)、ms-gpc-6(scfv-8a)、ms-gpc-8(scfv-b8)和ms-gpc-10(scfv-e6)，并且图15给出了以下克隆的vh和vl序列：ms-gpc-1、ms-gpc-6、ms-gpc-8、ms-gpc-10、ms-gpc-8-6、ms-gpc-8-10、ms-gpc-8-17、ms-gpc-8-27、ms-gpc-8-6-13、ms-gpc-8-10-57、ms-gpc-8-27-41、ms-gpc-8-1、ms-gpc-8-9、ms-gpc-8-18、ms-gpc-8-6-2、ms-gpc-8-6-19、ms-gpc-8-6-27、ms-gpc-8-6-45、ms-gpc-8-6-47、ms-gpc-8-27-7和ms-gpc-8-27-10。
[0502]
工程化的多肽可以包含mhc ii类结合结构域，该结构域包含这些vh和vl序列对之一。具体地，工程化的多肽可以包含基于结合物ms-gpc-8的mhc ii类结合结构域。
[0503]
andris等人(1995mol immunol 32:14-15)描述了六种对人hla i类和ii类抗原特异的抗体，包括针对hla-dqβ链的抗体，该抗体的抗体克隆名称为抗hlaii/dqb1-mp1的。
[0504]
watkins等人(2000tissue antigens 55:219-28)描述了人单克隆hla-a2抗体的分离和表征。该抗体克隆包括：抗hla-a2/a28-3pf12、抗hla-a2/a28-3pc4和抗hla-a2/a28-3pb2。
[0505]
本发明的工程化的多肽可以包含衍生自任何这些抗体的mhc i类或mhc ii类结合结构域。
[0506]
工程化的多肽可以包含短的柔性接头以引入链断开。链断开将两个不同的结构域分开但允许以不同的角度定向。此类序列包括序列sdp和序列sgggsdp(seq id no:48)。
[0507]
接头可以包含丝氨酸-甘氨酸接头，诸如sggggs(seq id no:49)。
[0508]
工程化的多肽可以包含如上文所定义的跨膜结构域。工程化的多肽可以，例如包含cd8-α或cd28的跨膜结构域。
[0509]
工程化的多肽包含如上文所定义的细胞内信号传导结构域。工程化的多肽可以，例如包含cd3ζ胞内域。
[0510]
工程化的多肽可以具有通式结构：
[0511]
mhc i类或ii类结合结构域-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域，或
[0512]
mhc i类或ii类结合结构域-接头-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域
[0513]
cd4/cd8融合蛋白
[0514]
本发明的工程化的多肽可以包含与细胞内信号传导结构域连接的cd4的mhc ii类结合结构域，或与细胞内信号传导结构域连接的cd8的mhc i类结合结构域。
[0515]
cd4和cd8是t细胞受体(tcr)的共受体并协助t细胞与抗原呈递细胞进行交流。
[0516]
cd4(分化簇4)是存在于免疫细胞表面的糖蛋白，该免疫细胞诸如t辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。cd4是免疫球蛋白超家族的成员，具有暴露在细胞的细胞外表面的四个免疫球蛋白结构域(d1至d4)：d1，其类似于免疫球蛋白可变(igv)结构域；和d2、d3和d4，其类似于免疫球蛋白恒定(igc)结构域。
[0517]
d1的免疫球蛋白可变(igv)结构域采用免疫球蛋白样β-三明治折叠，在2个β-片层中具有七个β-链。cd4通过其d1结构域与mhc ii类分子的β2-结构域相互作用。因此，在其表面展示cd4分子的t细胞对mhc ii呈递的抗原具有特异性，即它们是mhc ii类受限的。
[0518]
cd4的短细胞质/细胞内尾部(c)含有允许其募集并与酪氨酸激酶lck相互作用的氨基酸序列。当cd4的细胞外d1结构域与mhc ii类的β2区结合时，产生的tcr复合物与cd4之间的紧密邻近允许酪氨酸激酶lck与cd4的细胞质尾部结合，以将cd3的细胞质结构域上的
免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的酪氨酸残基磷酸化，从而放大tcr产生的信号。cd3上的磷酸化的itam招募并激活含有sh2结构域的蛋白质酪氨酸激酶(ptk)，诸如zap70，以通过酪氨酸磷酸化进一步介导下游信号传导。这些信号导致包括nf-κb、nfat、ap-1在内的转录因子的激活，从而促进t细胞激活。
[0519]
人cd4的氨基酸序列可从uniprot登录号p01730获得。本发明的工程化的多肽可以包含cd4的d1结构域，其具有如seq id no.50所示的序列。gln40和thr45的位置以粗体和下划线显示。
[0520]
seq id no.50(cd4 d1结构域)
[0521][0522]
工程化的多肽可以包含cd4的变体d1结构域，其包含一个或多个氨基酸突变，与野生型d1结构域相比，该突变增加了其对mhc ii类的β2区域的结合亲和力。
[0523]
例如，wang等人(2011,pnas 108:15960-15965)描述了通过酵母表面展示使人cd4的亲和力成熟以增加cd4对hla-dr1的亲和力。与野生型cd4以kd》400μm与hla-dr1结合相比，发现携带取代突变gln40tyr和thr45trp的cd4变体以kd＝8.8μm与hla-dr1结合。
[0524]
工程化的多肽可以包含cd4的变体d1结构域，其包含参考如seq id no.50所示的序列在位置gln40和/或thr45的氨基酸突变。
[0525]
工程化的多肽可以包含cd4的变体d1结构域，其包含参考如seq id no.50所示的序列的氨基酸取代gln40tyr和/或thr45trp。
[0526]
cd8(分化簇8)共受体主要在细胞毒性t细胞表面表达，但也可见于自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突细胞。cd8有两个同种型，α和β，每个由不同的基因编码。
[0527]
为了发挥功能，cd8形成二聚体，由一对cd8链组成。最常见的cd8的形式由cd8-α和cd8-β链组成，但cd8-α链的同二聚体也在某些细胞上表达。cd8-α和cd8-β都是具有通过细柄与细胞膜连接的免疫球蛋白可变(igv)样细胞外结构域以及细胞内尾部的免疫球蛋白超家族的成员。
[0528]
cd8-α的细胞外igv样结构域与i类mhc分子的α3部分相互作用。主要识别位点是位于残基223和229之间的mhc分子的α3结构域上的柔性环。cd8-α与mhc i类的结合在抗原特异性激活过程中保留细胞毒性t细胞的t细胞受体和靶细胞紧密结合在一起。cd8共受体的胞质尾部与lck(淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶)相互作用。一旦t细胞受体与其特异性抗原结合，lck将tcr复合物的细胞质cd3和ζ链磷酸化，从而起始级联的磷酸化，最终导致转录因子如nfat、nf-κb和ap-1的激活。
[0529]
本发明的工程化的多肽可以包含来自cd8-α的igv样结构域。
[0530]
人cd8α的氨基酸序列可从uniprot登录号p01732获得。本发明的工程化的多肽可以包含cd8的ig样v型结构域，该结构域包含该序列的22-135位氨基酸残基，具有如seq id no.51所示的序列。
[0531]
seq id no.51(cd8αig样v型结构域)
[0532]
sqfrvspldrtwnlgetvelkcqvllsnptsgcswlfqprgaaasptfllylsqnkpkaaegldtqrfsgkrlgdtfvltlsdfrrenegyyfcsalsnsimyfshfvpvflpa
[0533]
工程化的多肽可以包含变体cd8αig样v型结构域，其包含一个或多个氨基酸突变，
与野生型cd8α结构域相比，该突变增加其对i类mhc分子的α3部分的结合亲和力。
[0534]
例如，高亲和力的cd8α的突变体可以使用wang等人(2011,pnas 108:15960-15965)描述的体外进化方法产生并表征。
[0535]
工程化的多肽可以包含二聚体形式的cd8。devine等人(1999,j.immunol.162:846-851)描述了一种分子，其包含两个cd8αig结构域，这两个cd8αig结构域通过肽间隔物的方式经由其中一个的羧基末端与另一个的氨基末端连接。使用具有4个ggggs(seq id no.52)重复单元的20个氨基酸的肽间隔物以允许2个ig样结构域采取正确的构象。
[0536]
工程化的多肽可以包含cd8αα同二聚体，如devine等人1999中所述。cd8αα同二聚体可以具有如seq id no.53所示的序列。
[0537]
seq id no.53(cd8αα同二聚体)
[0538]
sqfrvspldrtwnlgetvelkcqvllsnptsgcswlfqprgaaasptfllylsqnkpkaaegldtqrfsgkrlgdtfvltlsdfrrenegyyfcsalsnsimyfshfvpvflpaggggsggggsggggsggggssqfrvspldrtwnlgetvelkcqvllsnptsgcswlfqprgaaasptfllylsqnkpkaaegldtqrfsgkrlgdtfvltlsdfrrenegyyfcsalsnsimyfshfvpvflpa
[0539]
工程化的多肽可以包含cd8αβ异二聚体。例如，工程化的多肽可以包含具有如seq id no.51所示的序列的cd8αig样v型结构域，该结构域通过肽间隔物与cd8βig样v型结构域连接。肽间隔物的长度可以是10到20个，例如15到25个氨基酸。肽间隔物的长度可以是大约20个氨基酸。肽间隔物可以包含4个ggggs(seq id no.52)的重复单元，如devine等人1999所述的用于cd8αα同二聚体。
[0540]
cd8βig样v型结构域的氨基酸序列如下文seq id no.54所示。
[0541]
seq id no.54(cd8βig样v型结构域)
[0542]
lqqtpayikvqtnkmvmlsceakislsnmriywlrqrqapssdshheflalwdsakgtihgeeveqekiavfrdasrfilnltsvkpedsgiyfcmivgspeltfgkgtql
[0543]
工程化的多肽可以包含cd8αβ异二聚体，其中cd8α和cd8β结构域在构建体中以任一顺序排列，即cd8αβ或cd8βα。
[0544]
工程化的多肽可以在cd8α单体、cd8αα同二聚体或cd8αβ异二聚体与茎和/或跨膜结构域之间包含短的柔性接头以引入链断开。链断开将两个不同的结构域分开，但允许以不同的角度定向。此类序列包括序列sdp和序列sgggsdp(seq id no:48)。
[0545]
接头可以包含丝氨酸-甘氨酸接头，诸如sggggs(seq id no:49)。
[0546]
工程化的多肽可以包含如上文所定义的跨膜结构域。例如，工程化的多肽可以包含cd8-α或cd28的跨膜结构域。
[0547]
工程化的多肽包含如上文所定义的细胞内信号传导结构域。工程化的多肽可以，例如包含cd3ζ胞内域。
[0548]
工程化的多肽可以具有通式结构：
[0549]
cd4 d1结构域-接头-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；
[0550]
cd8αig样v型结构域-接头-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；
[0551]
cd8αα同二聚体-接头-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；或者
[0552]
cd8αβ同二聚体-接头-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域
[0553]
双特异性多肽
3pb2。
[0569]
本发明的双特异性多肽可以包含衍生自任何这些抗体的mhc i类或mhc ii类结合结构域。
[0570]
本发明的双特异性分子的第二结构域能够结合包含细胞内信号传导结构域的多肽或cd3复合物的组分。具体地，第二结构域可以能够结合t细胞表面上的cd3。在此方面，第二结构域可以包含cd3或tcr特异性抗体或其部分。
[0571]
第二结构域可以包含来自如seq id no:55所示的scfv序列的互补决定区(cdr)。
[0572]
第二结构域可以包含scfv序列，诸如seq id no:55所示的序列。第二结构域可以包含此类序列的变体，该变体具有至少80％的序列同一性并结合cd3。
[0573]
第二结构域可以包含特异性结合cd3的抗体或其部分，诸如okt3、wt32、抗leu-4、ucht-1、spv-3ta、tr66、spv-t3b或其经亲和力调节的变体。
[0574]
本发明的双特异性分子的第二结构域可以包含单克隆抗体okt3的全部或部分，okt3是fda批准的第一个单克隆抗体。okt3可以从atcc crl 8001获得。该抗体序列公开于us 7,381,803。
[0575]
第二结构域可以包含来自okt3的一个或多个cdr。第二结合结构域可以包含来自okt3的重链的cdr3和/或来自okt3的轻链的cdr3。第二结合结构域可以包含来自okt3的全部6个cdr，如下文所示。
[0576]
重链
[0577]
cdr1:(seq id no:56)kasgytftrytmh
[0578]
cdr2:(seq id no:57)inpsrgytnynqkfkd
[0579]
cdr3:(seq id no:58)yyddhycldy
[0580]
轻链
[0581]
cdr1:(seq id no:59)sasssvsymn
[0582]
cdr2:(seq id no:60)rwiydtsklas
[0583]
cdr3:(seq id no:61)qqwssnpft
[0584]
第二结合结构域可以包含scfv，scfv包含来自okt3的cdr序列。第二结合结构域可以包含如下文seq id no:55或62所示的scfv序列或其具有至少80％序列同一性的保留结合cd3的能力的变体。
[0585]
seq id no:55
[0586]
qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvsssggggsggggsggggsqivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinr
[0587]
seq id no:62
[0588]
qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinrsssggggsggggsggggsqvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss
[0589]
seq id no:55和62提供了适用于本发明的scfv的可选的架构。seq id no:55作为
vl-vh排列提供。seq id no:55作为vh-vl排列提供。
[0590]
来自seq id no:55或62的变体序列可以具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性，并具有与seq id no:55或62所示的序列等同的或提高的cd3结合能力。
[0591]
本发明的双特异性分子可以包含间隔物序列，以将第一结构域与第二结构域连接并在空间上将两个结构域分开。
[0592]
例如，第一和第二结合结构域可以经由短的五残基肽接头(ggggs)连接。
[0593]
例如，间隔物序列可以包含igg1铰链或cd8茎。接头可以可替代地包含具有与igg1铰链或cd8茎相似的长度和/或结构域间隔特性的可替代的接头序列。
[0594]
间隔物可以是短间隔物，例如包含少于100、少于80、少于60或少于45个氨基酸的间隔物。间隔物可以是或包含igg1铰链或cd8茎或其修饰型式。
[0595]
下文给出了这些接头的氨基酸序列的示例：
[0596]
seq id no:63(igg1铰链):aepkspdkthtcppcpkdpksggggs
[0597]
seq id no:64(cd8茎):
[0598]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
[0599]
cd8茎具有可以诱导同二聚体形成的序列。如果这不是想要的，可以从cd8茎的序列中取代或去除一个或多个半胱氨酸残基。本发明的双特异性分子可以包含间隔物，其包含或由如seq id no:64所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体组成，条件是该变体序列是引起第一和第二结构域的间距大致等同的分子，和/或该变体序列引起双特异性分子同源二聚化。
[0600]
本发明的双特异性分子可以具有通用公式：
[0601]
第一结构域-间隔物-第二结构域。
[0602]
间隔物还可以包含一个或多个接头基序以引入链断开。链断开将两个不同的结构域分开，但允许以不同的角度定向。此类序列包括序列sdp和序列sgggsdp(seq id no:48)。
[0603]
接头可以包含丝氨酸-甘氨酸接头，诸如sggggs(seq id no:49)。
[0604]
间隔物可以引起双特异性分子形成同二聚体，例如由于在间隔物中一个或多个半胱氨酸残基的存在，其可以与包含相同间隔物的另一分子形成二硫键。
[0605]
双特异性分子可以是膜系链的。换言之，双特异性分子可以包含跨膜结构域，使得其在本发明的细胞中表达后定位于细胞膜。
[0606]
举例而言，跨膜结构域可以是如本文所述的跨膜结构域。例如，跨膜结构域可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以衍生自cd8α或cd28。
[0607]
本发明的双特异性分子可以具有通用公式：
[0608]
第一域结构域-间隔物-第二结构域-跨膜结构域；或者
[0609]
跨膜结构域-第一结构域-间隔物-第二结构域。
[0610]
转基因t细胞受体
[0611]
本发明的工程化免疫细胞可以表达转基因t细胞受体(tcr)。
[0612]
t细胞受体(tcr)是在t细胞表面发现的分子，当肽与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合时其负责识别抗原片段。
[0613]
tcr是由两条不同的蛋白质链组成的异二聚体。在人中，在95％的t细胞中tcr由alpha(α)链和beta(β)链(分别由tra和trb编码)组成，而在5％的t细胞中，tcr由gamma和
delta(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。
[0614]
当tcr与抗原性的肽和mhc(肽/mhc)结合时，t淋巴细胞通过信号转导被激活。
[0615]
与传统的抗体导向的靶抗原不同，tcr识别的抗原可以包括潜在的细胞内蛋白质的整个阵列，这些蛋白质被加工并作为肽/mhc复合物传递到细胞表面。
[0616]
通过使用载体将tra和trb基因或trg和trd基因人工引入细胞以工程化改造细胞从而表达异源(即非天然)tcr分子是可能的。例如，可以将工程化tcr的基因重新引入自体t细胞并转移回患者体内进行t细胞过继治疗。此类“异源”tcr在本文中也可以称为“转基因tcr”。
[0617]
效应免疫细胞和细胞表面受体/受体复合物
[0618]
本发明的效应免疫细胞可以是溶细胞性免疫细胞，诸如t细胞、自然杀伤(nk)细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
[0619]
t细胞可以是α-βt细胞或γ-δt细胞。
[0620]
细胞可以源自于患者自身的外周血(第一方)，或在造血干细胞移植的情况下来自供体外周血(第二方)，或来自无关联的供体的外周血(第三方)。例如，可以在用编码本发明的多肽的核酸分子转导之前激活和/或扩增t或nk细胞，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理。
[0621]
可替代地，细胞可以来源于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为t细胞。可替代地，可以使用保留其溶解功能的永生化t细胞系。
[0622]
细胞可以是造血干细胞(hsc)。hsc可以通过以下方法获得用于移植：通过在通过施用药理学剂量的细胞因子诸如g-csf[外周血干细胞(pbsc)]动员后进行外周血的白细胞去除术从合适匹配的供体的骨髓中获得，或在分娩后从胎盘采集的脐带血(ucb)中获得。骨髓、pbsc或ucb可以不经加工就进行移植，或者hsc可以通过用针对cd34表面抗原的单克隆抗体进行免疫选择而进行富集。
[0623]
与靶免疫细胞的抗原识别受体结合的细胞表面受体或受体复合物可以是mhc i类受体或复合物、mhc ii类受体或复合物或tcr或tcr/cd3复合物。
[0624]
靶免疫细胞和抗原识别受体
[0625]
本发明的靶免疫细胞可以是溶细胞性免疫细胞，诸如t细胞、自然杀伤(nk)细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。
[0626]
靶免疫细胞可以存在于体外、离体或体内的免疫细胞群中。例如，靶免疫细胞在向患者施用之前可以在患者体内或移植物中。
[0627]
靶免疫细胞可以特异性识别自身抗原或同种异体抗原。
[0628]
靶免疫细胞的抗原识别受体可以是t细胞受体，诸如上文更详细描述的αβ-tcr或γδ-tcr。或者，抗原识别受体可以是nk细胞激活受体。存在负责触发nk介导的天然细胞毒性的两种不同的表面受体：nk kar(杀伤激活受体)和nk kir(杀伤抑制受体)，它们产生相反的信号。正是这些竞争信号之间的平衡决定了是否应该触发nk细胞的细胞毒性活性。
[0629]
kar通常具有在其细胞质尾部中含有免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的非共价连接的亚基，诸如cd3ζ、γc链或两种衔接蛋白dap10和dap12之一。与t细胞上的tcr类似，与kar相关的itam参与促进nk细胞中的信号转导。当激活配体与kar复合物结合发生时，相关的链中itam中的酪氨酸残基被激酶磷酸化，促进天然细胞毒性的信号被传达到nk细胞内部。
[0630]
工程化改造以抵抗靶免疫细胞“反击”[0631]
本发明的效应免疫细胞经过工程化改造，使得当效应免疫细胞的细胞表面受体或受体复合物特异性结合靶免疫细胞的抗原识别受体时，效应免疫细胞赢得两种免疫细胞之间的战斗，使得靶免疫细胞被效应免疫细胞杀伤，而不是效应免疫细胞被靶免疫细胞杀伤。
[0632]
有多种方法可以对效应免疫细胞进行工程化改造，使其在两个细胞彼此相遇的时间和地点对靶免疫细胞具有选择性优势。
[0633]
例如：
[0634]
1)可以对效应免疫细胞进行工程化改造，使其对一种或多种免疫抑制药物具有抗性
[0635]
2)可以对效应免疫细胞进行工程化改造，使其能够传输一种或多种抑制性免疫信号。
[0636]
对免疫抑制的抗性
[0637]
可以对效应免疫细胞进行工程化改造，使其对一种或多种免疫抑制药物具有抗性。这意味着在免疫抑制药物存在的情况下，靶免疫细胞会受到抑制，而效应细胞会对抑制具有抗性，从而使效应免疫细胞具有选择性优势。
[0638]
免疫抑制药物可以在体内或体外向免疫细胞群施用。例如，免疫抑制药物可以在施用包含效应免疫细胞的组合物之前或同时向患者施用。或者，免疫抑制药物可以在将包含效应免疫细胞的组合物向移植物施用之前或同时并且在将移植物引入患者之前向移植物施用。
[0639]
免疫抑制药物又称为免疫抑制药剂、免疫抑制剂和抗排斥药物，是抑制或阻止免疫系统活动的药物。免疫抑制药物常用于免疫抑制治疗，例如为了：
[0640]
(i)防止移植器官和组织(例如骨髓、心脏、肾、肝)和细胞(例如在造血干细胞移植和同种异体免疫治疗方法期间)的排斥；
[0641]
(ii)治疗自身免疫性疾病或最可能源于自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、白癜风、肉芽肿性多血管炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症/硬皮病、结节病、局灶节段性肾小球硬化症、克罗恩病、白塞病、天疱疮和溃疡性结肠炎)；和
[0642]
(iii)治疗一些其他非自身免疫性炎症性疾病(例如，长期过敏性哮喘控制)、强直性脊柱炎。
[0643]
大量免疫抑制药物是已知的并且在移植和免疫治疗方法中常规使用。免疫抑制药物可以是，例如小分子或抗体或其他生物分子。免疫抑制药物可以是糖皮质激素、细胞抑制剂、多克隆或单克隆抗体或作用于免疫亲和蛋白(immunophilin)的药物。这些将在下文更详细地描述。
[0644]
糖皮质激素
[0645]
糖皮质激素是皮质类固醇的一类，是类固醇激素的一类。糖皮质激素是与糖皮质激素受体结合的皮质类固醇。示例包括：皮质醇(氢化可的松)、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、醋酸氟氢可的松和醋酸脱氧皮质酮。
[0646]
在药理学(即超生理学)剂量中，糖皮质激素用于抑制各种过敏、炎症和自身免疫性病症。它们还作为移植后免疫抑制剂施用，以预防急性移植物排斥和移植物抗宿主病。
[0647]
糖皮质激素抑制细胞介导的免疫。它们通过抑制编码细胞因子白细胞介素1(il-1)、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8和tnf-α的基因起作用，其中最重要的是il-2。较低水平的细胞因子产生会降低t细胞增殖。糖皮质激素还抑制体液免疫，引起b细胞表达较少量的il-2和il-2受体。这减少了b细胞克隆扩增和抗体合成。
[0648]
糖皮质激素影响所有类型的炎症性事件，无论其原因如何。它们诱导脂皮质蛋白-1(膜联蛋白-1)合成，然后该蛋白与细胞膜结合防止磷脂酶a2与其底物花生四烯酸接触。这导致类花生酸的产生减少。环氧合酶(cox-1和cox-2)的表达也受到抑制，从而增强效果。
[0649]
糖皮质激素还刺激脂皮质蛋白-1逃逸到细胞外空间，在那里它与白细胞膜受体结合并抑制各种炎症性事件：上皮粘附、迁移、趋化性、吞噬作用、呼吸爆发和各种来自中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞的炎症性介导物(溶酶体酶、细胞因子、组织纤溶酶原激活剂、趋化因子等)。
[0650]
细胞抑制剂
[0651]
细胞抑制剂抑制细胞分裂。在免疫治疗中，它们以与治疗恶性疾病相比较小的剂量使用。它们影响t细胞和b细胞的增殖。由于它们最高的效力，嘌呤类似物是最频繁施用的。细胞抑制剂包括烷化剂、抗代谢物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯基嘌呤，以及细胞毒性抗生素。
[0652]
免疫治疗中使用的烷化剂是氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物等等。环磷酰胺(baxter的cytoxan)可能是最有效的免疫抑制化合物。小剂量对系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血、肉芽肿性多血管炎和其他免疫性疾病的治疗非常有效。高剂量引起全血细胞减少和出血性膀胱炎。
[0653]
抗代谢物干扰核酸的合成。这些抗代谢物包括：叶酸类似物诸如甲氨蝶呤；嘌呤类似物诸如硫唑嘌呤和巯基嘌呤；嘧啶类似物诸如氟尿嘧啶；以及蛋白质合成抑制剂。
[0654]
甲氨蝶呤是叶酸类似物。它结合二氢叶酸还原酶并阻止四氢叶酸的合成。它用于治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎或白塞病)和用于移植。
[0655]
硫唑嘌呤(prometheus的imuran)是主要的免疫抑制性细胞毒性物质。它广泛用于控制移植排斥反应。它被非酶地切割为巯基嘌呤，作为嘌呤类似物和dna合成抑制剂起作用。巯基嘌呤本身也可以直接施用。
[0656]
通过在免疫应答的诱导阶段阻止淋巴细胞的克隆扩增，它会影响细胞免疫和体液免疫。它在治疗自身免疫性疾病中也很有效。
[0657]
在细胞毒性抗生素中，放线菌素是最重要的。它用于肾移植。其他细胞毒性抗生素是蒽环类、丝裂霉素c、博来霉素、光神霉素。
[0658]
抗体
[0659]
抗体有时被用作快速并有效的免疫抑制疗法以防止急性排斥反应，以及用作淋巴组织增生性病症或自身免疫性病症的靶向疗法(例如，抗cd20单克隆抗体)。它们可以是多克隆的或单克隆的。
[0660]
异源多克隆抗体从动物(例如兔、马)的血清中获得，并与患者的胸腺细胞或淋巴细胞一起注射。正在使用抗淋巴细胞抗原(alg)和抗胸腺细胞抗原(atg)。它们是类固醇抗性急性排斥反应和严重再生障碍性贫血治疗的一部分。然而，它们主要被添加到其他免疫抑制剂中以减少其剂量和毒性。它们还允许过渡到环孢菌素疗法。
[0661]
多克隆抗体抑制t淋巴细胞并引起其溶解，这是补体介导的细胞溶解和细胞介导的调理作用，然后从脾脏和肝脏的循环中去除网状内皮细胞。通过这种方式，多克隆抗体抑制细胞介导的免疫应答，包括移植物排斥、迟发性超敏反应(即结核菌素皮肤反应)和移植物抗宿主病(gvhd)，但会影响胸腺依赖性抗体的产生。
[0662]
市场上可获得的两种制剂是：从马血清中获得的atgam和从兔血清中获得的即复宁(thymoglobuline)。多克隆抗体影响所有淋巴细胞并引起普遍的免疫抑制，可能导致移植后淋巴组织增生性病症(ptld)或严重的感染，尤其是巨细胞病毒感染。为了降低这些风险，在医院提供治疗，那里可以充分与感染隔离。
[0663]
单克隆抗体引起较少的副作用。尤其重要的是针对il-2受体(cd25)的抗体和针对cd3的抗体。它们用于防止移植器官的排斥，也用于跟踪淋巴细胞亚群的变化。期待未来类似的新药是合理的。
[0664]
莫罗莫那(muromonab)-cd3是igg2a型鼠抗cd3单克隆抗体，通过结合所有分化的t细胞上存在的t细胞受体复合物来阻止t细胞激活和增殖。因此，它是最有效的免疫抑制性物质之一，施用以控制类固醇和/或多克隆抗体抗性的急性排斥发作。由于它比多克隆抗体更特异地起作用，它也在移植中预防性地使用。
[0665]
白细胞介素2是用于激活的淋巴细胞t的克隆扩增和存活所必需的重要的免疫系统调节剂。其作用由三聚体细胞表面受体il-2a介导，该三聚体由α、β和γ链组成。il-2a(cd25，t细胞激活抗原，tac)仅由已激活的t淋巴细胞表达。因此，其对选择性免疫抑制性治疗特别重要，研究一直集中在开发有效且安全的抗il-2抗体上。巴利昔单抗(simulect)和达克珠单抗(zenapax)是嵌合的小鼠/人抗tac抗体。这些药物通过结合il-2a受体的α链起作用，阻止il-2诱导的激活的淋巴细胞的克隆扩增并缩短其存活期。例如，它们用于预防双侧肾移植后的急性器官排斥。
[0666]
钙调磷酸酶抑制剂和其他药物
[0667]
他克莫司和环孢菌素是钙调磷酸酶抑制剂(cni)。钙调磷酸酶自1983年开始使用，是应用最广泛的免疫抑制性药物之一。它是环状真菌肽，由11个氨基酸组成。
[0668]
认为环孢菌素与免疫活性淋巴细胞尤其是t淋巴细胞的细胞质蛋白质亲环蛋白(免疫亲和蛋白)结合。这种环孢菌素和亲环蛋白的复合物抑制磷酸酶钙调磷酸酶，在正常情况下诱导白细胞介素-2的转录。该药物还抑制淋巴因子的产生和白细胞介素的释放，导致效应t细胞的功能降低。
[0669]
他克莫司是细菌筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)的产物。它是大环内酯类内酯，通过抑制钙调磷酸酶起作用。
[0670]
药物主要用于肝和肾移植，尽管在一些临床中其用于心脏、肺和心/肺移植。它与免疫亲和蛋白fkbp1a结合，随后复合物与钙调磷酸酶结合并抑制其磷酸酶活性。通过这种方式，它阻止细胞从细胞周期的g0期过渡到g1期。他克莫司比环孢菌素更有效，并且具有更不明显的副作用。
[0671]
西罗莫司(雷帕霉素)是一种大环内酯类内酯，由放线菌类细菌吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)产生。它用于防止排斥反应。尽管它是他克莫司的结构类似物，它以略有不同的方式起作用并且具有不同的副作用。
[0672]
与影响t淋巴细胞激活的第一阶段的环孢菌素和他克莫司不同，西罗莫司影响第
二阶段，即信号转导和淋巴细胞克隆增殖。它与他克莫司一样与fkbp1a结合，然而该复合物不抑制钙调磷酸酶而是抑制另一种蛋白质mtor。因此，西罗莫司与环孢菌素以协同方式起作用，并且与其他免疫抑制剂组合，具有少的副作用。此外，它还间接抑制几种t淋巴细胞特异性激酶和磷酸酶，从而阻止它们从细胞周期的g1期过渡到s期。以类似的方式，西罗莫司防止b细胞分化为浆细胞，减少igm、igg和iga抗体的产生。它对pi3k/akt/mtor依赖性肿瘤也有活性。
[0673]
依维莫司是西罗莫司的类似物并且也是mtor抑制剂。
[0674]
其他免疫抑制性药物包括干扰素、阿片类药物、tnf结合蛋白、霉酚酸和小生物制剂。
[0675]
ifn-β抑制th1细胞因子的产生和单核细胞的激活。它用于减缓多发性硬化症的进展。ifn-γ能够触发淋巴细胞凋亡。
[0676]
阿片类药物是作用于阿片受体以产生吗啡样作用的物质。长期使用阿片类药物可能引起先天性免疫和适应性免疫的免疫抑制。已在巨噬细胞和淋巴细胞中观察到增殖和免疫功能的下降。认为这些作用是由这些免疫细胞表面上表达的阿片受体介导的。
[0677]
tnf-α(肿瘤坏死因子-α)结合蛋白是与tnf-α结合的单克隆抗体或循环受体，诸如英夫利昔单抗(remicade)、依那西普(enbrel)或阿达木单抗(humira)，阻止tnf-α诱导il-1和il-6的合成和淋巴细胞激活分子的粘附。它们用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病和牛皮癣的治疗。
[0678]
tnf或tnf的作用也受到多种天然化合物的抑制，包括姜黄素(姜黄中的成分)和儿茶素(绿茶中)。
[0679]
霉酚酸充当非竞争性、选择性和可逆的肌苷-5
’‑
单磷酸脱氢酶(impdh)的抑制剂，impdh是从头鸟苷核苷酸合成中的关键酶。与其他人细胞类型不同，淋巴细胞b和t非常依赖这一过程。霉酚酸酯与环孢菌素或他克莫司组合用于移植患者。
[0680]
小生物制剂包括合成的免疫抑制剂芬戈莫德。它增加淋巴细胞中某些粘附分子(α4/β7整合素)的表达或改变其功能，因此它们在淋巴组织(淋巴结)中积累并且它们在循环中的数量减少。在这方面，它不同于所有其他已知的免疫抑制剂。
[0681]
多球壳菌素是非典型氨基酸并且是衍生自某些嗜热真菌的抗生素。已经证明它可以抑制细胞毒性t细胞的增殖。
[0682]
通过突变获得的抗性
[0683]
本发明的效应细胞可以包含一种或多种增加其对一种或多种免疫抑制性药物的抗性的突变。例如，效应细胞可以包含一种或多种使细胞对他克莫司和/或环孢菌素具有抗性的突变。
[0684]
效应细胞可以包含编码具有一个或多个突变的钙调磷酸酶(cn)的核酸序列。钙调磷酸酶(can)是钙和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其激活免疫系统的t细胞。钙调磷酸酶通过使其去磷酸化而激活活化的t细胞细胞质的核因子(nfatc)(一种转录因子)。然后将激活的nfatc转移到细胞核中，在那里它上调白细胞介素2(il-2)的表达，刺激t细胞反应。钙调磷酸酶是一类称为钙调磷酸酶抑制剂的药物的靶标，包括环孢菌素、voclosporin、匹美莫司和他克莫司。brewin等人(2009；blood 114:4792-4803)描述了各种钙调磷酸酶突变体，这些突变体使细胞毒性t淋巴细胞对他克莫司和/或环孢菌素具有抗
性。
[0685]
钙调磷酸酶是61-kd的钙调蛋白结合催化亚基钙调磷酸酶a和19-kd的ca
2
结合调节性亚基钙调磷酸酶b的异二聚体。催化亚基有三种同工酶，每一种由单独的基因(ppp3ca、ppp3cb和ppp3cc)编码，调节性亚基的两种同种型也由单独的基因(ppp3r1、ppp3r2)编码。这些基因编码的所有多肽的氨基酸序列均可从uniprot获得，具有下列登录号：ppp3ca:q08209、ppp3cb:p16298、ppp3cc:p48454、ppp3r1:p63098以及ppp3r2:q96lz3。
[0686]
钙调磷酸酶a的α同种型的氨基酸序列如下文seq id no.65所示。
[0687]
seq id no.65(钙调磷酸酶a)
[0688]
msepkaidpklsttdrvvkavpfppshrltakevfdndgkprvdilkahlmkegrleesvalriitegasilrqeknlldidapvtvcgdihgqffdlmklfevggspantrylflgdyvdrgyfsiecvlylwalkilypktlfllrgnhecrhlteyftfkqeckikyservydacmdafdclplaalmnqqflcvhgglspeintlddirkldrfkeppaygpmcdilwsdpledfgnektqehfthntvrgcsyfysypavceflqhnnllsilraheaqdagyrmyrksqttgfpslitifsapnyldvynnkaavlkyennvmnirqfncsphpywlpnfmdvftwslpfvgekvtemlvnvlnicsddelgseedgfdgataaarkevirnkiraigkmarvfsvlreesesvltlkgltptgmlpsgvlsggkqtlqsatveaieadeaikgfspqhkitsfeeakgldrinermpprrdampsdanlnsinkaltsetngtdsngsnssniq
[0689]
突变体钙调磷酸酶a可以在下列参照seq id no.65的位置中的一个或多个处包含突变：v314、y341、m347、t351、w352、s353、l354、f356和k360。
[0690]
突变体钙调磷酸酶a可以包含参照seq id no.65的一下取代突变中的一个或多个：
[0691]
v314k、v314r或v314f；
[0692]
y341f；
[0693]
m347w、m347r或m347e；
[0694]
t351e；
[0695]
w352a、w352c或w352e；
[0696]
s353h或s353n；
[0697]
l354a；
[0698]
f356a；和
[0699]
k360a或k360f。
[0700]
突变体钙调磷酸酶a可以包含以下参照seq id no.65的突变组合中的一个或多个：
[0701]
l354a和k360a；
[0702]
l354a和k360f；
[0703]
t351e和k360f；
[0704]
w352a和s353h；
[0705]
t351e和l354a；
[0706]
w352c和k360f；
[0707]
w352c、l354a和k360f；
[0708]
v314k和y341f；和
[0709]
v314r和y341f。
[0710]
钙调磷酸酶b的1型的氨基酸序列如下文seq id no.66所示。
[0711]
seq id no.66(钙调磷酸酶b)
[0712]
mgneasyplemcshfdadeikrlgkrfkkldldnsgslsveefmslpelqqnplvqrvidifdtdgngevdfkefiegvsqfsvkgdkeqklrfafriydmdkdgyisngelfqvlkmmvgnnlkdtqlqqivdktiinadkdgdgrisfeefcavvggldihkkmvvdv
[0713]
突变体钙调磷酸酶b可以在以下参照seq id no.66的位置中的一个或多个处包含突变：q51、l116、m119、v120、g121、n122、n123、l124、k125和k165。
[0714]
突变体钙调磷酸酶b可以包含以下参照seq id no.66的取代和任选的插入突变中的一个或多个：
[0715]
q51s；
[0716]
l116r或l116y；
[0717]
m119a、m119w或m119-f-ins；
[0718]
v120l、v120s、v120d或v120f；
[0719]
g121-lf-ins；
[0720]
n122a、n122h、n122f或n122s；
[0721]
n123h、n123r、n123f、n123k或n123w；
[0722]
l124t；
[0723]
k125a、k125e、k125w、k125-la-ins、k125-vq-ins或k125-ie-ins；和
[0724]
k165q。
[0725]
突变体钙调磷酸酶b可以包含以下参照seq id no.66的突变组合中的一个或多个：
[0726]
v120s和l124t；
[0727]
v120d和l124t；
[0728]
n123w和k125-la-ins；
[0729]
l124t和k125-la-ins；
[0730]
v120d和k125-la-ins；和
[0731]
m119-f-ins和g121-lf-ins。
[0732]
具体地，突变体钙调磷酸酶b可以包含以下参照seq id no.66的突变组合：l124t和k125-la-ins。这是实施例部分称为“cnb30”的模块。cnb30具有如seq id no.131所示的氨基酸。
[0733]
seq id no.131(cnb30)
[0734]
mgneasyplemcshfdadeikrlgkrfkkldldnsgslsveefmslpelqqnplvqrvidifdtdgngevdfkefiegvsqfsvkgdkeqklrfafriydmdkdg
[0735]
yisngelfqvlkmmvgnntkladtqlqqivdktiinadkdgdgrisfeefcavvggldihkkmvvdv
[0736]
在brewin等人2009所述的研究中(如上文)，下列cna突变体显示出对fk506的抗性：
[0737]
l354a和k360f；
[0738]
w352a；
[0739]
w352c；
[0740]
t351e和l354a；
[0741]
m347w；和
[0742]
m347e。
[0743]
下列cna突变体显示出对钙调磷酸酶a的抗性：
[0744]
v314k；
[0745]
v314r；
[0746]
y341f；
[0747]
v314k和y341f；和
[0748]
v314r和y341f。
[0749]
下列cnb突变体显示出对fk506的抗性：
[0750]
n123w；
[0751]
k125-vq-ins；
[0752]
k125-ie-ins；
[0753]
k-125-la-ins；和
[0754]
l124t和k-125-la-ins。
[0755]
下列cnb突变体显示出对钙调磷酸酶a的抗性：
[0756]
k125-vq-ins；
[0757]
k125-ie-ins；
[0758]
k-125-la-ins；
[0759]
v120s和l124t；和
[0760]
l124t和k-125-la-ins。
[0761]
具体地，brewin等人2009(如上文)中报道：
[0762]
cna中的组合突变t351e和l354a赋予对csa而非fk506的抗性；
[0763]
cna中的组合突变v314r和y341f赋予对fk506而非csa的抗性；和
[0764]
cnb中的组合突变l124t和k-125-la-ins使ctl对两种钙调磷酸酶抑制剂都有抗性。
[0765]
本发明的效应免疫细胞可以表达在cna氨基酸序列中包含一个或多个突变的变体钙调磷酸酶a和/或在cnb氨基酸序列中包含一个或多个突变的变体钙调磷酸酶b，这增加了效应免疫细胞对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性。
[0766]
具体地，效应免疫细胞可以表达如上文所列的赋予对环孢菌素a和/或他克莫司(fk506)的抗性的变体钙调磷酸酶a和/或变体钙调磷酸酶b。
[0767]
显性负性的csk
[0768]
可以对效应免疫细胞进行工程化改造以表达显性负性的c末端src激酶(dncsk)。先前已经表明，通过共表达dncsk可以增强表达car的细胞诸如car-t细胞的功能(申请号为1919017.2的英国专利申请)。car-t细胞中显性负性的csk的表达似乎增加了car-t细胞的敏感性，提高了细胞毒性和细胞因子释放，尤其是对低密度靶抗原的响应。
[0769]
本发明的发明人现已发现dncsk的表达还赋予细胞对免疫抑制的普遍抗性。dncsk的表达提供了对免疫抑制的“全面的(blanket)”抗性，通常使细胞对免疫抑制性药物的敏感性较小。
[0770]
c末端src激酶(csk)，也称为酪氨酸蛋白激酶，是磷酸化位于src家族激酶(sfk)c末端的酪氨酸残基的酶，从而抑制其活性，该src家族激酶包括src、hck、fyn、lck、lyn和yes1。
[0771]
src家族激酶(sfk)诸如lck由以下结构组成：附接到sh4结构域、sh3结构域、sh2结构域和蛋白质酪氨酸激酶结构域(sh1结构域)的允许膜定位的n末端豆蔻酰基团。
[0772]
在激活环中有保守的酪氨酸残基，在c末端尾部有一个酪氨酸残基，通过反式自磷酸化对激活环酪氨酸的磷酸化会增加sfk活性，而通过c末端src激酶(csk)对c末端酪氨酸的磷酸化会抑制sfk活性。
[0773]
csk磷酸化lck的负调控性c末端酪氨酸残基y505，以保持lck处于非活性状态。在静息的t细胞中，csk通过其sh2结构域与pag的磷酸酪氨酸残基py317的结合而被靶向至脂质筏。pag在未受刺激的t细胞中作为酪氨酸磷酸化的蛋白表达。csk和pag的这种相互作用允许csk的激活和lck的抑制。
[0774]
tcr激活后，cd45被排除在膜微区之外，并且使pag去磷酸化，导致csk从质膜分离。
[0775]
人csk的氨基酸序列可以uniprot登录号41240获得，如下文seq id no.67所示。在该序列中，残基9-70对应于sh3结构域、残基82-171对应于sh2结构域，并且残基195-449对应于蛋白激酶结构域。
[0776]
seq id no.67(wtcsk)
[0777]
msaiqaawpsgteciakynfhgtaeqdlpfckgdvltivavtkdpnwykaknkvgregiipanyvqkregvkagtklslmpwfhgkitreqaerllyppetglflvrestnypgdytlcvscdgkvehyrimyhasklsideevyfenlmqlvehytsdadglctrlikpkvmegtvaaqdefyrsgwalnmkelkllqtigkgefgdvmlgdyrgnkvavkcikndataqaflaeasvmtqlrhsnlvqllgviveekgglyivteymakgslvdylrsrgrsvlggdcllkfsldvceameylegnnfvhrdlaarnvlvsednvakvsdfgltkeasstqdtgklpvkwtapealrekkfstksdvwsfgillweiysfgrvpypriplkdvvprvekgykmdapdgcppavyevmkncwhldaamrpsflqlreqlehikthelhl
[0778]
本发明的细胞可以表达显性负性的c末端src激酶(dncsk)。
[0779]
显性负性的csk可以缺乏功能性蛋白激酶结构域。dncsk可能不包含激酶结构域，或者它可能包含部分或完全失活的激酶结构域。激酶结构域可以通过，例如一个或多个氨基酸的截短或突变而失活。
[0780]
例如，dncsk可以是：
[0781]
i)截短的csk，其被招募到细胞膜但缺乏功能性激酶结构域；
[0782]
ii)突变的csk，其缺乏磷酸化lck的y505的能力；或
[0783]
iii)突变的csk，其催化活性被药剂抑制(参见图14)。
[0784]
效应免疫细胞可以表达完全缺乏激酶结构域的dncsk。例如，dncsk可以包含sh2结构域和任选的sh3结构域，但被截短以去除激酶结构域。
[0785]
或者，效应免疫细胞可以表达包含具有部分磷酸酶的部分截短的激酶结构域的dncsk，例如来自seq id no.67的残基195-449的一部分序列，条件是该截短的激酶具有与野生型csk相比磷酸化lck的c末端酪氨酸残基y505的能力降低。截短的激酶可能实际上没有残留的激酶活性。
[0786]
dncsk可以是截短的csk，其保留结合跨膜衔接蛋白诸如pag、lime和/或dok1/2的能力，这些跨膜衔接蛋白将野生型csk募集到细胞膜但缺乏功能性激酶结构域。
[0787]
dncsk可以具有如seq id no.68所示的序列，其对应于减去激酶结构域的野生型csk序列(seq id no.67)。
[0788]
seq id no.68(csk_del_激酶)
[0789]
msaiqaawpsgteciakynfhgtaeqdlpfckgdvltivavtkdpnwykaknkvgregiipanyvqkregvkagtklslmpwfhgkitreqaerllyppetglflvrestnypgdytlcvscdgkvehyrimyhasklsideevyfenlmqlvehytsdadglctrlikpkvmegtvaaqdefyrsgwalnmke
[0790]
或者，dncsk可具有如seq id no.69所示的序列，其对应于减去激酶结构域和sh3结构域的野生型csk序列(seq id no.67)。
[0791]
seq id no.69(csk_del_激酶_sh3)
[0792]
msaiqaawvkagtklslmpwfhgkitreqaerllyppetglflvrestnypgdytlcvscdgkvehyrimyhasklsideevyfenlmqlvehytsdadglctrlikpkvmegtvaaqdefyrsgwalnmke
[0793]
本发明的效应免疫细胞可以表达包含激酶结构域的dncsk，该激酶结构域是失活的，使得其具有降低的或不具有磷酸化蛋白质诸如lck的能力。
[0794]
例如，激酶结构域可以包含一个或多个氨基酸突变，使得其与野生型序列相比具有降低的激酶活性。
[0795]
例如，突变可以是添加、删除或取代。
[0796]
突变可以包含一个或多个赖氨酸残基的缺失或取代。
[0797]
变体激酶序列可以在参照如seq id no.67所示的序列的222位具有至赖氨酸的突变。
[0798]
本发明的dncsk可以具有如seq id no 70所示的序列，其对应于具有k222r取代的全长csk序列。该突变在seq id no.70中以粗体和下划线显示。或者，本发明的dncsk可以具有与seq id no.70等同的序列，其中sh3结构域已被删除。
[0799]
seq id no 70(csk(k222r))
[0800][0801][0802]
dncsk可以包含突变的csk，其催化活性被药剂抑制。例如，dncsk可以具有如seq id no.71所示的序列，其与如seq id no.67所示的野生型序列相比包含突变t266g，并且称为“cskas”。该取代在seq id no.71中以粗体和下划线显示。或者，本发明的dncsk可以具有与seq id no.71等同的序列，其中sh3结构域已被删除。
[0803]
seq id no.71(cskas)
[0804][0805]
cskas的催化活性受到3-碘-苄基-pp1的抑制。因此，在该分子存在的情况下，cskas充当显性负性型式的csk，与野生型酶竞争结合诸如pag、lime和/或dok1/2的膜蛋白，这些膜蛋白将野生型csk招募到细胞膜。
[0806]
抑制性免疫信号的传输
[0807]
本发明的效应免疫细胞可以表达或过表达免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域的融合蛋白。
[0808]
在体内，膜结合免疫抑制受体诸如pd-1、lag-3、2b4或btla 1抑制t细胞激活。在t细胞激活期间(图15a中示意性地说明)，t细胞受体(tcr)对抗原的识别导致cd3ζ上免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的磷酸化。zap70 sh2结构域识别磷酸化的itam，导致t细胞激活。如图15b中示意性地说明，抑制性免疫受体诸如pd1有效地逆转了这一过程。pd1在其胞内域中具有被ptpn6(shp-1)的sh2结构域识别的itim。当pd1与其配体pd-l1或肿瘤细胞结合时，ptpn6被招募到近膜区域，并且其磷酸酶结构域随后使itam结构域去磷酸化，从而抑制免疫激活。
[0809]
靶免疫细胞将天然地表达多种此类含有itim的免疫抑制性受体，诸如pd-1、lag3、tim-3、tigit、btla、vista、ceacam1-r、kir2dl4、b7-h3和b7-h4。
[0810]
通过工程化改造本发明的效应免疫细胞以表达一种或多种免疫抑制性受体的配体或此类配体的细胞外结构域，当在两个细胞之间形成突触时，效应免疫细胞将抑制靶免疫细胞中的t细胞激活。这种“单向”抑制使效应免疫细胞在激活方面优于靶免疫细胞，这意味着效应免疫细胞将占优势，杀伤靶免疫细胞。
[0811]
效应免疫细胞可以表达或过表达靶免疫细胞上的免疫抑制性受体的配体。由靶细胞表达的免疫抑制性受体可以例如选自：pd-1、lag3、tim-3、tigit、btla、vista、ceacam1-r、kir2dl4、b7-h3和b7-h4。
[0812]
由效应免疫细胞表达的免疫抑制分子或其细胞外结构域可以例如选自：pd-l1、pd-l2、hvem、cd155、vsig-3、半乳糖凝集素-9、hla-g、ceacam-1、lsectin、fgl1、b7-h3和b7-h4。
[0813]
pd-l1
[0814]
程序性死亡配体1(pd-l1)，也称为分化簇274(cd274)或b7同源物1(b7-h1)，是40kda的1型跨膜蛋白，由癌细胞表达以帮助它们逃避抗肿瘤免疫。pd-l1与其受体pd-1在t细胞上的结合传递抑制tcr介导的il-2产生的激活和t细胞增殖的信号。
[0815]
人pd-l1的氨基酸序列可以从uniprot登录号q9nzq7获得，如下文seq id no.72所示。
[0816]
seq id no.72(人pd-l1)
[0817]
mrifavfifmtywhllnaftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppnerthlvilgaillclgvaltfifrlrkgrmmdvkkcgiqdtnskkqsdthleet
[0818]
pd-l1的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.73、74和75所示。
[0819]
seq id no.73(人pd-l1信号肽)
[0820]
mrifavfifmtywhllna
[0821]
seq id no.74(人pd-l1细胞外结构域)
[0822]
ftvtvpkdlyvveygsnmtieckfpvekqldlaalivywemedkniiqfvhgeedlkvqhssyrqrarllkdqlslgnaalqitdvklqdagvyrcmisyggadykritvkvnapynkinqrilvvdpvtseheltcqaegypkaeviwtssdhqvlsgkttttnskreeklfnvtstlrintttneifyctfrrldpeenhtaelvipelplahppner
[0823]
seq id no.75(人pd-l1跨膜结构域)
[0824]
thlvilgaillclgvaltfif
[0825]
本发明的效应免疫细胞可以包含pd-l1细胞外结构域以及任选地，pd-l1信号肽和/或pd-l1跨膜结构域。
[0826]
pd-l2
[0827]
程序性细胞死亡1配体2(也称为pd-l2、b7-dc)是免疫检查点受体配体，在适应性免疫应答的负调节中发挥作用。pd-l2是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的两个已知配体之一，另一个是pd-l1。
[0828]
pd-l2主要在专业的抗原呈递细胞上表达，包括树突状细胞(dc)和巨噬细胞。pd-l2与pd-1的结合可以激活抑制tcr/bcr介导的免疫细胞激活的通路，并且pd-l2、pd-l1和pd-1的表达在对某些癌症的免疫应答中是重要的。
[0829]
人pd-l2的氨基酸序列可以从uniprot登录号q9bq51获得，如下文seq id no.76所示。
[0830]
seq id no.76(人pd-l2)
[0831]
miflllmlslelqlhqiaalftvtvpkelyiiehgsnvtlecnfdtgshvnlgaitaslqkvendtsphreratlleeqlplgkasfhipqvqvrdegqyqciiiygvawdykyltlkvkasyrkinthilkvpetdeveltcqatgyplaevswpnvsvpantshsrtpeglyqvtsvlrlkpppgrnfscvfwnthvreltlasidlqsqmeprthptwllhifipfciiafifiatvialrkqlcqklysskdttkr pvtttkrevnsai
[0832]
pd-l2的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.77、78和79所示。
[0833]
seq id no.77(人pd-l2信号肽)
[0834]
miflllmlslelqlhqiaa
[0835]
seq id no.78(人pd-l2细胞外结构域)
[0836]
lftvtvpkelyiiehgsnvtlecnfdtgshvnlgaitaslqkvendtsphreratlleqlplgkasfhipqvqvrdegqyqciiiygvawdykyltlkvkasyrkinthilkvpetdeveltcqatgyplaevswpnvsvpantshsrtpeglyqvtsvlrlkpppgrnfscvfwnthvreltlasidlqsqmeprthpt
[0837]
seq id no.79(人pd-l2跨膜结构域)
[0838]
wllhifipfciiafifiatvi
[0839]
本发明的效应免疫细胞可以包含pd-l2细胞外结构域以及任选地，pd-l2信号肽和/或pd-l2跨膜结构域。
[0840]
hvem
[0841]
疱疹病毒进入介导物(hvem)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(tnfrsf14)，是tnf受体超家族的人细胞表面受体。该受体的细胞质区域与几个tnf受体相关因子(traf)家族成员结合，tnf受体相关因子(traf)家族成员介导激活免疫应答的信号转导通路。已显示tnfrsf14与traf2、tnfsf14和traf5相互作用。
[0842]
hvem的氨基酸序列可以从uniprot登录号q92956获得，如下文seq id no.80所示。
[0843]
seq id no.80(hvem全序列)
[0844]
meppgdwgpppwrstpktdvlrlvlyltflgapcyapalpsckedeypvgseccpkcspgyrvkeacgeltgtvcepcppgtyiahlnglskclqcqmcdpamglrasrncsrtenavcgcspghfcivqdgdhcaacrayatsspgqrvqkggtesqdtlcqncppgtfspngtleecqhqtkcswlvtkagagtssshwvwwflsgslvivivcstvgliicvkrrkprgdvvkvivsvqrkrqeaegeatviealqappdvttvaveetipsftgrspnh
[0845]
hvem的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.81、82和83所示。
[0846]
seq id no.81(hvem信号肽)
[0847]
meppgdwgpppwrstpktdvlrlvlyltflgapcyapa
[0848]
seq id no.82(hvem细胞外结构域)
[0849]
lpsckedeypvgseccpkcspgyrvkeacgeltgtvcepcppgtyiahlnglskclqcqmcdpamglrasrncsrtenavcgcspghfcivqdgdhcaacrayatsspgqrvqkggtesqdtlcqncppgtfspngtleecqhqtkcswlvtkagagtssshwv
[0850]
seq id no.83(hvem跨膜结构域)
[0851]
wwflsgslvivivcstvgli
[0852]
本发明的效应免疫细胞可以包含hvem细胞外结构域以及任选地，hvem信号肽和/或hvem跨膜结构域。
[0853]
cd155
[0854]
cd155(分化簇155)也称为脊髓灰质炎病毒受体，是免疫球蛋白超家族中的i型跨膜糖蛋白。cd155参与肠道体液免疫应答以及胸腺中选择mhc非依赖性t细胞的阳性选择。
[0855]
cd155的氨基酸序列可以从uniprot登录号p15151获得，如下文seq id no.84所示。
[0856]
seq id no.84(cd155全序列)
[0857]
maramaaawplllvallvlswpppgtgdvvvqaptqvpgflgdsvtlpcylqvpnmevthvsqltwarh
gesgsmavfhqtqgpsyseskrlefvaarlgaelrnaslrmfglrvedegnytclfvtfpqgsrsvdiwlrvlakpqntaevqkvqltgepvpmarcvstggrppaqitwhsdlggmpntsqvpgflsgtvtvtslwilvpssqvdgknvtckvehesfekpqlltvnltvyyppevsisgydnnwylgqneatltcdarsnpeptgynwsttmgplppfavaqgaqllirpvdkpinttlicnvtnalgarqaeltvqvkegppsehsgisrnaiiflvlgilvflillgigiyfywskcsrevlwhchlcpsstehasasanghvsysavsrensssqdpqtegtr
[0858]
cd155的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.85、86和87所示。
[0859]
seq id no.85(cd155信号肽)
[0860]
maramaaawplllvallvls
[0861]
seq id no.86(cd155细胞外结构域)
[0862]
wpppgtgdvvvqaptqvpgflgdsvtlpcylqvpnmevthvsqltwarhgesgsmavfhqtqgpsyseskrlefvaarlgaelrnaslrmfglrvedegnytclfvtfpqgsrsvdiwlrvlakpqntaevqkvqltgepvpmarcvstggrppaqitwhsdlggmpntsqvpgflsgtvtvtslwilvpssqvdgknvtckvehesfekpqlltvnltvyyppevsisgydnnwylgqneatltcdarsnpeptgynwsttmgplppfavaqgaqllirpvdkpinttlicnvtnalgarqaeltvqvkegppsehsgisrn
[0863]
seq id no.87(cd155跨膜结构域)
[0864]
aiiflvlgilvflillgigiyfyw
[0865]
本发明的效应免疫细胞可以包含cd155细胞外结构域以及任选地，cd155信号肽和/或cd155跨膜结构域。
[0866]
vsig-3
[0867]
vsig-3也称为igsf11，是b7家族成员vista的配体。vsig-3在t细胞受体信号传导存在的情况下抑制人t细胞增殖，并显著降低人t细胞产生的细胞因子和趋化因子，包括ifn-γ、il-2、il-17、ccl5/rantes、ccl3/mip-1α和cxcl11/i-tac。
[0868]
vsig-3的氨基酸序列可以从uniprot登录号q5dx21获得，如下文seq id no.88所示。
[0869]
seq id no.88(vsig-3全序列)
[0870]
mtsqrsplapllllslhgvaaslevsespgsiqvargqpavlpctfttsaalinlnviwmvtplsnanqpeqvilyqggqmfdgaprfhgrvgftgtmpatnvsifinntqlsdtgtyqclvnnlpdiggrnigvtgltvlvppsaphcqiqgsqdigsdvillcsseegiprptylwekldntlklpptatqdqvqgtvtirnisalssglyqcvasnaigtstclldlqvispqprnigliagaigtgaviiifcialilgaffywrsknkeeeeeeipneireddlppkcssakafhteisssdnntltssnaynsrywsnnpkvhrntesvshfsdlgqsfsfhsgnanipsiyangthlvpgqhktlvvtanrgsspqvmsrsngsvsrkprpphthsytishatlerigavpvmvpaqsragslv
[0871]
vsig-3的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.89、90和91所示。
[0872]
seq id no.89(vsig-3信号肽)
[0873]
mtsqrsplapllllslhgvaas
[0874]
seq id no.90(vsig-3细胞外结构域)
[0875]
levsespgsiqvargqpavlpctfttsaalinlnviwmvtplsnanqpeqvilyqggqmfdgaprfhgrvgftgtmpatnvsifinntqlsdtgtyqclvnnlpdiggrnigvtgltvlvppsaphcqiqgsqdigsdvillcsse
egiprptylwekldntlklpptatqdqvqgtvtirnisalssglyqcvasnaigtstclldlqvispqprnig
[0876]
seq id no.91(vsig-3跨膜结构域)
[0877]
liagaigtgaviiifcialil
[0878]
本发明的效应免疫细胞可以包含vsig-3细胞外结构域以及任选地，vsig-3信号肽和/或vsig-3跨膜结构域。
[0879]
半乳糖凝集素-9
[0880]
半乳糖凝集素-9是havcr2(tim-3)的配体，在多种肿瘤细胞上表达。半乳糖凝集素-9和hancr2之间的相互作用减弱了肿瘤微环境中的t细胞扩增和效应物功能。与havcr2结合诱导t辅助1型淋巴细胞(th1)死亡。半乳糖凝集素-9具有通过连接肽连接的n端和c端结合碳水化合物的结构域。
[0881]
半乳糖凝集素-9的氨基酸序列可以从uniprot登录号o00182获得，如下文seq id no.92所示。
[0882]
seq id no.92(半乳糖凝集素-9全序列)
[0883]
mafsgsqapylspavpfsgtiqgglqdglqitvngtvlsssgtrfavnfqtgfsgndiafhfnprfedggyvvcntrqngswgpeerkthmpfqkgmpfdlcflvqssdfkvmvngilfvqyfhrvpfhrvdtisvngsvqlsyisfqnprtvpvqpafstvpfsqpvcfpprprgrrqkppgvwpanpapitqtvihtvqsapgqmfstpaippmmyphpaypmpfittilgglypsksillsgtvlpsaqrfhinlcsgnhiafhlnprfdenavvrntqidnswgseerslprkmpfvrgqsfsvwilceahclkvavdgqhlfeyyhrlrnlptinrlevggdiqlthvqt
[0884]
半乳糖凝集素-9的信号肽、半乳糖凝集素1结构域和半乳糖凝集素2结构域分别如下文seq id no.93、94和95所示。
[0885]
seq id no.93(半乳糖凝集素-9信号肽)
[0886]
mafsgsqapylspavp
[0887]
seq id no.94(半乳糖凝集素-1结构域)
[0888]
fsgtiqgglqdglqitvngtvlsssgtrfavnfqtgfsgndiafhfnprfedggyvvcntrqngswgpeerkthmpfqkgmpfdlcflvqssdfkvmvngilfvqyfhrvpfhrvdtisvngsvqlsyisfq
[0889]
seq id no.95(半乳糖凝集素-2结构域)
[0890]
fittilgglypsksillsgtvlpsaqrfhinlcsgnhiafhlnprfdenavvrntqidnswgseerslprkmpfvrgqsfsvwilceahclkvavdgqhlfeyyhrlrnlptinrlevggdiqlthvqt
[0891]
本发明的效应免疫细胞可以包含全长半乳糖凝集素-9序列，具有或不具有信号肽。或者，效应免疫细胞可以仅包含半乳糖凝集素1结构域或半乳糖凝集素2结构域或来自半乳糖凝集素-9、-1或-2的havcr2结合结构域。
[0892]
本发明的效应免疫细胞可以包含半乳糖凝集素-9的膜系链型式或其部分。半乳糖凝集素-9可以使用跨膜结构域和任选的间隔物序列和/或胞内域系链到膜上。例如，半乳糖凝集素-9或其部分可以使用cd8茎间隔物、跨膜结构域和截短的胞内域系链到膜上，这在wo2013/153391中已经针对分类自杀基因rqr8进行了描述。
[0893]
hla-g
[0894]
hla-g组织相容性抗原，i类，g，也称为人白细胞抗原g(hla-g)，属于hla非经典的i类重链旁系同源物。该i类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。hla-g是nk细胞抑制性受体kir2dl4的配体，并且，在怀孕期间，滋养层细胞表达这种hla可以保护其免
受nk细胞介导的死亡。
[0895]
hla-g的氨基酸序列可以从uniprot登录号p17693获得，如下文seq id no.96所示。
[0896]
seq id no.96(hla-g全序列)
[0897]
mvvmaprtlflllsgaltltetwagshsmryfsaavsrpgrgeprfiamgyvddtqfvrfdsdsacprmeprapwveqegpeyweeetrntkahaqtdrmnlqtlrgyynqseasshtlqwmigcdlgsdgrllrgyeqyaydgkdylalnedlrswtaadtaaqiskrkceaanvaeqrraylegtcvewlhrylengkemlqradppkthvthhpvfdyeatlrcwalgfypaeiiltwqrdgedqtqdvelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpeplmlrwkqsslptipimgivaglvvlaavvtgaavaavlwrkkssd
[0898]
hla-g的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.97、98和99所示。
[0899]
seq id no.97(hla-g信号肽)
[0900]
mvvmaprtlflllsgaltltetwa
[0901]
seq id no.98(hla-g细胞外结构域)
[0902]
gshsmryfsaavsrpgrgeprfiamgyvddtqfvrfdsdsacprmeprapwveqegpeyweeetrntkahaqtdrmnlqtlrgyynqseasshtlqwmigcdlgsdgrllrgyeqyaydgkdylalnedlrswtaadtaaqiskrkceaanvaeqrraylegtcvewlhrylengkemlqradppkthvthhpvfdyeatlrcwalgfypaeiiltwqrdgedqtqdvelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpeplmlrwkqsslptipi
[0903]
seq id no.99(hla-g跨膜结构域)
[0904]
mgivaglvvlaavvtgaavaavlw
[0905]
本发明的效应免疫细胞可以包含hla-g细胞外结构域以及任选地，hla-g信号肽和/或hla-g跨膜结构域。
[0906]
ceacam-1
[0907]
癌胚抗原相关细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)(ceacam1)也称为cd66a(分化簇66a)，是人糖蛋白，并且是癌胚抗原(cea)基因家族的成员。
[0908]
ceacam-1在t细胞、自然杀伤(nk)细胞和中性粒细胞的免疫应答中作为共抑制受体发挥作用。在tcr/cd3复合物刺激后，ceacam-1通过介导与邻近细胞的嗜同性结合来阻断颗粒胞吐作用，从而抑制tcr介导的细胞毒性，允许与lck相互作用并被lck磷酸化，以及与招募ptpn6的tcr/cd3复合物相互作用，导致cd247和zap70去磷酸化。ceacam-1还通过抑制jnk级联来抑制t细胞增殖和细胞因子的产生，并通过与havcr2的相互作用抑制t细胞，从而在调节自身免疫和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。在自然杀伤(nk)细胞激活后，ceacam-1通过与靶细胞上的ceacam1的反式嗜同性相互作用抑制klrk1介导的具有ceacam1的肿瘤细胞的细胞溶解，并导致ceacam1和klrk1之间的顺式相互作用，允许ptpn6的招募，然后vav1去磷酸化。
[0909]
ceacam-1的氨基酸序列可以从uniprot登录号p13688获得，如下文seq id no.100所示。
[0910]
seq id no.100(ceacam-1全序列)
[0911]
mghlsaplhrvrvpwqgllltaslltfwnppttaqlttesmpfnvaegkevlllvhnlpqqlfgyswykgervdgnrqivgyaigtqqatpgpansgretiypnaslliqnvtqndtgfytlqviksdlvneeatgqfhvypelpk
psissnnsnpvedkdavaftcepetqdttylwwinnqslpvsprlqlsngnrtltllsvtrndtgpyeceiqnpvsanrsdpvtlnvtygpdtptispsdtyyrpganlslscyaasnppaqyswlingtfqqstqelfipnitvnnsgsytchannsvtgcnrttvktiivtelspvvakpqikaskttvtgdkdsvnltcstndtgisirwffknqslpssermklsqgnttlsinpvkredagtywcevfnpisknqsdpimlnvnynalpqenglspgaiagivigvvalvaliavalacflhfgktgrasdqrdltehkpsvsnhtqdhsndppnkmnevtystlnfeaqqptqptsaspsltateiiysevkkq
[0912]
ceacam-1的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.101、102和103所示。
[0913]
seq id no.101(ceacam-1信号肽)
[0914]
mghlsaplhrvrvpwqgllltaslltfwnpptta
[0915]
seq id no.102(ceacam-1细胞外结构域)
[0916]
qlttesmpfnvaegkevlllvhnlpqqlfgyswykgervdgnrqivgyaigtqqatpgpansgretiypnaslliqnvtqndtgfytlqviksdlvneeatgqfhvypelpkpsissnnsnpvedkdavaftcepetqdttylwwinnqslpvsprlqlsngnrtltllsvtrndtgpyeceiqnpvsanrsdpvtlnvtygpdtptispsdtyyrpganlslscyaasnppaqyswlingtfqqstqelfipnitvnnsgsytchannsvtgcnrttvktiivtelspvvakpqikaskttvtgdkdsvnltcstndtgisirwffknqslpssermklsqgnttlsinpvkredagtywcevfnpisknqsdpimlnvnynalpqenglspg
[0917]
seq id no.103(ceacam-1跨膜结构域)
[0918]
aiagivigvvalvaliavalacf
[0919]
本发明的效应免疫细胞可以包含ceacam-1细胞外结构域以及任选地，ceacam-1信号肽和/或ceacam-1跨膜结构域。
[0920]
lsectin
[0921]
lsectin或肝窦内皮细胞凝集素是lag-3的配体，是t细胞增殖和t细胞介导的免疫的负调节剂。
[0922]
lsectin的氨基酸序列可以从uniprot登录号q6uxb4获得，如下文seq id no.104所示。
[0923]
seq id no.104(lsectin全序列)
[0924]
mdttryskwggsseevpggpwgrwvhwsrrplflalavlvttvlwavilsillskasteraalldghdllrtnaskqtaalgalkeevgdchsccsgtqaqlqttraelgeaqaklmeqesalrelrervtqglaeagrgredvrtelfraleavrlqnnscepcptswlsfegscyffsvpkttwaaaqdhcadasahlvivggldeqgfltrntrgrgywlglravrhlgkvqgyqwvdgvslsfshwnqgepndawgrencvmmlhtglwndapcdsekdgwicekrhnc
[0925]
lsectin的细胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域分别如下文seq id no.105、106和107所示。
[0926]
seq id no.105(lsectin细胞质结构域)
[0927]
mdttryskwggsseevpggpwgrwvhwsrrp
[0928]
seq id no.106(lsectin跨膜结构域)
[0929]
lflalavlvttvlwavilsil
[0930]
seq id no.107(lsectin细胞外结构域)
[0931]
lskasteraalldghdllrtnaskqtaalgalkeevgdchsccsgtqaqlqttraelgeaqaklmeqesalrelrervtqglaeagrgredvrtelfraleavrlqnnscepcptswlsfegscyffsvpkttwaaaqdhcadasa
hlvivggldeqgfltrntrgrgywlglravrhlgkvqgyqwvdgvslsfshwnqgepndawgrencvmmlhtglwndapcdsekdgwicekrhnc
[0932]
本发明的效应免疫细胞可以包含lsectin细胞外结构域以及任选地，lsectin信号肽和/或lsectin跨膜结构域。
[0933]
fgl1
[0934]
纤维蛋白原样蛋白1(fgl-1)是结构上与纤维蛋白原相关的蛋白质。它是免疫抑制分子，通过充当lag3的主要配体来抑制抗原特异性t细胞激活。fgl-1负责lag3 t细胞抑制功能，并且独立于mhc ii类(mhc-ii)而结合lag3。
[0935]
fgl-1的氨基酸序列可以从uniprot登录号q08830获得，如下文seq id no.108所示。
[0936]
seq id no.108(fgl1全序列)
[0937]
makvfsfilvttaltmgreisaledcaqeqmrlraqvrlletrvkqqqvkikqllqenevqfldkgdentvidlgskrqyadcseifndgyklsgfykikplqspaefsvycdmsdgggwtviqrrsdgsenfnrgwkdyengfgnfvqkhgeywlgnknlhflttqedytlkidladfeknsryaqyknfkvgdeknfyelnigeysgtagdslagnfhpevqwwashqrmkfstwdrdhdnyegncaeedqsgwwfnrchsanlngvyysgpytaktdngivwytwhgwwyslksvvmkirpndfipnvi
[0938]
fgl1的信号肽如下文seq id no.109所示。
[0939]
seq id no.109(fgl1信号肽)
[0940]
makvfsfilvttaltmgreisa
[0941]
本发明的效应免疫细胞可以包含fgl1或来自fgl1的lag-3结合结构域以及任选地，fgl1信号肽。
[0942]
本发明的效应免疫细胞可以包含fgl1的膜锚定型式或其部分。fgl1可以使用跨膜结构域和任选的间隔物序列和/或胞内域锚定到膜上。例如，fgl1或其部分可以使用cd8茎间隔物、跨膜结构域和截短的胞内域锚定到膜上，这在wo2013/153391中已经针对分类自杀基因rqr8进行了描述。
[0943]
b7-h3
[0944]
b7-h3也称为cd276，是一些实体瘤表达的免疫检查点分子，参与t细胞介导的免疫应答的调节。
[0945]
b7-h3的氨基酸序列可以从uniprot登录号q5zpr3获得，如下文seq id no.110所示。
[0946]
seq id no.110(b7-h3全序列)
[0947]
mlrrrgspgmgvhvgaalgalwfcltgalevqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppealwvtvglsvcliallvalafvcwrkikqsceeenagaedqdgegegsktalqplkhsdskeddgqeia
[0948]
b7-h3的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.111、112和113所示。
[0949]
seq id no.111(b7-h3信号肽)
[0950]
mlrrrgspgmgvhvgaalgalwfcltga
[0951]
seq id no.112(b7-h3细胞外结构域)
[0952]
levqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppea
[0953]
seq id no.113(b7-h3跨膜结构域)
[0954]
lwvtvglsvcliallvalafv
[0955]
本发明的效应免疫细胞可以包含b7-h3细胞外结构域以及任选地，b7-h3信号肽和/或b7-h3跨膜结构域。
[0956]
b7-h4
[0957]
b7-h4，也称为含v-set结构域的t细胞激活抑制剂1，是b7共刺激蛋白家族的另一个成员，充当免疫检查点分子。b7-h4通过抑制t细胞激活、增殖、细胞因子产生和细胞毒性的发展来负调节t细胞介导的免疫应答。当在肿瘤巨噬细胞的细胞表面表达时，b7-h4与调节性t细胞(treg)一起在抑制肿瘤相关的抗原特异性t细胞免疫中起重要作用。
[0958]
b7-h4的氨基酸序列可以从uniprot登录号q7z7d3获得，如下文seq id no.114所示。
[0959]
seq id no.114(b7-h4全序列)
[0960]
maslgqilfwsiisiiiilagaialiigfgisgrhsitvttvasagnigedgilsctfepdiklsdiviqwlkegvlglvhefkegkdelseqdemfrgrtavfadqvivgnaslrlknvqltdagtykcyiitskgkgnanleyktgafsmpevnvdynassetlrceaprwfpqptvvwasqvdqganfsevsntsfelnsenvtmkvvsvlynvtinntyscmiendiakatgdikvteseikrrshlqllnskaslcvssffaiswallplspylmlk
[0961]
b7-h4的信号肽、细胞外结构域和跨膜结构域分别如下文seq id no.115、116和117所示。
[0962]
seq id no.115(b7-h4信号肽)
[0963]
maslgqilfwsiisiiiilagaia
[0964]
seq id no.116(b7-h4细胞外结构域)
[0965]
liigfgisgrhsitvttvasagnigedgilsctfepdiklsdiviqwlkegvlglvhefkegkdelseqdemfrgrtavfadqvivgnaslrlknvqltdagtykcyiitskgkgnanleyktgafsmpevnvdynassetlrceaprwfpqptvvwasqvdqganfsevsntsfelnsenvtmkvvsvlynvtinntyscmiendiakatgdikvteseikrrshlqllnskas
[0966]
seq id no.117(b7-h4跨膜结构域)
[0967]
lcvssffaiswallplspylm
[0968]
本发明的效应免疫细胞可以包含b7-h4细胞外结构域以及任选地，b7-h4信号肽
和/或b7-h4跨膜结构域。
[0969]
效应免疫细胞可以表达包含以下蛋白质的细胞外结构域的蛋白质：pd-l1、pd-l2、hvem、cd155、vsig-3、galectin-9、hla-g、ceacam-1、lsectin、fgl1、b7-h3、b7-h4，该细胞外结构域具有上文所示的序列或其变体，例如具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸同一性的变体，条件是所得蛋白质分子保留结合靶免疫细胞上的抑制性免疫受体以及抑制靶免疫细胞的激活的能力。
[0970]
膜定位结构域
[0971]
效应免疫细胞可以表达包含免疫抑制分子的细胞外结构域和膜定位结构域的融合蛋白。
[0972]
膜定位结构域可以是引起融合蛋白附着或保持在接近质膜的位置的任何序列。
[0973]
膜定位结构域可以是或包含引起新生多肽最初附着于er膜的序列。当膜材料从er“流”向高尔基体并最终流向质膜时，蛋白质在合成/易位过程结束时保持与膜结合。
[0974]
例如，膜定位结构域可以包含跨膜序列、终止转移序列、gpi锚定物或豆蔻酰化/异戊二烯化/棕榈酰化位点。
[0975]
豆蔻酰化是脂化修饰，其中衍生自肉豆蔻酸的豆蔻酰基通过酰胺键共价连接到n末端甘氨酸残基的α-氨基基团上。肉豆蔻酸是14-碳饱和脂肪酸，也称为正十四烷酸。修饰可以在共翻译或翻译后添加。n-肉豆蔻酰基转移酶(nmt)在细胞的细胞质中催化肉豆蔻酸加成反应。由于疏水性肉豆蔻酰基基团与细胞膜中的磷脂相互作用，豆蔻酰化引起其附着的蛋白质靶向膜。
[0976]
融合蛋白可以包含能够被nmt酶豆蔻酰化的序列。当在细胞中表达时，融合蛋白可以包含肉豆蔻酰基基团。
[0977]
融合蛋白可以包含共有序列，诸如：nh2-g1-x2-x3-x4-s5-x6-x7-x8，该序列被nmt酶识别。
[0978]
棕榈酰化是脂肪酸(诸如棕榈酸)与蛋白质的半胱氨酸残基的共价连接，而与蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基的共价连接较少。棕榈酰化增强了蛋白质的疏水性，可用于诱导膜结合。与异戊二烯化和豆蔻酰化相比，棕榈酰化通常是可逆的(因为棕榈酸和蛋白质之间的键通常是硫酯键)。逆反应由棕榈酰蛋白硫酯酶催化。
[0979]
在经由g蛋白的信号转导中，α亚基的棕榈酰化、γ亚基的异戊二烯化和豆蔻酰化涉及将g蛋白拘束在质膜的内表面，从而使g蛋白可以与其受体相互作用。
[0980]
融合蛋白可以包含能够被棕榈酰化的序列。当在引起膜定位的细胞中表达时，融合蛋白可以包含另外的脂肪酸。
[0981]
异戊二烯化(prenylation)(也称为异戊二烯化(isoprenylation)或脂化)是将疏水分子添加到蛋白质或化合物中。异戊二烯基(3-甲基-丁基-2-烯-1-基)有助于附着在细胞膜上，与gpi锚定物等脂质锚定物相似。
[0982]
蛋白质异戊二烯化涉及将法尼基或香叶基-香叶基部分转移到靶蛋白的c末端半胱氨酸。在细胞中有三种进行异戊二烯化的酶：法尼基转移酶、caax蛋白酶和香叶基香叶基转移酶i。
[0983]
融合蛋白可以包含能够被异戊二烯化的序列。当在引起膜定位的细胞中表达时，融合蛋白可以包含一个或多个异戊二烯基基团。
[0984]
细胞质结构域
[0985]
融合蛋白可以包含来自衍生细胞外结构域的免疫抑制分子以外的蛋白质的细胞质结构域。
[0986]
胞质结构域可以稳定融合蛋白。例如，细胞质结构域可以衍生自cd19。cd19的完整的细胞质结构域如下文seq id no.118所示。融合蛋白可以包含该序列的全部或部分。例如，融合蛋白可以包含cd19的细胞质部分的前10、15、20或25个氨基酸。融合蛋白可以包含cd19的细胞质部分的前19个氨基酸并且具有如seq id no.119所示的序列。
[0987]
seq id no.118(cd19胞内域)
[0988]
qralvlrrkrkrmtdptrrffkvtpppgsgpqnqygnvlslptptsglgraqrwaaglggtapsygnpssdvqadgalgsrsppgvgpeeeegegyeepdseedsefyendsnlgqdqlsqdgsgyenpedeplgpededsfsnaesyenedeeltqpvartmdflsphgsawdpsreatslgsqsyedmrgilyaapqlrsirgqpgpnheedadsyenmdnpdgpdpawggggrmgtwstr
[0989]
seq id no.119(截短的cd19胞内域)
[0990]
qralvlrrkrkrmtdptrr
[0991]
共刺激胞内域
[0992]
效应免疫细胞可以表达包含免疫抑制分子的细胞外结构域和共刺激胞内域的融合蛋白。
[0993]
共刺激胞内域可以是或包含选自以下蛋白质之一的胞内域：cd28、icos、ctla4、41bb、cd27、cd30、ox-40、taci、gitr、cd2和cd40。这些胞内域的氨基酸序列分别如下文seq id no.120-130所示。
[0994]
seq id no.120(cd28胞内域)
[0995]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
[0996]
seq id no.121(icos胞内域)
[0997]
cwltkkkysssvhdpngeymfmravntakksrltdvtl
[0998]
seq id no.122(ctla4胞内域)
[0999]
avslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipin
[1000]
seq id no.123(41bb胞内域)
[1001]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[1002]
seq id no.124(cd27胞内域)
[1003]
qrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp
[1004]
seq id no.125(cd30胞内域)
[1005]
chrracrkrirqklhlcypvqtsqpklelvdsrprrsstqlrsgasvtepvaeerglmsqplmetchsvgaayleslplqdaspaggpssprdlpeprvstehtnnkiekiyimkadtvivgtvkaelpegrglagpaepeleeeleadhtphypeqetepplgscsdvmlsveeegkedplptaasgk
[1006]
seq id no.126(ox-40胞内域)
[1007]
alyllrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki
[1008]
seq id no.127(taci胞内域)
[1009]
kkrgdpcscqprsrprqspakssqdhameagspvstspepvetcsfcfpecraptqesavtpgtpdptcagrwgchtrttvlqpcphipdsglgivcvpaqeggpga
[1010]
seq id no.128(gitr胞内域)
[1011]
qlglhiwqlrsqcmwpretqlllevppstedarscqfpeeergersaeekgrlgdlwv
[1012]
seq id no.129(cd2胞内域)
[1013]
krkkqrsrrndeeletrahrvateergrkphqipastpqnpatsqhpppppghrsqapshrppppghrvqhqpqkrppapsgtqvhqqkgpplprprvqpkpphgaaenslspss
[1014]
seq id no.130(cd40胞内域)
[1015]
kkvakkptnkaphpkqepqeinfpddlpgsntaapvqetlhgcqpvtqedgkesrisvqerq
[1016]
融合蛋白可以包含胞内域的组合，诸如cd28和ox-40或cd28和4-1bb。
[1017]
融合蛋白可以包含如seq id no.120-130所示序列之一的变体，例如具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸同一性的变体，条件是所得序列保留向效应免疫细胞提供增殖和/或存活信号的能力。
[1018]
核酸序列
[1019]
本发明还提供了编码融合蛋白的核酸序列，其包含免疫抑制分子的细胞外结构域，连同：
[1020]
(a)异质性跨膜结构域(即不衍生自免疫抑制分子)；和/或
[1021]
(b)异质性胞内域(即不衍生自免疫抑制分子)。
[1022]
胞内域可以包含一个或多个如上文所定义的共刺激结构域。
[1023]
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
[1024]
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映多肽将在其中表达的任何特定宿主生物体的密码子使用。
[1025]
根据本发明的核酸可以包含dna或rna。它们可以是单链的或双链的。它们也可以是其中包括合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。许多不同类型的寡核苷酸修饰是本领域已知的。这些修饰的包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应当理解，多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
[1026]
与核苷酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括来自序列或对序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变化、修饰、置换、缺失或添加。
[1027]
核酸构建体
[1028]
本发明还提供了核酸构建体，其包含：
[1029]
(i)第一核酸序列，其编码如上文所定义的细胞表面受体或细胞表面受体复合物的部分；和
[1030]
(ii)第二核酸序列，当在细胞中表达时其赋予该细胞对免疫抑制剂的抗性；和/或
[1031]
(iii)第三核酸序列，其编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域的融合蛋白。
[1032]
第一核酸序列可以编码：
[1033]
(a)嵌合抗原受体(car)；和/或
[1034]
(b)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的mhc i类多肽的胞外域
或mhc ii类多肽的胞外域；或与细胞内信号传导结构域连接的β-2微球蛋白；
[1035]
(c)工程化的多肽，其包含与cd3/tcr复合物的组分连接的mhc i类多肽或mhc ii类多肽或β-2微球蛋白，诸如cd3-ζ、cd3-ε、cd3-γ或cd3-δ；
[1036]
(d)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的结合结构域，诸如抗体样结合结构域，其与mhc i类多肽、mhc ii类多肽或β-2微球蛋白结合；
[1037]
(f)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的cd79α或cd79β；
[1038]
(g)工程化的多肽，其包含与细胞内信号传导结构域连接的cd4的mhc ii类结合结构域；或与细胞内信号传导结构域连接的cd8的mhci类结合结构域；或
[1039]
(e)双特异性多肽，其包含：(i)第一结合结构域，其与mhc i类多肽、mhc ii类多肽、β-2微球蛋白结合；(ii)第二结合结构域，其与tcr/cd3复合物的组分结合。
[1040]
第二核酸序列可以编码：
[1041]
(e)变体钙调磷酸酶，其与野生型钙调磷酸酶相比对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性增加；和/或
[1042]
(f)显性负性的csk。
[1043]
第三核酸序列可以编码：
[1044]
(g)免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域的融合蛋白。在第一个实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含：
[1045]
(i)第一核酸序列，其编码特异性结合trbc1或trbc2的car；和
[1046]
(ii)第二核酸序列，其编码与野生型钙调磷酸酶相比对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性增加的变体钙调磷酸酶，和/或显性负性的csk；和/或
[1047]
(iii)第三核酸序列，其编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白。
[1048]
在第二个实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含：
[1049]
(i)第一核酸序列，其编码与细胞内信号传导结构域连接的β-2微球蛋白；和
[1050]
(ii)第二核酸序列，其编码与野生型钙调磷酸酶相比对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性增加的变体钙调磷酸酶，和/或显性负性的csk；和/或
[1051]
(iii)第三核酸序列，其编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子细胞外结构域的融合蛋白。
[1052]
第二个实施方案的核酸构建体还可以包含编码car的核酸序列。
[1053]
核酸在构建体中可以是任何顺序的。编码分离的多肽的核酸可以被共表达位点隔开，该共表达位点使得两条多肽能够作为单独的实体共表达。它可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生由切割位点连接的两条多肽。切割位点可以是自切割的，使得当多肽产生时，它立即被切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。
[1054]
切割位点可以是能够使两条多肽分离的任何序列。
[1055]
为方便起见，本文使用术语“切割”，但切割位点可引起肽通过经典的切割以外的机制分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽(参见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：通过宿主细胞蛋白酶的蛋白水解、自身蛋白水解或转录效应(donnelly等人(2001)j.gen.virol.82:1027-1041)。此类“切割”的确切机制对于本发明的目的来说并不重要，只要切割位点当位于编码蛋白质的核酸序列之间时，会引起蛋白质作
为分开的实体表达。
[1056]
例如，切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)切割位点、烟草蚀刻病毒(tev)切割位点或编码自切割肽。
[1057]“自切割肽”是指这样的肽，其发挥功能使得当产生包含蛋白质和自切割肽的多肽时，该多肽立即被“切割”或分离成不同的和分离的第一和第二多肽而不需要任何外部切割活动。
[1058]
自切割肽可以是来自口疮(aphtho)病毒属或心病毒属的2a自切割肽。口疮病毒属和心病毒属的初级2a/2b切割是由2a在其自身的c末端“切割”介导的。在口疮疫病毒属诸如口蹄疫病毒(fmdv)和马鼻炎a病毒中，2a区域是约18个氨基酸的短的节段，其连同蛋白质2b的n末端残基(保守的脯氨酸残基)表示能够在其自身的c末端介导“切割”的自主元件(如上文donelly等人(2001))。
[1059]
已经在除了口疮病毒属或心病毒属之外的小核糖核酸病毒、“小核糖核酸样”昆虫病毒、c型轮状病毒内，以及锥虫属(trypanosoma spp)内的重复序列和细菌序列中发现了“2a样”序列(如上文donnelly等人(2001))。
[1060]
切割位点可以包含如seq id no.131(raegrgslltcgdveenpgp)所示的2a样序列。
[1061]
载体
[1062]
本发明还提供了载体或载体的试剂盒，其包含一个或多个根据本发明的核酸序列或核酸构建体。此类载体可用于将核酸序列引入宿主细胞，使得宿主细胞表达细胞表面受体或受体复合物，连同一种或多种赋予宿主细胞(即效应免疫细胞)相比于靶免疫细胞有选择性优势的蛋白质。
[1063]
载体试剂盒可以包含：
[1064]
(i)第一载体，其包含编码细胞表面受体或细胞表面受体复合物的部分的核酸序列；和
[1065]
(ii)第二载体，其包含核酸序列，当在细胞中表达时，该核酸序列赋予该细胞对免疫抑制剂的抗性；和/或
[1066]
(iii)第三载体，其包含编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域的融合蛋白的核酸序列。
[1067]
在第一个实施方案中，本发明提供了载体的试剂盒，其包含：
[1068]
(i)第一载体，其包含编码car的核酸序列，该car特异性结合trbc1或trbc2；和
[1069]
(ii)第二载体，其包含编码与野生型钙调磷酸酶相比对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性增加的变体钙调磷酸酶，和/或显性负性的csk的核酸序列；和/或
[1070]
(iii)第三载体，其包含编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域的融合蛋白的核酸序列。
[1071]
在第二个实施方案中，本发明提供了载体的试剂盒，其包含：
[1072]
(i)第一载体，其包含编码与细胞内信号传导结构域连接的β-2微球蛋白的核酸序列；和
[1073]
(ii)第二载体，其包含编码与野生型钙调磷酸酶相比对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂的抗性增加的变体钙调磷酸酶，和/或显性负性的csk的核酸序列；和/或
[1074]
(iii)第三载体，其包含编码免疫抑制分子或包含免疫抑制分子的细胞外结构域
的融合蛋白的核酸序列。
[1075]
第二个实施方案的载体试剂盒还可以包含包含编码car的核酸序列的载体。
[1076]
例如，载体可以是质粒或病毒载体，诸如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。
[1077]
载体可以能够转染或转导细胞，诸如t细胞或nk细胞。
[1078]
细胞
[1079]
本发明提供了效应免疫细胞。
[1080]
细胞可以包含本发明的核酸序列、核酸构建体或载体。
[1081]
细胞可以是溶细胞性免疫细胞，诸如t细胞或nk细胞。
[1082]
t细胞或t淋巴细胞是一类在细胞介导的免疫中起核心作用的淋巴细胞。它们可以通过细胞表面上t细胞受体(tcr)的存在与其他淋巴细胞诸如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)区分开。存在多种类型的t细胞，总结如下。
[1083]
辅助性t辅助细胞(th细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括b细胞成熟为浆细胞和记忆b细胞，以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的激活。th细胞在其表面表达cd4。当抗原呈递细胞(apc)表面上的mhc ii类分子向th细胞呈递肽抗原时th细胞变为激活的。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括th1、th2、th3、th17、th9或tfh，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
[1084]
溶细胞性t细胞(tc细胞或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。ctl在其表面表达cd8。这些细胞通过结合与在所有有核细胞表面存在的mhc i类相关的抗原来识别它们的靶。通过调节性t细胞分泌的il-10、腺苷以及其他分子，可使cd8 细胞失活至无能状态，从而预防自身免疫性疾病，诸如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
[1085]
记忆t细胞是抗原特异性t细胞的子集，在感染消退后会长期存在。在它们再次暴露于其同源抗原后迅速扩增成大量的效应t细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆t细胞包含三种亚型：中央记忆t细胞(tcm细胞)和两种效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4 或cd8 。记忆t细胞通常表达细胞表面蛋白cd45ro。
[1086]
调节性t细胞(treg细胞)，以前称为抑制性t细胞，对于维持免疫耐受至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭t细胞介导的免疫，并抑制在胸腺中逃脱阴性选择过程的自身反应性t细胞。
[1087]
已经描述了两个主要类型的cd4 treg细胞—天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。
[1088]
天然存在的treg细胞(也称为cd4 cd25 foxp3 treg细胞)出现在胸腺中，并且已经与发育中的t细胞和已被tslp激活的髓样(cd11c )和浆细胞样(cd123 )树突状细胞之间的相互作用相关联。由于称为foxp3的细胞内分子的存在，可以将天然存在的treg细胞与其他t细胞区分开。foxp3基因的突变可以阻止调节性t细胞发育，引起致命的自身免疫性疾病ipex。
[1089]
适应性treg细胞(也称为tr1细胞或th3细胞)可能在正常的免疫应答期间起源。
[1090]
细胞可以是自然杀伤细胞(或nk细胞)。nk细胞是先天免疫系统的一部分。nk细胞以不依赖于mhc的方式对来自病毒感染的细胞的先天信号提供快速应答。
[1091]
将nk细胞(属于先天淋巴细胞组)定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)，构成从产生b和t
淋巴细胞的共同淋巴祖细胞分化而来的第三种细胞。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后它们从那里进入循环。
[1092]
本发明的细胞可以是上文提及的任何细胞类型。
[1093]
根据本发明的细胞可以从患者自身的外周血(第一方)、或者在造血干细胞移植的情况下从供体外周血(第二方)或从无关联的供体的外周血(第三方)中离体产生。
[1094]
或者，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如t细胞或nk细胞。或者，可以使用保留其溶解功能并可充当治疗剂的永生化t细胞系。
[1095]
在所有这些实施方案中，表达嵌合多肽的细胞是通过包括用病毒载体转导、用dna或rna转染的多种方法中的一种引入编码嵌合多肽的dna或rna产生的。
[1096]
本发明的细胞可以是来自受试者的离体细胞。细胞可以来自外周血单核细胞(pbmc)样品。细胞可以在用编码根据本发明第一方面提供的嵌合多肽的分子的核酸转导之前激活和/或扩增，例如通过用抗cd3单克隆抗体处理。
[1097]
本发明的细胞可以通过以下方法制备：
[1098]
(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含有细胞的样品；和
[1099]
(ii)用一种或多种本发明的核酸序列、核酸构建体或载体转导或转染细胞。
[1100]
然后可以纯化细胞，例如，基于一种或多种异源核酸序列的表达来选择。
[1101]
效应免疫细胞能够识别并杀伤靶免疫细胞。靶免疫细胞可以是溶细胞性免疫细胞，诸如上文所定义的t细胞或nk细胞。
[1102]
药物组合物
[1103]
本发明还涉及含有多个根据本发明的细胞的药物组合物。
[1104]
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种进一步的有药学活性的多肽和/或化合物。例如，此类制剂可以是适合静脉输注的形式。
[1105]
治疗方法
[1106]
本发明提供了治疗疾病的方法，该方法包括向受试者施用本发明的细胞(例如在如上文所述的药物组合物中)的步骤。
[1107]
治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在此，可以向患有现有疾病或病症的受试者施用细胞，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
[1108]
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防用途。在此，可以向尚未感染疾病和/或未表现出任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的病因，或者减少或阻止与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能具有疾病的易感性或被认为有发展疾病的风险。
[1109]
方法可以涉及以下步骤：
[1110]
(i)分离含有细胞的样品；
[1111]
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；
[1112]
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
[1113]
含有细胞的样品可以如上文所述分离自受试者或其他来源。
[1114]
本发明还提供了用于在受试者中治疗疾病的方法，其包括以下步骤：
[1115]
(i)向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含多个经工程化改造以对免疫抑制剂具有抗性的效应免疫细胞；和
[1116]
(ii)向受试者施用免疫抑制剂。
[1117]
效应免疫细胞可以表达经工程化改造以对一种或多种钙调磷酸酶抑制剂具有抗性的变体钙调磷酸酶，例如：
[1118]
包含突变t351e和l354a的钙调磷酸酶a，参照如seq id no.65所示；
[1119]
包含突变v314r和y341f的钙调磷酸酶a，并且参照如seq id no.65所示；或
[1120]
包含突变l124t和k-125-la-ins的钙调磷酸酶b，参照如seq id no.66所示。
[1121]
步骤(ii)可以涉及向细胞或向患者施用环孢菌素和/或他克莫司。
[1122]
效应细胞可以表达dncsk并且步骤(ii)可以涉及向受试者施用任何免疫抑制剂，例如雷帕霉素。
[1123]
本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的本发明的细胞。
[1124]
本发明还涉及本发明的细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
[1125]
通过本发明的方法治疗的疾病可以是癌性疾病，诸如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
[1126]
疾病可以是多发性骨髓瘤(mm)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、神经母细胞瘤、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)或弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。
[1127]
疾病可以是浆细胞病症，诸如浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变、华氏(waldenstrom’s)巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链病、意义未明的单克隆丙种球蛋白病或冒烟型多发性骨髓瘤。
[1128]
本发明的效应免疫细胞能够杀伤靶免疫细胞，其可以是对效应免疫细胞起反应的癌细胞或正常免疫细胞。
[1129]
本发明还提供了从免疫细胞群中耗竭同种异体反应性免疫细胞的方法，该方法包括使免疫细胞群与多个具有如上文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物的效应免疫细胞接触的步骤。
[1130]
本发明还提供了治疗或预防异体移植后移植物排斥的方法，该方法包括向受体受试者施用来源于供体受试者的多个效应免疫细胞用于同种异体移植的步骤，所述多个效应免疫细胞表达如上文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物。
[1131]
效应免疫细胞可以在移植之前、之后或同时向患者施用。例如，对于器官移植，可以在移植前将来自器官供体的表达如上文所述的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物的效应t细胞输注到受体中，以消除可能介导移植物排斥的同种异体反应性t细胞。或者，在hsct的情况下，表达如上文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物的受体t细胞可以在输注前与干细胞移植物一起培养，以消除可能攻击宿主组织的供体同种异体反应性t细胞。
[1132]
还提供了用于治疗或预防与同种异体移植相关的移植物抗宿主病(gvhd)的方法，该方法包括使同种异体移植物与施用多个具有如上文所定义的工程化的mhc i类或mhc ii类复合物的效应免疫细胞接触的步骤。
[1133]
同种异体移植可以涉及同种异体免疫细胞的过继转移。
[1134]
还提供了已通过本发明的方法耗竭了同种异体反应性免疫细胞的同种异体移植物。还提供了包含本发明的效应免疫细胞的同种异体移植物。
[1135]
还提供了本发明的效应免疫细胞，其用于：
[1136]
从免疫细胞群中耗竭同种异体反应性免疫细胞；
[1137]
同种异体移植后治疗或预防移植物排斥；或
[1138]
治疗或预防与同种异体移植相关的移植物抗宿主病(gvhd)。
[1139]
还提供了本发明的效应免疫细胞在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于：
[1140]
从免疫细胞群中耗竭同种异体反应性免疫细胞；
[1141]
同种异体移植后治疗或预防移植物排斥；或
[1142]
治疗或预防与同种异体移植相关的移植物抗宿主病(gvhd)。
[1143]
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例意在服务于帮助本领域的普通技术人员实施本发明，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[1144]
实施例1—显示靶t细胞对结合trbc1的car-t细胞“反向”杀伤的模式系统的创建
[1145]
wo2015/132598描述了特异性结合tcrβ恒定区1(trbc1)的car，其包含分别如seq id no.7和8所示的vh和vl结构域。
[1146]
创建了这个car缺乏信号传导结构域的截短型式，命名为djovi；djovi与靶细胞上的trbc1结合，但无法触发t细胞激活和杀伤。用表达djovi或全长car(jovi)的载体连同描述于wo2013/153391中的分类自杀基因rqr8一起转导pbmc。转导了jovi或djovi的pbmc与trbc1 靶pbmc以1:2的效应物:靶标比例共培养，并在共培养24h后对活的转导的(rqr8 )t细胞进行计数。结果如图12所示。在转导了djovi的pbmc上观察到trbc1 靶细胞对效应细胞的杀伤程度更大，表明jovi与靶细胞上trbc1的结合足以触发靶t细胞激活并引起效应细胞的反向杀伤。
[1147]
实施例2—结合trbc1的car-t细胞的pdl1或pdl2表达减少效应细胞的反向杀伤
[1148]
为了研究工程化改造car-t细胞以传输抑制性免疫信号对靶t细胞反向杀伤的影响，转导pbmc以表达jovi或djovi连同缺乏细胞质结构域的截短型式的pd-l1或pdl2(dpdl1和dpdl2)。对于该测定，转导trbc1 靶pbmc以表达全长pd1。
[1149]
转导了jovi或djovi、表达dpdl1或dpdl2连同rqr8的pbmc与表达pd1的trbc1 靶pbmc以1:1的效应物:靶标比例建立共培养物。在共培养72h后对活的转导的(rqr8 )t细胞进行计数，并将每个条件归一化为其各自的jovi(或djovi)共培养。结果如图13所示。与单独的car相比，当dpdl1或dpdl2在car上表达时，观察到回收的转导细胞数量增加。
[1150]
实施例3—在钙调磷酸酶抑制剂存在的情况下，结合trbc1的car-t细胞的钙调磷酸酶突变体的表达减少效应细胞的反向杀伤
[1151]
转导了jovi-rqr8、表达钙调磷酸酶突变体的pbmc与trbc1 靶pbmc以1:1和1:4的效应物:靶标比例建立共培养物。将不同浓度的钙调磷酸酶抑制剂添加到共培养物中。在共培养72h后，通过流式细胞术对活的转导的(rqr8 )t细胞进行计数，并将每个条件归一化为未添加抑制剂的共培养物。
[1152]
实施例4—在免疫抑制剂存在的情况下，结合trbc1的car-t细胞的dncsk的表达减少效应细胞的反向杀伤
[1153]
转导了jovi-rqr8、表达dncsk的pbmc与trbc1 靶pbmc以1:1和1:4的效应物:靶标比例建立共培养物。将不同浓度的免疫抑制剂添加到共培养物中。在共培养72h后，通过流式细胞术对活的转导的(rqr8 )t细胞进行计数，并将每个条件归一化为未添加免疫抑制剂的共培养物。
[1154]
实施例5—表达β2m-cd3ζ的效应t细胞的pdl1或pdl2的表达减少靶细胞的反向杀伤
[1155]
为了研究添加抗排斥杀伤反应的情况下，工程化改造car-t细胞以传输抑制性免疫信号对靶t细胞反向杀伤的效果，转导pbmc以表达jovi、djovi或不相关的car，连同缺乏细胞质结构域的pd-l1或pdl2的截短形式(dpdl1和dpdl2)和由连接于cd3ζ的b2m(β2m-cd3ζ)组成的融合蛋白。对于该测定，在存在或不存在超抗原(sag)的情况下，转导trbc1 靶pbmc以表达全长pd1，从而将武装的mhc连接到tcr。超抗原不在细胞内处理。相反，它们将ii类mhc分子作为完整的大分子结合，并在肽-抗原结合沟之外结合。sag是不加选择地刺激最高20％的所有t细胞的分子(仅有0.01％的t细胞对抗原刺激正常响应)。
[1156]
转导了jovi或djovi或不相关的car、表达dpdl1或dpdl2连同β2m-cd3ζ的pbmc与表达pd1的trbc1 靶pbmc加上sag，以1:1的效应物:靶标比例建立共培养物。共培养72h后对活的转导的t细胞进行计数，并将每个条件归一化为其各自的jovi(或djovi)共培养物。
[1157]
实施例6—在钙调磷酸酶抑制剂存在的情况下，表达β2m-cd3ζ的t细胞的钙调磷酸酶突变体的表达减少靶细胞的反向杀伤
[1158]
用编码car(jovi、djovi或不相关的car)、β2m-cd3ζ和钙调磷酸酶突变体的载体转导的pbmc与trbc1 靶pbmc以1:1和1:4的效应物:靶标比例建立共培养物。将不同浓度的钙调磷酸酶抑制剂和sag添加到共培养物中。在共培养72h后，通过流式细胞术对活的转导的t细胞进行计数，并将每个条件归一化为未添加抑制剂或sag的共培养物。
[1159]
实施例7—在免疫抑制剂存在的情况下，表达β2m-cd3ζ的t细胞的dncsk的表达减少效应细胞的反向杀伤
[1160]
用编码car(jovi、djovi或不相关的car)、β2m-cd3ζ和dncsk的载体转导的pbmc与trbc1 靶pbmc以1:1和1:4的效应物:靶标比例建立共培养物。将不同浓度的免疫抑制剂和sag添加到共培养物中。在共培养72h后，通过流式细胞术对活的转导的t细胞进行计数，并将每个条件归一化为未添加免疫抑制剂或sag的共培养物。
[1161]
实施例8—结合trbc2的car-t细胞的钙调磷酸酶突变体的表达对钙调磷酸酶抑制剂的增殖抑制产生抗性
[1162]
用表达car连同在wo2013/153391中描述的分类自杀基因rqr8的载体转导pbmc。测试的car总结如下：
[1163]
cd19 car：第二代car，其具有衍生自fmc63的抗原结合结构域、铰链间隔物和41bb/cd3z胞内域
[1164]
trbc1 car：第二代car，其具有如wo2018/224844中所述的抗原结合结构域、铰链间隔物和41bb/cd3z胞内域
[1165]
trbc2 car：第二代car，其具有如wo2020/089644中所述的抗原结合结构域、cd8茎
间隔物和cd28/cd3z胞内域
[1166]
用表达rqr8、trbc2 car和上文所述具有seq id no.131的cnb30钙调磷酸酶突变体模块的三顺反子载体转导一个细胞群。
[1167]
转导的细胞与以下靶细胞类型中的一种共培养：
[1168]
jurkat trbc1：表达trbc1的野生型jurkat细胞
[1169]
jurkat ko：经过工程化改造以缺乏trbc1表达的jurkat细胞
[1170]
jurkat trbc2：使用crispr-cas9技术将trbc1基因替换为trbc2基因的jurkat细胞，使得trbc2的表达与野生型细胞上trbc1的表达相同。
[1171]
在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，细胞以1:4的e:t比例共培养96小时。基于其rqr8的表达鉴定转导的效应细胞，并使用细胞痕量紫(ctv)稀释分析它们的增殖。结果在图16和17中显示。正如预期的那样，在不存在他克莫司的情况下，表达trbc1 car的细胞在与表达trbc1的靶细胞共培养后，显示增殖细胞的百分比和数量增加；表达trbc2 car的细胞在与表达trbc2的靶细胞共培养后，显示增殖细胞的百分比和数量增加(图16)。在存在他克莫司的情况下，car-t细胞的增殖受到抑制，如通过比较图16b(不添加他克莫司)和图17b(添加他克莫司)中的“trbc2 car”可以看出。只有共表达trbc2 car和cnb30钙调磷酸酶突变体的细胞在与表达trbc2的靶标共培养后显示转导的效应细胞的绝对数量增加(图17b)。该群体还显示出最高百分比的转导的增殖细胞(图17a)。
[1172]
还使用cd19 car作为阴性对照，使用flowjo增殖工具对单个/活的/细胞痕量紫色阳性细胞计算进行增殖分析。针对上述每个car 靶标组合绘制了每个分裂中的细胞数，结果在图18(不添加他克莫司)和19(添加他克莫司)中显示。图20的直方图中也显示了两个单独供体的结果。同样，在存在他克莫司的情况下，只有共表达trbc2 car和cnb30钙调磷酸酶突变体的细胞在与表达trbc2的靶标共培养后显示出效应细胞增殖的增加(图19，下图；和图20)。
[1173]
在一项相似的研究中，在存在或不存在20ng/ml他克莫司的情况下，将转导以单独表达trbc2 car或表达trbc2 car与钙调磷酸酶突变体(cnb30)的组合的细胞与trbc2 阳性靶标共培养4天。图21显示了4天的共培养后表达car的细胞的数量。在他克莫司存在下共培养后，唯一具有大量表达trbc2 car的细胞的细胞群是共表达trbc2 car和钙调磷酸酶突变体(trbc2 car cnb30)的细胞。
[1174]
图22显示了表达rqr8的细胞的百分比。虽然表达cd19的细胞的百分比保持不变，但在不存在他克莫司的情况下与trbc2 靶标共培养后，表达trbc2 car的细胞的百分比增加。这对于单独表达trbc2 car或共表达trbc2 car与钙调磷酸酶突变体的组合的细胞是正确的。在存在他克莫司的情况下，单独表达trbc2 car的rqr8 细胞的百分比降低，表明他克莫司抑制这些细胞的增殖。相比之下，共表达trbc2 car/cnb30的rqr8 细胞的百分比与不添加他克莫司的共培养中相同，表明这些细胞显示出对钙调磷酸酶抑制的抗性。
[1175]
实施例9—研究表达抗trbc2的细胞的钙调磷酸酶突变体的表达对表达trbc2的靶细胞反向杀伤的影响
[1176]
将来自健康供体的pbmc磁性分选为trbc1 和trbc2 部分。激活2天后，用表达rqr8和cd19或如上文所述的trbc2 car的逆转录病毒载体转导trbc1 部分。用表达rqr8、trbc2 car和上文所述具有seq id no.131的cnb30钙调磷酸酶突变体模块的三顺反子载体转导一
个细胞群。
[1177]
细胞在转导后第3天不经处理或用20ng/ml他克莫司处理，并在这些条件下再扩增4天。转导后7天，以1:1和1:4的效应物:靶标比例设置杀伤测定，并且未转导的trbc2 部分用细胞痕量紫标记并用作自体靶标。
[1178]
72h后通过流式细胞术评估杀伤，收集来自共培养物的上清液并分析ifnγ和il-2的产生。基于其rqr8的表达鉴定转导的效应细胞。结果如图23至26所示。
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在存在他克莫司的情况下扩增和共培养后，与单独表达trbc2 car的效应细胞群相比，观察到共表达trbc2 car与cnb30钙调磷酸酶突变体的效应细胞群的靶细胞杀伤提高(图23)。当细胞以1:4的e:t比例共培养时，这种效果尤其明显。
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在不存在他克莫司的情况下以1:1的比例与表达trbc2的pbmc共培养72h后，可检测到一些表达抗trbc2 car的细胞(图24，第一张图)。然而，当表达car的细胞与表达trbc2的pbmc以1:4的比例共培养时，car t细胞计数接近于零(图24，第二张图)，可能是由于靶细胞对表达car的细胞的反向杀伤。
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然而，在存在他克莫司的情况下扩增和共培养后，共表达trbc2 car与cnb30钙调磷酸酶突变体的效应细胞群即使以1:4的比例共培养后也显示出一定的存活/增殖。在1:1的共培养比例下，共表达trbc2 car与cnb30钙调磷酸酶突变体的效应细胞群比单独表达trbc2 car的效应细胞群显示出更高的存活/增殖(图24，第三张和第四张图)。
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在存在他克莫司的情况下扩增和共培养后，共表达trbc2 car与cnb30钙调磷酸酶突变体的细胞群比单独表达trbc2 car的细胞群在细胞因子释放方面也显示出增加的t细胞激活。这对于ifnγ(图25)和il-2(图26)都是正确的。
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总之，这些数据表明，表达car的细胞的钙调磷酸酶突变体的表达使效应细胞相对于靶t细胞具有优势，并且阻止靶细胞的反向杀伤。
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