一种高效液相色谱串联质谱检测血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于生物化学分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.在癫痫发作的治疗中，抗癫痫药物有特殊重要的意义。抗癫痫药物可通过两种方式来消除或减轻癫痫发作，一是影响中枢神经元，以防止或减少他们的病理性过度放电；其二是提高正常脑组织的兴奋阈，减弱病灶兴奋的扩散，防止癫痫复发。抗癫痫药物对人的记忆、运动速度等均有影响，血药浓度越高，影响越明显。因此抗癫痫药物血药浓度监测意义重大。
3.抗癫痫药物可以单独使用，也可联合使用以增强药物疗效或减轻药物毒副作用。卡马西平是一种亚氨基1,2-二苯乙烯的衍生物，通常单独或与其它抗癫痫药物联合运用于精神运动性发作(癫痫大发作)、局限性、局限性-混合型大发作的治疗。其同时可用于治疗三叉神经痛。卡马西平有时也用于治疗锂治疗无效的躁狂抑郁症患者。由于吸收和新陈代谢之间的不同，个体对卡马西平的反应存在着巨大的差异。
4.丙戊酸(vpa:2-丙基戊酸；丙基戊酸钠)是种相对较新的抗惊厥类药物，主要用于原发和继发全身性癫痫发作，对不发作癫痫治疗也有效，尤其对肌阵挛治疗效果明显，是慢性光敏性癫痫的治疗药物。vpa常与其他抗癫痫药物联合使用，但最近有研究表明vpa单独使用也有良好疗效。另有研究提示vpa对情感失常治疗有用，尤其在对锂治疗不敏感的双相失常患者。通过β、ω氧化和结合作用，vpa转变为代谢复合物，一些代谢物具有明显的抗惊厥活性，而其他一些复合物可能与药物毒性副作用的产生有关。此外，同时使用的其他抗癫痫药物会对vpa代谢造成明显影响。
5.苯妥英通常被选择用于全身大运动性癫痫发作(癫痫大发作)和病灶性癫痫发作的治疗。其同样也能用于基本性治疗局部癫痫发作(病灶性)或复杂性局部癫痫发作(精神运动性，颞叶)。苯妥英与血浆蛋白的结合力高，未结合的苯妥英即处于游离形式的具有较高的药理学活性。在白蛋白水平正常和肾功能正常的个体中，未结合的苯妥英约占10％。苯妥英与众不同的代谢消除特性使得剂量/浓度关系的评价变得相对困难。据报道，不同个体之间对苯妥英的吸收、新陈代谢和消除有显著差异。药物给药剂量与药理学活性之间的关系会受到疾病状态、药物处理和患者并发症的影响而变得更为复杂。
6.可见丙戊酸、卡马西平和苯妥英都是非常常用，且可联用的抗癫痫药物，需要实现同时对丙戊酸、卡马西平和苯妥英的血药浓度进行监测，才能帮助医师根据患者对药物反应的个体差异来确定治疗剂量，调整药物剂量以减少毒副作用，从而控制癫痫发作，确保患者能达到较好的依从性。
7.目前国内外有关血清中抗癫痫药物的测定方法报道很多，常见的方法有：化学发光法和色谱法，在众多的方法中，液相串联质谱法为测定抗癫痫药物的首选方法。但是以往
方法普遍存在操作过程复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、检测通量低的问题，这主要都是因为样品前处理过程繁琐、稳定性差所造成的。
8.现有的抗癫痫药物样品前处理方法主要有蛋白沉淀、液液萃取等，如cn111812216a，采用甲醇和乙腈混合溶液作为蛋白沉淀剂对血清样本进行前处理，从而进行样本抗癫痫药物的检测，但由于其样本前处理过程存在稳定性差的问题，导致检测结果容易受干扰，误差大，检测灵敏度不高。
9.因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、检测通量高、检测准确度和灵敏度高、成本低、人工工作量小等优点的抗癫痫药物样品前处理方法，使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷。


技术实现要素：

10.为解决上述问题，本发明提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其检测方法，采用猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白或马血清白蛋白作为校准品和质控品的基质，避免了牛血清或牛血清白蛋白对丙戊酸检测的干扰；在基质中添加乙二胺二邻苯基乙酸钠等作为抗氧化剂，并优选采用兔血清作为基质，显著提高校准品及质控品的稳定性；同时通过将内标储存在含乙二胺二邻苯基乙酸钠的沉淀剂中，用于样本前处理可一步操作实现内标校正、蛋白沉淀和目标物质提取，并且使内标液可长期储存，随取随用，达到延长试剂盒产品有效期的效果。
11.一方面，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中抗癫痫药物的检测试剂盒，所述试剂盒含有标准品和/或质控品，所述标准品和/或质控品中含有添加剂，所述添加剂为乙二胺二邻苯基乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠中的任意一种或多种。
12.本发明所述的抗癫痫药物包括丙戊酸、卡马西平和苯妥英。
13.发明人经过大量实验证明，溶液基质中的抗癫痫药物，尤其是其中的丙戊酸，在氧化、碱性环境下稳定性较差，比如检测试剂盒中的标准品、质控品和内标，其中含有的丙戊酸含量非常不稳定，常温下放置几天就会出现含量严重下降的问题，从而会显著影响检测的准确性和灵敏度，导致用于检测抗癫痫药物的所有样品、标准品、内标、质控品等全都需要现用现配，给实际操作带来非常大的麻烦，检测成本高。因此，为了更加精准地检测血清中丙戊酸、卡马西平和苯妥英3种抗癫痫药物的含量，首先必须克服溶液基质中丙戊酸的稳定性问题。
14.丙戊酸稳定剂的筛选需综合考虑其抗氧化能力、酸碱性，选择合适的浓度，才能达到较好的稳定效果。也就是说，在同时含有丙戊酸、卡马西平和苯妥英的标准品或质控品中，必须添加一种添加剂，能使丙戊酸不被氧化，同时保持最合适的酸碱性和浓度，才能尽最大可能使丙戊酸的含量保持稳定。
15.发明人令人惊喜地发现，在标准品或质控品中添加乙二胺二邻苯基乙酸钠(eddha)、乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖酸钠或柠檬酸钠可显著提高抗癫痫药物的稳定性，尤其是丙戊酸的稳定性。
16.进一步地，所述添加剂为乙二胺二邻苯基乙酸钠。
17.研究证明，当添加剂为乙二胺二邻苯基乙酸钠(eddha)时，提高稳定性的效果最
好。
18.进一步地，所述标准品和/或质控品采用基质配制，所述基质为动物血清或动物血清白蛋白，所述动物血清不是牛血清，所述动物血清白蛋白不是牛血清白蛋白。
19.由于人血清不易获得，不能作为基质用于制备批量生产的试剂盒产品，因此需要找到合适的动物血清作为基质。
20.发明人发现，牛血清或牛血清白蛋白对丙戊酸的检测存在明显干扰，会导致丙戊酸的检测结果非常不稳定；因此标准品和质控品的基质都不能采用牛血清或牛血清白蛋白来配制。
21.进一步地，所述基质为猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白或马血清白蛋白中的任意一种或多种，所述乙二胺二邻苯基乙酸钠的浓度为0.02-0.1mg/ml。
22.采用猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白或马血清白蛋白作为基质，基质中添加剂包括乙二胺二邻苯基乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠的一种或多种，最优选为0.02-0.1mg/ml的乙二胺二邻苯基乙酸钠，以获得提高校准品及质控品稳定性、延长产品有效期的效果。用合适的、易获得的动物血清模拟人体样本，可降低基质效应，使得检测结果更加准确和稳定。
23.进一步地，所述基质为兔血清。
24.研究证明，采用兔血清作为基质，有助于进一步提高标准品或质控品中的丙戊酸的稳定性，同时基质效应低，背景噪声低，能够保证丙戊酸的准确检测。
25.进一步地，所述检测试剂盒还包括内标液，所述内标液中含有沉淀剂和稳定剂，所述稳定剂为乙二胺二邻苯基乙酸钠。
26.进一步地，所述沉淀剂为甲醇。
27.现有的抗癫痫药物的内标液，由于其中的丙戊酸不稳定，每次都必须现配现用，为了降低工作量，减少浪费，本发明通过在内标液中添加稳定剂来保持丙戊酸含量的稳定，从而延长内标液的保存期限。
28.本发明配制的含有乙二胺二邻苯基乙酸钠的内标液非常稳定，可长期保存，随用随取，保质期达三年以上，三年后，其中的丙戊酸内标的含量变化仍保持在3％以内，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
29.本发明将甲醇、乙二胺二邻苯基乙酸钠、同位素标记的抗癫痫药物混合，得到内标液，加入样品中混匀，既可发挥内标的作用，还可同步实现样品中内标校正、蛋白质的沉淀分离和目标物质的提取，而且该溶液体系对样品中的抗癫痫药物的溶解性较好，不需要加以冷冻干燥或液液萃取后氮吹等富集过程，分离沉淀物杂质后可直接进样检测，简化了操作过程，而且所用试剂为成本较低的常规化学试剂，降低了检测成本。
30.进一步地，所述内标中含有同位素标记的抗癫痫药物；所述标准品为含有标准浓度的抗癫痫药物；所述质控品为含有高低两个不同水平浓度的抗癫痫药物。
31.进一步地，所述抗癫痫药物为丙戊酸、卡马西平或苯妥英中的任意一种或多种。
32.另一方面，本发明提供了一种检测血清中的抗癫痫药物的方法，所述方法采用如上所述的检测试剂盒进行检测；包括系统适用性测试、样品制备、样品前处理和样品检测；其中，所述样品前处理包括以下步骤：取样品与内标液按照1∶7～1∶11混匀，离心，取上清进行高效液相色谱串联质谱检测。
33.再一方面，本发明提供了乙二胺二邻苯基乙酸钠用于制备丙戊酸溶液的稳定剂的用途。
34.再一方面，本发明提供了乙二胺二邻苯基乙酸钠用于制备抗癫痫药物溶液的稳定剂的用途，所述抗癫痫药物为丙戊酸、卡马西平或苯妥英中的任意一种或多种。
35.再一方面，本发明提供了兔血清用于制备提高丙戊酸稳定性的标准品和/或质控品的用途。
36.进一步地，所述标准品和/或质控品中含有乙二胺二邻苯基乙酸钠。
37.本发明具有以下有益效果：
38.(1)在标准品和/或质控品的基质中添加乙二胺二邻苯基乙酸钠，可有效解决抗癫痫药物中的丙戊酸含量不稳定，常温下放置几天就会出现含量严重下降的问题；使标准品和/或质控品可长期保存，其中的抗癫痫药物含量稳定，不用现用现配，起到提高校准品及质控品稳定性、延长产品有效期的效果，且能显著提升检测的准确性和灵敏度；
39.(2)发现牛血清或牛血清白蛋白对丙戊酸的检测存在明显干扰，不能采用牛血清或牛血清白蛋白配制基质；可选用猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白或马血清白蛋白作为校准品和质控品的基质，降低基质效应，使得检测结果更加准确和稳定；
40.(3)发现选用兔血清作为标准品和/或质控品的基质，在添加乙二胺二邻苯基乙酸钠的情况下，可进一步提高基质中丙戊酸的稳定性，并能更好地保证丙戊酸检测的准确性；
41.(4)在内标液中添加乙二胺二邻苯基乙酸钠，通过一步操作同时实现内标校正、蛋白沉淀和目标物质提取，从而提升检测的准确性、灵敏度和操作简便性，并使内标中的抗癫痫药物含量稳定，可长期保存，保质期三年以上，随用随取；
42.(5)当患者服用一种或一种以上药物时，采用一步样本前处理方法，即可检测不同的血药浓度，减少重复采样次数，减小患者痛苦，有效降低分析成本，而且可报告范围广，可准确分析不同血药浓度水平的血清样品。
附图说明
43.图1为实施例1中标样10的丙戊酸检测质谱图；
44.图2为实施例1中标样10的苯妥英检测质谱图；
45.图3为实施例1中标样10的卡马西平检测质谱图；
46.图4为实施例3中牛血清蛋白作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
47.图5为实施例3中牛血清作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
48.图6为实施例3中猪血清白蛋白作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
49.图7为实施例3中猪血清作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
50.图8为实施例3中马血清白蛋白作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
51.图9为实施例3中马血清作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图；
52.图10为实施例3中为兔血清作为基质在丙戊酸离子通道的检测质谱图。
具体实施方式
53.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
54.实施例1样本制备、前处理和检测
55.一、样本制备
56.1、校准品和质控品的配制
57.将抗癫痫药物丙戊酸、卡马西平和苯妥英标准品配制成混合溶液，用于配制标准品工作液和质控品工作液。取上述工作液，添加到含有0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠的兔血清中，配制成10个系列浓度的校准品、2个系列浓度的质控品，其浓度如表1所示(单位：μg/ml)：
58.表1、3种抗癫痫药物的标准品和质控品浓度
59.样品丙戊酸卡马西平苯妥英校准品140.20.5校准品250.51.25校准品31012.5校准品41537.5校准品525512.5校准品645922.5校准品7751537.5校准品8901845校准品91202460校准品101503075质控品1202.44质控品21001220
60.2、内标液的配制
61.(1)内标储备液
62.配制混合内标储备液，丙戊酸-d6、卡马西平-d2,
15
n、苯妥英-d10的浓度分别为200μg/ml、20μg/ml和50μg/ml。
63.(2)沉淀剂
64.称取50mg乙二胺二邻苯基乙酸钠，用100ml纯化水溶解，再加入900ml甲醇，混匀得到沉淀剂。
65.(3)内标液
66.取内标储备液和沉淀剂以1:100的比例混匀，得到内标液。
67.3、系统适用性溶液的配制
68.取含4μg/ml丙戊酸、0.2μg/ml卡马西平和0.5μg/ml苯妥英的混合标准品溶液100μl，与49.9ml的50％甲醇水溶液混合，配制成系统适用性溶液。
69.系统适用性测试为在样本检测前，用高效液相色谱串联质谱检测直接进样3次系统适用性溶液，通过目标物质的保留时间、响应强度及其精密度判定高效液相色谱串联质谱系统是否正常。
70.二、样本前处理
71.(1)取20μl样品，加入到96孔板或离心管中；
72.(2)加入180μl内标液，涡旋5分钟，在4000rpm转速下离心10分钟，取上清待测。
73.三、样本检测
74.取上清用高效液相色谱串联质谱检测。具体分析条件如下：液相采用梯度洗脱，流动相a为0.1％甲酸-10％甲醇水，流动相b为0.1％甲酸甲醇；色谱柱为c18色谱柱，流动相流速为0.6ml/min，柱温在30℃，洗脱梯度如表2所示：
75.表2、洗脱梯度
76.时间(min)流动相a％流动相b％0.090100.490101.35951.490102.09010
77.质谱采用电喷雾离子源(esi)和多反应监测扫描模式(mrm)。用于检测的三种抗癫痫药物的母离子/子离子对质荷比(m/z)如表3所示：
78.表3、母离子/子离子对质荷比
79.分析物q1q3丙戊酸142.9142.9卡马西平237179苯妥英253104
80.可以通过选择反应监控检测到的离子对，以及对应的保留时间，来确定3种抗癫痫药物的检测，并通过各种抗癫痫药物的内标进行定量。
81.样品通过液相色谱分离后，不同的抗癫痫药物与基质组分在不同的时间被洗脱下来，并且被质谱多反应监测模式检测到，从而检测其含量。校准品10检测质谱图如图1～图3所示，其中图1为丙戊酸的质谱图，图2为苯妥英的质谱图，图3是卡马西平的质谱图。可见按照本实施例提供的方法，可以同时准确检测3种抗癫痫药物，3种抗癫痫药物都在1.04分钟左右的保留时间出峰，通过三个不同的离子通道实现互不干扰的特异性检测。
82.实施例2不同添加剂对校准品/质控品稳定性的影响
83.本实施例按照实施例1提供的方法，并分别使用不同种类、浓度的添加剂配制基质，在37℃条件下放置14天，考察不同添加剂对校准品/质控品稳定性的影响。各添加剂及其在基质中的浓度为：0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠、0.1mg/ml乙二胺四乙酸二钠、0.05mg/ml葡萄糖酸钠、0.01mg/ml氮川三乙酸钠、0.02mg/ml柠檬酸钠。考察校准品1中丙戊酸的含量变化如表4所示：
84.表4、不同添加剂对基质中丙戊酸稳定性的影响
85.添加剂及其浓度丙戊酸含量变化无添加剂-15.2％0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠0.5％0.1mg/ml乙二胺四乙酸二钠-3.2％0.05mg/ml葡萄糖酸钠-4.7％0.01mg/ml氮川三乙酸钠-11.3％
0.02mg/ml柠檬酸钠-7.9％
86.丙戊酸在氧化、碱性环境下稳定性较差，稳定剂的筛选需综合考虑其抗氧化能力、酸碱性，选择合适的浓度，以达到较好的稳定效果。
87.由表4可以看出，在无添加剂的情况下，校准品1在37℃下放置14天，丙戊酸的含量下降了15.2％；而添加一定量的添加剂后，能使丙戊酸的含量下降的比例显著减少，稳定性明显提高。
88.但是添加不同的添加剂，对提高校准品/质控品稳定性的效果明显不同，柠檬酸钠和氮川三乙酸钠虽然也具有一定的抗氧化能力，但其在溶液中的ph值均大于7，呈现碱性，其抗氧化作用也因此被削弱，因此对提高校准品/质控品中丙戊酸稳定性的效果也稍差。
89.添加0.1mg/ml乙二胺四乙酸二钠可使丙戊酸的含量的变化在
±
3％左右，稳定效果还不错；葡萄糖酸钠的酸碱性与乙二胺二邻苯基乙酸钠相近，但其抗氧化的能力也比后者要弱些，因此在0.05mg/ml葡萄糖酸钠的作用下，丙戊酸的含量出现了4.7％的小幅下降，降解率仍在10％的可接受范围内。
90.相比上述几种添加剂，添加0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠的效果格外突出，在37℃条件下放置14天后，丙戊酸仅下降了0.5％，稳定效果最佳。因此乙二胺二邻苯基乙酸钠是最优选的提高抗癫痫药物校准品/质控品稳定性的添加剂。
91.实施例3牛血清、牛血清白蛋白对丙戊酸检测的干扰
92.本实施例按照实施例1提供的方法，分别以牛血清、猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白、马血清白蛋白和牛血清白蛋白作为空白基质，空白基质中不添加抗癫痫药物，然后分别进行丙戊酸离子通道的质谱检测，检测图谱见图4～10，其中图4为牛血清蛋白作为基质的质谱图，图5为牛血清作为基质的质谱图，图6为猪血清白蛋白作为基质的质谱图，图7为猪血清作为基质的质谱图，图8为马血清白蛋白作为基质的质谱图，图9为马血清作为基质的质谱图，图10为兔血清作为基质的质谱图。
93.从不同基质下丙戊酸离子通道的图谱(图4～10)可以看出，在空白基质的情况下，牛血清、牛血清白蛋白中含有干扰丙戊酸检测的杂质，而猪血清、猪血清白蛋白、马血清、马血清白蛋白、兔血清均无该干扰物质，不会对标准品/质控品中的丙戊酸产生干扰，可作为试剂盒基质；而且其中兔血清对丙戊酸的背景噪声最低，干扰最少。
94.本实施例再分别采用牛血清、猪血清、马血清、兔血清、猪血清白蛋白、马血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清作为空白基质配制标准品1，采用实施例1提供的方法进行三种抗癫痫药物的检测，考察采用不同基质配制的标准品对三种抗癫痫药物的检测准确性的影响，结果如表5所示。
95.表5、不同基质配制的样品对三种抗癫痫药物的检测准确性的影响
96.基质丙戊酸含量(μg/ml)卡马西平含量(μg/ml)苯妥英含量(μg/ml)牛血清4.8520.2050.509猪血清3.8610.2020.499马血清4.2030.2030.503兔血清4.0020.2020.502猪血清白蛋白3.6720.2020.510马血清白蛋白3.8850.1980.504
牛血清白蛋白4.9630.2030.507人血清4.0010.2010.501
97.标准品1中丙戊酸含量为4μg/ml，卡马西平含量为0.2μg/ml，苯妥英含量为0.5μg/ml。
98.由表5可见，采用不同血清配制的标准品1进行三种抗癫痫药物检测时，卡马西平和苯妥英含量变化没有明显区别，而丙戊酸检测的结果却各有不同，可见采用不同血清作为基质配制样品，对样品中的丙戊酸检测的准确性会有较大影响。
99.当采用牛血清或牛血清蛋白作为基质时，丙戊酸的检测结果出现明显偏高，可见牛血清或牛血清蛋白基质对丙戊酸的检测存在比较严重的干扰。当采用马血清、马血清蛋白、猪血清、猪血清蛋白作为基质时，丙戊酸的检测结果也存在一定误差，其原因可能是这些血清也存在一定的基质效应，影响了丙戊酸的准确检测。而当采用兔血清作为基质配制标准品1时，其中的丙戊酸能够更加准确地被检测到，与人血清作为基质的检测结果最吻合，极大地保证了丙戊酸检测的精密度。
100.实施例4不同基质对丙戊酸稳定性的影响
101.本实施例按照实施例1提供的方法进行抗癫痫药物的检测试剂盒的配制和检测，其中的标准品/质控品分别采用除牛血清以外的其他动物血清或动物血清蛋白配制，并添加0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠，在37℃条件下放置14天，在含有添加剂0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠的情况下，采用不同基质配制标准品1时，不同基质中丙戊酸的稳定性情况如表6所示：
102.表6、不同基质对丙戊酸稳定性的影响
103.基质丙戊酸含量变化猪血清-1.0％马血清-1.2％兔血清-0.5％猪血清白蛋白-2.5％马血清白蛋白-2.6％
104.由表6可以看出，采用不同的动物血清或动物血清蛋白配制标准品1时，其中的丙戊酸稳定性也存在较大区别，采用兔血清作为基质时，有助于进一步提高丙戊酸的稳定性，在含有添加剂0.05mg/ml乙二胺二邻苯基乙酸钠的情况下，37℃条件下放置14天，丙戊酸含量几乎没有变化；而采用其他动物血清时，依然会出现或多或少的丙戊酸的损失。因此最优选采用兔血清来配制标准品或质控品，可显著提高丙戊酸的稳定性。
105.实施例5不同内标液对丙戊酸内标稳定性的影响
106.为了提高内标液的稳定性，延长内标液的保存期，不用每次都现配现用，本实施例按照实施例1提供的方法，分别使用1、添加0.05mg/ml的焦亚硫酸钠，2、添加0.05mg/ml的乙二胺二邻苯基乙酸钠，3、不添加焦亚硫酸钠和乙二胺二邻苯基乙酸钠的沉淀剂配制内标液，在37℃条件下放置7、20、40天，考察焦亚硫酸钠、乙二胺二邻苯基乙酸钠对内标液中丙戊酸内标(丙戊酸-d6)的保质期影响。
107.表7、不同内标液对丙戊酸内标稳定性的影响
[0108][0109]
结果如表7所示，可以看出在不添加焦亚硫酸钠或乙二胺二邻苯基乙酸钠的情况下，丙戊酸内标含量随放置时间的延长，出现明显的降低；而在添加焦亚硫酸钠或乙二胺二邻苯基乙酸钠的沉淀剂中，内标液在37℃下放置40天，丙戊酸内标的含量变化在15％以内，稳定性较好。尤其是在添加乙二胺二邻苯基乙酸钠的情况下，内标液在37℃下放置40天，丙戊酸内标的含量变化仅在1％左右，稳定性非常出色。
[0110]
本实施例还进一步通过实验，验证了在2-8℃情况下，放置3年后，未添加稳定剂的内标液中，丙戊酸内标含量降低了35％以上；添加了焦亚硫酸钠的内标液中，丙戊酸内标的含量变化在20％左右；而添加了乙二胺二邻苯基乙酸钠的内标液含量依然保持稳定，丙戊酸内标的含量变化仅在3％左右。可见在内标液中添加乙二胺二邻苯基乙酸钠，可以显著提高内标液的稳定性，延长保存期限，可以实现放置3年，3年内可以随取随用，大幅降低人工和物质成本。
[0111]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。