黑蒜提取物在制备预防或治疗肺癌药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及黑蒜提取物的制药用途，具体涉及黑蒜提取物在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。


背景技术：

2.肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率高，对人群健康和生命产生了严重威胁。近50年来许多国家的报道中肺癌的发病率和死亡率均明显增高。肺癌临床上以咳嗽、胸闷、胸痛、气急、咳痰、咳血、发热等为主要症状。根据肺癌的分化程度、形态特征和生物学特点，目前将肺癌分为两大类，即小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。
3.大蒜(allium sativum l.)为百合科葱属，多年生草本植物，栽培范围遍布全世界。明代《本草纲目》记载，大蒜可以治疗的疾病多达数十种，传统医学认为大蒜能起到开胃健脾、去除湿寒气和消肿散毒等作用。大蒜所含化学成分复杂，包括挥发油、多种氨基酸、维生素、糖和丰富的蛋白质，并且含有多种矿物质和微量元素。研究证明大蒜具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、降“三高”、提高机体免疫力、解毒等功效。
4.大蒜经过处理得到的黑蒜，处理的过程是一个美拉德反应过程，它不仅保留了大蒜原有的成分和功能，而且制得的黑蒜柔软无大蒜的辛辣味和刺激性的臭味，更易被人们所接受。黑蒜中含有的化合物高达三十余种，与普通大蒜相比，黑蒜中水分、脂肪含量下降，单糖和低聚果糖、微量元素含量升高，具有更多的药理作用。
5.研究显示，大蒜中的果聚糖在炮制过程中会发生降解形成果糖及小分子的低聚果糖，黑蒜中单糖和低聚果糖含量从1.6％升到70.6％。低聚果糖不能够被唾液淀粉酶分解，直接经过胃和小肠，被大肠内的双歧杆菌利用，产生乙酸、丙酸、乳酸等短链脂肪酸，降低肠道ph值，改变肠道渗透压，促进肠道蠕动，提高粪便含水量，可以防治便秘。黑蒜含有的脂溶性挥发油对巨噬细胞吞噬机能的提高十分显著，能够起到增强免疫系统的作用，可见，黑蒜能够显著提高机体细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异免疫功能，从而提高机体免疫力。黑蒜能阻断亚硝胺的合成，由于亚硝胺是一种致癌物质，因此黑蒜具有杀伤癌细胞的作用。与黑蒜相比，富硒黑蒜中的硒元素含量又显著升高，经检测富硒黑蒜的硒元素平均含量为34.81μg/kg，硒元素可提高脱磺酸酶和谷胱甘肽过氧化物酶的生物学活性，从而提高动物的消化酶活力，具有增强和改善消化吸收功能，促使胃肠道蠕动正常，防止便秘的作用。硒元素还具有较强的抗氧化能力，可以防止细胞过度氧化起到保护细胞膜、增加免疫力、抑制癌变的作用。因此富硒黑蒜的各种药理作用可能比黑蒜更强，但是目前关于富硒黑蒜药用价值的研究较少。
6.cn102652792a公开了一种大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷为原料组成的组合物，该组合物集大蒜水溶性、脂溶性有效成分于一体，使大蒜防癌抗癌的活性得到充分的发挥，该组合物具有良好的抗肿瘤活性(小鼠肉瘤s180)，具有扶正祛邪、减毒的作用，应用前景广阔，可制成疗效显著且毒副作用小的肿瘤防治药物或保健品。该发明还提供了制备所述组
合物的方法，将大蒜经双提，得大蒜油；药渣经水提醇沉，得大蒜总多糖；药渣经醇提，过大孔树脂纯化，得大蒜总皂苷。该制备方法操作简单，充分利用大蒜原料的每一部分，成本低廉，质量可控，能够产业化。
7.cn101731605a公开了一种黑蒜的生产加工方法，是精选优质大蒜清洗后摆放在发酵盒中放入发酵车间，加温50～80℃、加湿50～80％，对大蒜发酵一个月成为黑蒜。该发明方法生产的产品由于大蒜中的碳水化合物转化成了果糖，蛋白质转化成了氨基酸，发酵后的大蒜由原来的乳白色变成了黑褐色，其口味酸甜，食用不会产生难闻的口气，更不会对胃壁造成伤害，多酚与游离氨基酸的含量大大超过生蒜，同时产生了艾乔恩及s-稀丙基半胱氨酸，水溶性抗氧化物质是普通大蒜的8.7倍，脂溶性抗氧化物质是生蒜的79倍。有增强人体免疫力、抗过敏、抗衰老、抗癌、抑制动脉硬化、平稳血压、降血脂、降血糖、降低胆固醇、治疗便秘、美容等功效。
8.目前，相关研究主要集中在富硒黑蒜各种化学成分的提取、分离和鉴定、药物的临床应用与开发，然而黑蒜及其提取物是否具有抑制肺癌疾病作用的研究未见相关报道，因此研究黑蒜对肺癌的治疗作用，对进一步地开拓肺癌的治疗药物具有重要意义。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黑蒜提取物的制药用途，具体涉及黑蒜提取物在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。
10.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
11.第一方面，本发明提供黑蒜提取物在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用。
12.本发明创造性地发现黑蒜提取物作为活性成分的药物可以用于预防和/或治疗肺癌，具体表现在降低肺癌细胞增殖率，促进肿瘤细胞坏死，胞核固缩、碎裂或消失，且黑蒜提取物使用后生化指标正常，脏器无损伤，应用安全性高。黑蒜提取物用于制备预防和/或治疗肺癌的药物具有应用潜力，本发明对预防和/或治疗肺癌提供了新的策略。
13.优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。
14.本发明所述肺癌为非小细胞肺癌时，黑蒜提取物作为活性成分制得的预防和/或治疗肺癌的药物具有更强的抑制肺癌细胞增殖、加速肺癌细胞坏死的作用。
15.第二方面，本发明提供黑蒜提取物在制备抑制肺癌细胞增殖药物中的应用。
16.本发明由于发现黑蒜提取物具有降低肺癌细胞增殖率，促进肺癌细胞坏死的作用，所以可以用于制备抑制肺癌细胞增殖的药物。
17.第三方面，本发明提供一种预防和/或治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括黑蒜提取物。
18.本发明创造性地发现活性成分包括黑蒜提取物的药物组合物具有预防和/或治疗肺癌的作用，此外，肺癌药物常具有较大的副作用，黑蒜提取物搭配其他肺癌药物用于肺癌的治疗，一方面可以降低其他肺癌药物的使用量，另一方面可以直接降低毒副作用，最终达到降低肺癌治疗副作用的效果。
19.优选地，所述药物组合物的活性成分还包括化疗药物。
20.本发明中所述药物组合物的活性成分还包括化疗药物，化疗药物可以搭配黑蒜提取物联合使用，在预防和/或治疗肺癌、降低化疗药物副作用等方面相辅相成，为肺癌药物
的联合用药提供了策略。
21.优选地，所述化疗药物包括蒽环类药物。
22.优选地，所述蒽环类药物包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素或脂质体阿霉素中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括阿霉素和表阿霉素的组合、表阿霉素和吡喃阿霉素的组合或阿霉素和吡喃阿霉素的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
23.蒽环类药物广泛地用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，如急性白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、软组织肉瘤和卵巢癌等。蒽环类药物的作用机理包括：通过嵌入dna双链的碱基之间，形成稳定复合物，抑制dna复制与rna合成，从而阻碍快速生长的癌细胞的分裂；抑制拓扑异构酶ii，影响dna超螺旋转化成为松弛状态，阻碍dna复制与转录；螯合铁离子后产生自由基从而破坏dna、蛋白质及细胞膜结构。但是蒽环类药物具有心脏毒性，常会造成心肌细胞受损。
24.本发明中所述化疗药物包括蒽环类药物，尤其是包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素或脂质体阿霉素中的任意一种或至少两种的组合时，黑蒜提取物和上述化疗药物组合而得的药物组合物具有更强的预防和/或治疗肺癌、降低化疗药物副作用的功效。
25.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
26.优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括ph调节剂和抗氧剂的组合、填充剂和粘合剂的组合、表面活性剂和包衣材料的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
27.优选地，所述黑蒜包括富硒黑蒜。
28.第四方面，本发明提供一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向肿瘤细胞提供黑蒜提取物。
29.本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向肿瘤细胞提供黑蒜提取物，该方法可进一步应用于肿瘤药物的制备中，以进行肿瘤疾病发病机制的研究和相关病症的治疗。
30.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
31.1.本发明创造性地发现黑蒜提取物作为活性成分的药物可以用于预防和/或治疗肺癌，具体表现在降低肺癌细胞增殖率，促进肿瘤细胞坏死，胞核固缩、碎裂或消失，且黑蒜提取物使用后小鼠生化指标正常，脏器无损伤，应用安全性高。黑蒜提取物用于制备预防和/或治疗肺癌的药物具有应用潜力，本发明对预防和/或治疗肺癌提供了新的策略。
32.2.本发明由于发现黑蒜提取物具有降低肺癌细胞增殖率，促进肺癌细胞坏死的作用，所以可以用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物。
33.3.本发明创造性地发现活性成分包括黑蒜提取物的药物组合物具有预防和/或治疗肺癌的作用，此外，肺癌药物常具有较大的副作用，黑蒜提取物搭配其他肺癌药物用于肺癌的治疗，一方面可以降低其他肺癌药物的使用量，另一方面可以直接降低毒副作用，最终达到降低肺癌治疗副作用的效果。
34.4.本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述方法包括向肿瘤细胞提供黑蒜提
取物，该方法可进一步应用于肿瘤药物的制备中，以进行肿瘤疾病发病机制的研究和相关病症的治疗。
附图说明
35.图1为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组肿瘤组织he染色病理结果图。
36.图2为实施例3中黑蒜提取物组肿瘤组织he染色病理结果图。
37.图3为实施例3中黑蒜提取物 阿霉素组肿瘤组织he染色病理结果图。
38.图4为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组(a)、黑蒜提取物组(b)、阿霉素组(c)和黑蒜提取物 阿霉素组(d)小鼠心脏组织切片he染色图。
39.图5为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组(a)、黑蒜提取物组(b)、阿霉素组(c)和黑蒜提取物 阿霉素组(d)小鼠肝脏组织切片he染色图。
40.图6为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组(a)、黑蒜提取物组(b)、阿霉素组(c)和黑蒜提取物 阿霉素组(d)小鼠脾脏组织切片he染色图。
41.图7为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组(a)、黑蒜提取物组(b)、阿霉素组(c)和黑蒜提取物 阿霉素组(d)小鼠肺脏组织切片he染色图。
42.图8为实施例3中肺癌a549裸鼠模型组(a)、黑蒜提取物组(b)、阿霉素组(c)和黑蒜提取物 阿霉素组(d)小鼠肾脏组织切片he染色图。
具体实施方式
43.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
44.实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
45.除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。
46.下述实施例所涉及的黑蒜由青海恩露生物科技有限公司提供；盐酸阿霉素购自武汉大华伟业医药化工有限公司；balb/c-nu裸鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司。
47.实施例1
48.黑蒜提取物的制备
49.(1)选择无病虫害、无严重损、饱满的黑蒜，去除蒜衣膜，洗净，晾干水分，切碎后捣成泥状，平铺于培养皿底部。
50.(2)随后将培养皿置于超低温冰箱(ults1368，赛默飞世尔科技有限公司，美国)，设置温度-80℃，放置12h。
51.(3)立式真空冷冻干燥机(北京博劢行仪器有限公司，中国北京)提前预热20min后，随后将步骤(2)中冷冻后的黑蒜置于真空冷冻干燥机中，设置参数温度-2℃，时间24h，后更换终末程序。
52.(4)终末干燥的温度为28℃，时间为48h，至黑蒜含水量低于10％时停止干燥，取出冷冻干燥后的黑蒜，使用中药粉碎机粉碎，使用200目的筛网过筛，制得黑蒜提取物。
53.实施例2
54.肺癌a549裸鼠模型的建立
55.动物分组：取年龄4-6周balb/c-nu裸鼠40只，随机分为4组，每组10只，包括肺癌a549裸鼠模型组、黑蒜提取物组、阿霉素组和黑蒜提取物 阿霉素组。随后将各组的balb/c-nu裸鼠进行动物造模处理。
56.动物造模：使用碘酒对balb/c-nu裸鼠左下肢皮肤消毒，并用无菌棉签将碘酒擦拭干净后，将100μl密度为1
×
107个/ml的a549细胞通过皮下注射到裸鼠腋窝。24h后观察裸鼠的生存状态并注意观察接种部位肿瘤大小的变化程度。待肿瘤大小达到100mm3(肿瘤体积＝a
×
b2/2，a为肿瘤的最大长径，b为肿瘤的最大纵径)，即为造模成功。
57.实施例3
58.体内抑瘤效果评价
59.1、实验方案：
60.给药方案：通过灌胃或静脉注射给药，造模成功后开始给药，给药情况如表1所示，给药两周，灌胃共14次，每天1次，静脉注射共2次，分别于第1天和第8天静脉注射，并于给药开始后的第1、3、5、7、9、11、13、14天称体重、测量瘤体体积。
61.表1
[0062][0063]
检测指标及检测方法：
[0064]
(1)小鼠体重，给药开始后的第1、3、5、7、9、11、13、14天称量小鼠体重，并比较第14天时小鼠的体重差异。
[0065]
(2)相对肿瘤增殖率，相对肿瘤增殖率＝各组小鼠相对肿瘤体积/肺癌a549裸鼠模型组小鼠相对肿瘤体积，其中相对肿瘤体积＝肿瘤终体积/肿瘤初始体积。
[0066]
(3)小鼠肿瘤组织he染色，给药14天后，分离各组小鼠的肿瘤，脱水包埋后使用he染色，进行病理分析。
[0067]
(4)安全性评价指标，给药14天后，首先进行小鼠眼眶取血，使用全自动生化分析仪严格按照试剂说明测定血清中谷丙转氨酶(alt)和血清肌酐(cr)，随后解剖小鼠取出小
鼠的心、肝、脾、肺和肾脏，切片，使用he染色后进行病理分析。
[0068]
2、实验结果
[0069]
(1)小鼠给药2两周后，最终体重如表2所示。
[0070]
表2
[0071]
组别体重(g)肺癌a549裸鼠模型组24.29
±
3.1黑蒜提取物组30.13
±
2.7阿霉素组25.27
±
4.1黑蒜提取物 阿霉素组29.33
±
3.0
[0072]
根据表2数据可知，肺癌a549裸鼠模型组未进行治疗，终体重最低；阿霉素组小鼠体重与肺癌a549裸鼠模型组体重相近，说明化疗药物有一定的毒副作用，会造成体重消瘦；黑蒜提取物组的小鼠体重较肺癌a549裸鼠模型组高，黑蒜提取物 阿霉素组的小鼠体重较肺癌a549裸鼠模型组高，且这两组小鼠体重均高于阿霉素组，说明黑蒜提取物比化疗药物毒副作用小；黑蒜提取物 阿霉素组与阿霉素组相比，小鼠体重高，表明两种药物联用可以降低化疗药物的毒副作用，有效改善肺癌造成的体重消瘦的症状。
[0073]
(2)小鼠相对肿瘤增殖率变化如表3所示。
[0074]
表3
[0075][0076][0077]
由表3的数据可知，与肺癌a549裸鼠模型组相比，黑蒜提取物组小鼠相对肿瘤增殖率显著下降，表明黑蒜提取物可以抑制肺癌细胞增殖，具有预防和/或治疗肺癌的作用；黑蒜提取物 阿霉素组的相对肿瘤增殖率低于黑蒜提取物组和阿霉素组，表明黑蒜提取物和化疗药物阿霉素两种药物相互搭配，形成的联合用药物组合物在抑制肺癌细胞增殖方面可以发挥更强的作用。
[0078]
(3)小鼠肿瘤组织病理分析。
[0079]
肺癌a549裸鼠模型组(图1)：肿瘤组织呈结节状，肿瘤细胞呈实性生长，核质比高，核型多样，核仁明显，偶见核分裂相。肿瘤间质可见粘液，肿瘤细胞游离，未见明显的肿瘤细胞坏死，边缘可见少量的炎性细胞浸润。
[0080]
黑蒜提取物组(图2)：有少量肿瘤细胞坏死，少数肿瘤细胞核出现固缩、碎裂、消失，局部边缘可见少量出血，未见明显的炎性细胞浸润。
[0081]
黑蒜提取物 阿霉素组(图3)：较黑蒜提取物组坏死更为严重，肿瘤细胞减少约占
50％的面积，大量肿瘤胞核固缩坏死、碎裂、消失，未见明显的炎性细胞浸润。
[0082]
由此可知，黑蒜提取物可以造成肺癌肿瘤细胞的死亡，且黑蒜提取物与化疗药物阿霉素联合应用对肿瘤细胞的杀伤作用更强。
[0083]
(4)小鼠谷丙转氨酶和血清肌酐变化情况如表4所示。
[0084]
表4
[0085][0086][0087]
与肺癌a549裸鼠模型组比较，
*
代表p《0.05
[0088]
由表4数据可知，黑蒜提取物组和黑蒜提取物 阿霉素组的谷丙转氨酶和血清肌酐与肺癌a549裸鼠模型组相比无显著差异(p》0.05)，表明黑蒜提取物不会造成小鼠的肝脏、肾脏损伤；与肺癌a549裸鼠模型组相比，阿霉素组的谷丙转氨酶显著升高(p《0.05)，表明化疗药物的使用会造成一定程度的肝脏损伤，但是黑蒜提取物 阿霉素组谷丙转氨酶指标无显著变化，表明阿霉素和黑蒜提取物搭配应用，可以降低阿霉素对肝脏的损伤作用，因此黑蒜提取物用于治疗肺癌，不仅具有良好的安全性，而且还能减轻其他肺癌治疗化疗药物的副作用。
[0089]
(5)小鼠心、肝、脾、肺和肾脏组织病理分析。
[0090]
小鼠心脏组织he染色病理结果(图4)：阿霉素组小鼠心脏出现心肌纤维轻度浊肿，局部心肌间隙增大。其余各组小鼠心脏组织心内膜、心肌膜及心外膜结构清晰，心腔未见明显异常；心肌细胞分界清楚，走形一致；间质未见异常；未见明显的炎性改变。
[0091]
小鼠肝脏组织he染色病理分析(图5)：阿霉素组小鼠局部肝小叶结构完整，细胞排列整齐，局部肝细胞水肿，未见淤血或坏死灶。其余各组肝小叶结构清晰，中央为中央静脉，周围呈放射状排列的肝细胞索和肝血窦，肝细胞圆润、饱满，肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压；相邻肝小叶之间的门管区无明显异常；未见明显的炎性改变。
[0092]
小鼠脾脏组织he染色病理分析(图6)：各组小鼠脾脏组织被膜由厚薄均匀的富含弹性纤维及平滑肌的致密结缔组织构成，被膜结缔组织伸入脾内形成小梁，无明显异常；脾脏实质为红髓以及白髓，白髓由中央动脉周围淋巴鞘、脾小结构成，各层结构清晰，数量以及大小无明显变化；红髓分布于被膜下、小梁周围及白髓边缘区外侧的广大区域，由脾索和脾血窦组成，分布均匀与白髓分界清楚，可见较多的髓外造血灶和少量的局核细胞。
[0093]
小鼠肺脏组织he染色病理分析(图7)：各组小鼠肺部气管上皮细胞排列紧密，未见明显坏死和脱落，但均有肺泡壁不同程度的增厚，局部肺泡轻度扩张及轻度出血，有的肺泡腔狭窄，伴少量的中性粒细胞浸润，可能原因是所接种的肿瘤细胞是非小细胞肺癌，具有部
位趋向性，因此肺部组织出现病理性变化，但黑蒜提取物组和黑蒜提取物 阿霉素组的肺部的病理改变较阿霉素组和肺癌a549裸鼠模型组更轻微。
[0094]
小鼠肾脏组织he染色病理分析(图8)：各组小鼠肾脏组织表面被膜由厚薄均匀的致密结缔组织构成；肾实质为浅层皮质和深层髓质，皮质、髓质分界明显；皮质中肾小球分布均匀，肾小球中细胞数量以及基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则，髓质未见明显异常；泌尿小管之间结缔组织为肾间质，间质无明显结缔组织增生；未见明显的炎性改变。
[0095]
以上结果说明黑蒜提取物用于肺癌小鼠的治疗中，不会造成小鼠脏器损伤，使用安全性高，并且黑蒜提取物的使用还可以降低化疗药物阿霉素对小鼠心脏，肝脏的损伤。
[0096]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的黑蒜提取物在制备预防和/或治疗肺癌药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0097]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0098]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。