一种秋水仙碱杂质F的检测方法与流程

一种秋水仙碱杂质f的检测方法
技术领域
1.本发明属于化学药物分析检测领域，具体涉及一种秋水仙碱杂质f的检测方法。


背景技术：

2.秋水仙碱(colchicine)为百合科植物丽江山慈菇iphigenia indica kunthet benth.的球茎中提取得到的一种生物碱，主要用于抗痛风病。本品在中国药典、欧洲药典和美国药典中均有收载，且各国药典秋水仙碱原料药标准均收载了杂质f，都采用与三价铁显色法检查。结构式分别如下：
[0003][0004]
显色法方法专属性差，无法给出具体杂质含量数值，片剂中由于辅料干扰，无法采用该法测定杂质f；另采用药典有关物质检查色谱条件，杂质f峰形差，积分不准确。本发明采用hplc法测定秋水仙碱中杂质f的含量。峰形良好，专属性强，不受其他杂质干扰，方法可靠，能计算出杂质具体含量值。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：本发明的目的是提供一种秋水仙碱及其片剂中杂质f的hplc检测方法，使其专属性、定量限、检测限、线性范围、重复性、准确度等方面完全符合标准并且具有较高的精密度。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种秋水仙碱杂质f的检测方法，其特征在于，通过液相色谱法检测秋水仙碱及其片剂中杂质f的含量；
[0007]
所述杂质f为去甲秋水仙碱，化学名称为n-(10-羟基-1,2,3-三甲氧基-9-氧代-5,6,7,9-四氢苯并[a]庚二烯-7-基)乙酰胺，结构式如下：
[0008][0009]
具体地，该检测方法采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用含铝离子
溶液作为配制样品溶液的稀释剂，采用含铝离子溶液作为流动相a，采用有机溶剂作为流动相b进行梯度洗脱。
[0010]
具体地，含铝离子溶液为硫酸铝溶液、硫酸铝钾溶液、氯化铝溶液中的一种或多种。
[0011]
具体地，该检测方法最低能定量检测供试品中0.01％的杂质f。
[0012]
具体地，本发明所提供的一种秋水仙碱中杂质f的检测方法，包括如下步骤：
[0013]
a)配制原料药供试品溶液
[0014]
精密称取秋水仙碱原料药至量瓶中，用稀释剂制成秋水仙碱原料药供试品溶液；
[0015]
b)配制片剂供试品溶液
[0016]
取秋水仙碱片，研细，精密称定适量，置量瓶中，加稀释剂制成秋水仙碱片剂供试品溶液；
[0017]
c)配制对照品溶液
[0018]
取杂质f适量，加稀释剂溶解制成对照品溶液；
[0019]
d)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质f的含量。
[0020]
具体地，所述稀释剂含铝离子浓度为25mmol/l或10mmol/l。
[0021]
具体地，所述步骤d)中计算公式为：
[0022][0023][0024]
其中：
[0025]
式中：f—响应因子；ms—对照品溶液中杂质b的称样量；cs—杂质b的含量；vs—对照品溶液中杂质b总稀释体积；as—对照品溶液色谱图中杂质b的峰面积f
平均
—响应因子的平均值；ai—供试品中杂质b的峰面积；mi—供试品称样量；vi—供试品稀释体积。
[0026]
具体地，所述液相色谱的检测条件为：
[0027]
色谱柱：welch xtimate c8色谱柱，规格为150mm
×
4.6mm，5μm；
[0028]
流动相a：含铝离子浓度为10mmol/l的溶液；
[0029]
流动相b：甲醇；
[0030]
洗脱方式：梯度洗脱；
[0031]
流速：1.0ml/min；
[0032]
柱温：35℃；
[0033]
检测波长：250nm；
[0034]
进样体积：10μl。
[0035]
具体地，在梯度洗脱的过程中，洗脱程序为：
[0036]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)06535
665357109012109012.16535206535
[0037]
一种含铝离子溶液-有机溶剂流动相体系在hplc法中检测秋水仙碱杂质f的应用，该hplc法中采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用含铝离子溶液作为配制样品溶液的稀释剂，采用含铝离子溶液作为流动相a，采用有机溶剂作为流动相b进行梯度洗脱。
[0038]
具体地，含铝离子溶液为硫酸铝溶液、硫酸铝钾溶液、氯化铝溶液中的一种或多种，流动相b为甲醇，流动相a含铝离子浓度为10mmol/l，稀释剂含铝离子浓度为25mmol/l或10mmol/l。
[0039]
本发明的有益效果在于：(1)本发明在溶剂和流动相中添加了铝离子，使杂质f与铝离子形成稳定络合物，并且杂质f和秋水仙碱能有效分离，杂质f峰形良好，不受色谱系统中微量金属离子污染物干扰导致的不对称峰形。(2)本发明在专属性、定量限、检测限、线性范围、准确性以及精密度上表现出无可拟比的优势。
附图说明
[0040]
图1是杂质f在水-甲醇流动相体系下色谱图；
[0041]
图2是杂质f在水-甲醇流动相体系下紫外吸收光谱图；
[0042]
图3是杂质f在10mmol/l硫酸铝钾溶液-甲醇流动相体系下色谱图；
[0043]
图4是杂质f在10mmol/l硫酸铝钾溶液-甲醇流动相体系下紫外吸收光谱图；
[0044]
图5是杂质f对照品的标准曲线图。
具体实施方式
[0045]
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
[0046]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]
依照本发明所述检测方法，主要针对杂质f的检测，用外标法进行计算。
[0048]
本发明所述检测方法在实施方式中采用的仪器与试剂信息见下表：
[0049]
[0050]
本发明实施例中，杂质f含量计算公式如下：
[0051]
(1)
[0052]
式中：f—响应因子；
[0053]
ms—对照品溶液中杂质f的称样量；
[0054]
cs—杂质f的含量；
[0055]
vs—对照品溶液中杂质f总稀释体积；
[0056]
as—对照品溶液色谱图中杂质f的峰面积。
[0057]
(2)
[0058][0059]
式中：f平均—响应因子的平均值；
[0060]
ai—供试品中杂质f的峰面积；
[0061]
mi—供试品称样量，5mg；
[0062]
vi—供试品稀释体积。
[0063]
实施例一
[0064]
例1：本实施例提供一种秋水仙碱中杂质f的检测方法。
[0065]
1、色谱条件：
[0066]
仪器：waters 2695
[0067]
色谱柱：welch xtimate c8色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)
[0068]
流动相a：10mmol/l硫酸铝钾溶液
[0069]
流动相b：甲醇
[0070]
流速：1.0ml/min
[0071]
柱温：35℃
[0072]
检测波长：250nm
[0073]
进样量：10μl
[0074]
洗脱梯度，洗脱程序如表1中所示：
[0075]
表1：梯度洗脱程序
[0076]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)06535665357109012109012.16535206535
[0077]
2、检测方法
[0078]
(1)配制稀释剂
[0079]
取十二水合硫酸铝钾11.9g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀。
[0080]
(2)配制原料药供试品溶液
[0081]
取秋水仙碱约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0082]
(3)配制片剂供试品溶液
[0083]
取本品5片(约相当于含秋水仙碱5mg)，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
[0084]
(4)配制对照品溶液
[0085]
取杂质f对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
[0086]
(5)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质f的含量。
[0087]
例2
[0088]
本实施例提供一种秋水仙碱中杂质f在流动相中水相为纯水和10mmol/l硫酸铝钾溶液的谱图差异，同时考察与秋水仙碱分离情况。
[0089]
1、色谱条件：
[0090]
色谱柱：welch xtimate c8色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)
[0091]
流动相1：水-甲醇(65∶35)
[0092]
流动相2：10mmol/l硫酸铝钾溶液-甲醇(65∶35)，保持6分钟后梯度洗脱
[0093]
流速：1.0ml/min
[0094]
柱温：35℃
[0095]
进样量：10μl
[0096]
2、供试品溶液：取秋水仙碱和杂质f各适量，分别用流动相1和流动相2溶解稀释制成每1ml中分别约含秋水仙碱0.5mg和杂质f 5μg的溶液。
[0097]
按照实施例1的两个色谱条件测定流动相1和流动相2制备的溶液，记录色谱图，见说明书附图1～4和表2。
[0098]
表2：杂质f在不同水相中差异
[0099]
[0100]
结果：1、在两色谱条件下，主成分秋水仙碱均不干扰杂质f检出，专属性良好。
[0101]
2、杂质f在流动相1条件下，保留时间较长，峰形不佳；在有机相比例一致前提下，在水相中添加铝盐，杂质f的保留时间和紫外吸收曲线均发生了显著变化，峰形良好，说明杂质f与铝离子产生了稳定的络合物。
[0102]
例3：定量限和检测限试验
[0103]
检测限(lod)和定量限(loq)根据信噪比法来确定。将对照品溶液逐级稀释，测出的信号与基线噪音进行比较，计算出能被可靠检出的最低浓度，信噪比约为10:1时浓度为定量限浓度；信噪比约为3:1时浓度为检测限浓度。结果见表3。
[0104]
表3：定量限和检测限结果
[0105][0106]
注：灵敏度＝杂质f定量限或检测限浓度/供试品浓度(0.5mg/ml)
[0107]
杂质f在原料药和片剂中质控限度分别为0.15％和1.0％，定量限、检测限灵敏度低于杂质f质控限度的1/10以下，证明本发明的灵敏度良好。
[0108]
例4：线性及范围检测
[0109]
取杂质f适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释成适宜浓度，作为杂质f储备液；取杂质f储备液定量稀释，分别制成供试品浓度的0.015％、0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和3.0％的溶液，作为各线性梯度浓度的供试品溶液。线性关系以测得的峰面积对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性回归系数r的数值应不小于0.999，结果见表4及图5。
[0110]
表4：线性测定结果
[0111][0112]
注：截距比＝线性方程截距/0.1％浓度峰面积
[0113]
由上表结果可知，发明所述检测方法针对杂质f在相对于供试品浓度0.015％～3.0％范围内线性相关系数r为1.000，证明呈良好线性关系。
[0114]
例5：对照品溶液进样精密度检测
[0115]
取杂质f对照品溶液，连续测定6次，考察峰面积相对标准偏差。结果见表5。
[0116]
表5：对照品溶液进样精密度试验结果
[0117][0118]
由上表结果可知，发明所述检测方法针对杂质f对照品溶液测定进样精密度，峰面积rsd小于2％，精密度良好。
[0119]
例6：对照品和供试品溶液稳定性检测
[0120]
取杂质f对照品溶液、原料药和片剂供试品溶液分别于0h、1.5h、4h、7h、11h和24h进样10μl，记录色谱图，并计算杂质f峰面积相对标准偏差，试验结果见表6。
[0121]
表6：对照品、供试品溶液稳定试验结果
[0122]
[0123][0124]
由上表可知，室温放置24小时，对照品溶液峰面积rsd《2.0％，供试品溶液检出杂质f小于定量限，溶液稳定性良好。
[0125]
例7：重复性检测
[0126]
取秋水仙碱原料药和片剂样品，按照本发明实施例1检测方法重复6次检测，来验证方法良好的精密度，结果见表7。
[0127]
表7：重复性测试结果
[0128]
编号原料药供试品片剂供试品a1＜loq＜loqa2＜loq＜loqa3＜loq＜loqa4＜loq＜loqa5＜loq＜loqa6＜loq＜loq均值//rsd(％)//
[0129]
由上表可知，6次检测杂质f均低于检测限，证明该方法具有良好的精密度。
[0130]
例8：中间精密度检测
[0131]
取原料药和片剂样品，由不同人员在不同时间及不同仪器上，与实施例7重复性相同方法测定，比较两人测定结果的差异，结果见表8。
[0132]
表8：中间精密度测试结果
[0133]
[0134][0135]
由上表可知，不同人员在不同时间和不同仪器上测定的十二份供试品溶液中杂质f均低于定量限，该检测方法中间精密度良好。
[0136]
例9：准确度检测
[0137]
采用加样回收法测定，测定加标样品中杂质f的实际测定量与理论量之间的比值(回收率)，以百分率％表达，要求回收率在90％～110％之间，以证实方法具有良好的准确度，结果见表9。
[0138]
表9：准确度试验结果
[0139][0140]
由上表可知，杂质f在原料药和片剂中各回收率在介于99.7％～104.5％，符合验证要求(90％～110％)，证实了该方法具有良好的准确度；回收率rsd值小于2％，重复性良好。
[0141]
实施例二
[0142]
例10：本实施例提供一种秋水仙碱中杂质f的检测方法。
[0143]
1、色谱条件：
[0144]
仪器：waters 2695
[0145]
色谱柱：welch xtimate c8色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)
[0146]
流动相a：5mmol/l硫酸铝溶液
[0147]
流动相b：甲醇
[0148]
流速：1.0ml/min
[0149]
柱温：35℃
[0150]
检测波长：250nm
[0151]
进样量：10μl
[0152]
洗脱梯度，洗脱程序如表10中所示：
[0153]
表10：梯度洗脱程序
[0154]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)06535665357109012109012.16535206535
[0155]
2、检测方法
[0156]
(1)配制稀释剂
[0157]
取水合硫酸铝1.8g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀。
[0158]
(2)配制原料药供试品溶液
[0159]
取秋水仙碱约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0160]
(3)配制片剂供试品溶液
[0161]
取本品5片(约相当于含秋水仙碱5mg)，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
[0162]
(4)配制对照品溶液
[0163]
取杂质f对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
[0164]
(5)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质f的含量。
[0165]
例11：定量限和检测限试验
[0166]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例3实验，定量限、检测限灵敏度低于杂质f质控限度的1/10以下，证明本发明的灵敏度良好。
[0167]
例12：线性及范围检测
[0168]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例4实验，由结果可知，发明所述检测方法针对杂质f在相对于供试品浓度
0.015％～3.0％范围内线性相关系数r为1.000，证明呈良好线性关系。
[0169]
例13：对照品溶液进样精密度检测
[0170]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例5实验，由结果可知，发明所述检测方法针对杂质f对照品溶液测定进样精密度，峰面积rsd小于2％，精密度良好。
[0171]
例14：对照品和供试品溶液稳定性检测
[0172]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例6实验，由结果可知，室温放置24小时，对照品溶液峰面积rsd《2.0％，供试品溶液检出杂质f小于定量限，溶液稳定性良好。
[0173]
例15：重复性检测
[0174]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例7实验，结果见表11。
[0175]
表11：重复性测试结果
[0176]
编号原料药供试品片剂供试品a1＜loq＜loqa2＜loq＜loqa3＜loq＜loqa4＜loq＜loqa5＜loq＜loqa6＜loq＜loq均值//rsd(％)//
[0177]
由上表可知，6次检测杂质f均低于检测限，证明该方法具有良好的精密度。
[0178]
例16：中间精密度检测
[0179]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例8实验，结果见表12。
[0180]
表12：中间精密度测试结果
[0181]
编号原料药供试品片剂供试品a1《loq《loqa2《loq《loqa3《loq《loqa4《loq《loqa5《loq《loqa6《loq《loqb1《loq《loqb2《loq《loqb3《loq《loqb4《loq《loqb5《loq《loq
b6《loq《loq均值//rsd//
[0182]
由上表可知，不同人员在不同时间和不同仪器上测定的十二份供试品溶液中杂质f均低于定量限，该检测方法中间精密度良好。
[0183]
例17：准确度检测
[0184]
将实施例一中流动相a和稀释剂用5mmol/l硫酸铝溶液替代10mmol/l硫酸铝钾溶液，照实施例一中例9实验，结果见表13。
[0185]
表13：准确度试验结果
[0186][0187][0188]
结果：采用硫酸铝替代硫酸铝钾，杂质f回收率98.1％～103.9％，符合验证要求(90％～110％)；回收率rsd值小于2％，重复性良好。
[0189]
综上所述，在专属性的试验中，主成分峰及其引入杂质均不干扰杂质f检测，杂质f与相邻峰之间达到基线分离。
[0190]
在定量限的试验中，杂质f定量限浓度远低于质控限度(0.15％)；杂质f检测限浓度低于质控限度的1/10(0.01％)。
[0191]
在线性范围的试验中，杂质f在相对于供试品浓度0.015％～3.0％范围内线性关系良好，相关系数r为1.000，y轴截距相对限度浓度对照品峰面积的百分比远小于25％。
[0192]
在准确度的试验中，杂质f的回收率在在90％～110％之间，rsd值小于2％。
[0193]
在重复性的试验中，6份样品杂质f均小于loq。
[0194]
在中间精密度的试验中，由不同试验人员，于不同日期，在不同仪器上分别测定的6份样品中杂质f含量均小于loq。
[0195]
由此可知，本发明采用含铝离子溶液-甲醇流动相洗脱体系，使得杂质f与铝离子
形成稳定络合物，并且杂质f和秋水仙碱能有效分离，峰型对称性较好，不受色谱系统中微量金属离子污染物干扰导致的不对称峰形，利于杂质f的检出。同时在专属性、定量限、检测限、线性范围以及重复性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。
[0196]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为发明的保护范围。