ESD4基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用

esd4基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物耐盐胁迫技术领域，具体涉及一种esd4基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用。


背景技术：

2.目前全球盐碱地面积高达1
×
10
9 hm
²
，占陆地面积7%，中国盐碱地面积达1
×
10
8 hm
²
，可见土地盐碱化已成为全球性的问题。土壤中高浓度的盐离子（主要是na ）会对植物造成盐害或盐胁迫，影响植物的正常生长发育，造成农业损失和植物生态系统严重恶化；同时，由于灌溉措施不当、过度施肥以及工业污染等致使次生土地盐碱化问题加剧，也对可持续农业系统产生了灾难性影响。土壤盐渍化已成为影响全球粮食产量和质量的重要因素之一，并有日益增长的趋势。因而，深入研究植物耐盐性的机理机制，为开发耐盐作物及盐渍化土地的利用与改良提供依据，对推动农业可持续发展具有重要意义。
3.植物耐盐性是一个受遗传、生理和环境等多种因素调控的复杂性状，破译不同植物的耐盐性，进一步完善植物盐胁迫响应机制能更有效地指导作物抗逆遗传改良。植物耐盐性是一个复杂的数量性状，是由多基因协同控制的；这些基因直接或间接参与离子积累和排斥、氧化还原反应和特定渗透调节物质的积累等。例如，过表达ptvp1.1 (h

焦磷酸酶基因)的毛果杨根内na

减少h

增多，从而提高了植物耐盐性；osccd1 可能影响dreb2b和它的下游基因，过表达osccd1 基因增强了水稻幼苗对外源aba的响应，进而提高对渗透和盐胁迫的耐受性。植物盐响应基因数量庞大，表达模式多样化，致使盐功能基因表达网络十分复杂。在不同作物中继续寻找耐盐差异基因，挖掘新基因和相关应答元件对提高作物抗盐性或选育高耐盐作物具有重要的意义。
4.公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

5.发明人研究发现，esd4的功能缺失或低表达能够增加植物对盐胁迫的耐受；并通过鉴定拟南芥esd4功能缺失点突变体，发现突变体与野生型相比对盐胁迫的抗性明显提高。
6.根据本公开的一个方面，基于esd4基因（如seq id no.1所示）或其同源基因能够实现对植物盐胁迫抗性的调控。
7.在本公开的一些实施例中，通过诱导esd4基因功能位点突变或下调其表达以提高植物盐胁迫抗性。
8.根据本公开的另一个方面，利用esd4基因的干扰载体、沉默表达载体或下调表达载体进行植物盐胁迫抗性的提高或耐盐植物品种的选育。如，通过blast获得作物中与拟南芥esd4的同源基因，然后通过crispr-cas9技术对esd4基因进行编辑，敲除或降低其表达，最后通过遗传转化筛选作物中esd4基因被敲除或降低表达的植株。
lima 2000）。
22.拟南芥esd4基因编码一个sumo蛋白酶，参与植物的去sumo化修饰，esd4功能缺失会导致植物体内sumo化修饰蛋白水平升高。但是，目前并未发现esd4在植物盐胁迫中的功能及作用的相关报道。esd4可以与aba信号通路中的snrk2.6蛋白激酶相互作用，负调控aba的信号转导，有可能通过此机制参与植物的盐胁迫。本技术通过以下实施例进行了验证。
23.实施例一：拟南芥esd4突变耐盐胁迫验证试验（一）esd4突变体的获取esd4（基因号：at4g15880）功能缺失点突变体esd4的获取：购自于arashare科学网站（https://www.arashare.cn/index/）。
24.（二）esd4突变体的鉴定1. 播种：将拟南芥esd4突变体种子置于1.5 ml离心管中，分别用 70%乙醇和无水乙醇消毒种子10 min。然后将种子铺于灭菌的滤纸上，等乙醇挥发后，均匀撒在1/2 ms培养基上。然后在4℃放置48小时春化，最后放置于光照培养箱中培养。
25.2. dna提取：取一片生长4周的拟南芥莲座叶至 1.5 ml 离心管中，用研磨棒将材料磨碎；加 300 μl dna 抽提 buffer，再次研磨至没有大的组织碎片；加 300 μl 异丙醇，颠倒混匀；13000 rpm 离心 8 min，弃上清；加入 800 μl 75%乙醇，悬浮沉淀；13000 rpm 离心 4 min，弃上清；倒置于吸水纸上晾干；加入 100 μl ddh 2
o，溶解后于-20℃保存。
26.注：dna提取缓冲液：0.25 m edta（ph 8.0），0.5% sds，0.25 m nacl ，0.2 m tris-hcl（ph 7.5）。
27.3. pcr鉴定，引物序列如下：esd4_f：gcaaaatacatgggtgatgaag，esd4_r：atcagctcgtagcctcagaatc；pcr体系：5 μl pcr mix，0.2 μl引物1，0.2 μl引物2，2 μl dna模板，2.6 μl ddh2o。
28.pcr程序：退火温度58℃，延伸2min，35个循环。
29.4. 测序检测突变位点：如图1所示，esd4突变位点位于cds序列的第1369个碱基g突变为a，导致编码的蛋白质第457位氨基酸由天冬氨酸（d）突变为天冬酰胺（n）。
30.（三）western blot 检测esd4突变体中sumo化蛋白水平esd4编码sumo蛋白酶，为验证esd4点突变体是否为功能缺失突变体，需检测esd4突变体中sumo化修饰蛋白的水平，具体步骤如下：1. 取生长14天的拟南芥col-0野生型和esd4突变体幼苗，约0.2 g，液氮研磨；2. 加入300 μl蛋白提取缓冲液 [20 mm tris-hcl (ph 7.4)，300 mm nacl， 5 mm mgcl
2 (ph 8.0)，5 mm dtt，0.5% (v/v) nonidet p-40，50 μm mg132，0.05% [w/v] sds，1
ꢀ×
蛋白酶抑制剂]，冰上放置30 min；3. 离心20min（4 ℃，13000 rpm），取上清；4. 蛋白定量（bio-rad protein assay reagent, usa），然后各取20 μg总蛋白加适量蛋白上样缓冲液，100℃水浴5min；5. sds-page电泳分离蛋白（从上到下依次为浓缩胶、8%分离胶、15%分离胶）；
6. western blot：一抗为sumo1抗体（货号ab5316，abcam）。
[0031]
结果如图2所示，游离的sumo1蛋白约13 kd左右，括号中的蛋白为被sumo化修饰的蛋白。esd4突变体中sumo化修饰蛋白水平明显比野生型（wt）高，而游离sumo蛋白水平比野生型低，这表明esd4突变体为功能缺失突变体。
[0032]
（四）盐胁迫处理1. 含nacl的1/2 ms培养基的配置。在100 ml常规1/2 ms培养基中加入0.8766 g nacl（150 mm）或1.1688 g nacl（200 mm），灭菌后倒入培养皿中。
[0033]
2. 将拟南芥esd4和col-0野生型拟南芥种子播种到1/2 ms培养基上，垂直生长4天后，转移到含有150 mm或200 mm nacl的1/2 ms培养基上，继续垂直生长5天（见图3）。如图中箭头所示，盐胁迫处理的拟南芥幼苗子叶发生白化现象，突变体与野生型相比更抗盐胁迫。接下来通过存活率和地上部分的叶绿素含量两个指标对植株耐盐胁迫的程度进行量化统计。
[0034]
3. 存活率统计盐胁迫处理的拟南芥幼苗子叶发生白化现象，子叶仍为绿色的幼苗视为存活的幼苗，据此统计存活率，如图4所示，在盐胁迫下esd4突变体的存活率明显高于野生型，差异极显著，这表明esd4突变体比野生型更耐盐胁迫。
[0035]
4. 叶绿素含量测定
①
将上述各处理所得的幼苗，取其地上部分，称重，放置于10 ml离心管中，加入95%乙醇，避光，摇床上放置过夜。
[0036]
②
取200 μl用酶标仪测定波长在663 nm和645 nm处的吸光值。
[0037]
③
计算叶绿素的含量，公式如下：ca=(12.7
×
od
663-2.69
×
od
645
)
×
稀释倍数/重量；cb=(22.9
×
od
645-4.68
×
od
663
)
×
稀释倍数/重量；ca代表叶绿素a的含量mg/g；cb代表叶绿素b的含量mg/g。
[0038]
④
统计叶绿素含量的差异，都以各自在1/2 ms培养基上生长的幼苗的叶绿素含量视为100%，统计百分比。如图5所示，与1/2ms培养基上相比，在盐胁迫处理后，esd4突变体的地上部分叶绿素含量降低程度明显低于野生型，表明esd4突变体更耐盐胁迫。
[0039]
尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0040]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本技术权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。