一种用于低温保存脂肪间充质干细胞的保存液的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于低温保存脂肪间充质干细胞的保存液。


背景技术：

2.脂肪间充质干细胞(简称mscs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。有以下优点：取材相对容易、量大、免疫原性低，以及容易过伦理。是目前备受关注可在体外培养扩增一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞以及肌肉细胞等多种组织细胞。
3.细胞治疗需要大量细胞才能满足临床需求，所以在生产中要建大量细胞库用以冻存，生产按照临床需求用细胞保存液复苏、洗涤制备终产品，并在2-8℃冷链运输至运输中心。
4.冻存后的细胞相对于新鲜细胞来说，脆弱易破碎，而复苏细胞至终产品期间步骤多，时间长，若缺合适的细胞保存液难以确保mscs的活率，从而影响产品质量和细胞治疗效果。为确保mscs临床效果，具有较高的细胞活率、良好的生存能力亟需在本领域开发一种能够有效在低温保存脂肪间充质干细胞的保存液。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于一种用于低温保存脂肪间充质干细胞的保存液。
6.本发明的第一方面，提供一种细胞保存液，包含：
7.复方电解质注射液；
8.葡萄糖氯化钠注射液；
9.维生素；
10.氨基酸。
11.在另一优选例中，所述维生素选自维生素a、维生素b、维生素c、维生素d、维生素e、维生素k中的一种或两种以上的组合。
12.在另一优选例中，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上的组合。
13.在另一优选例中，所述维生素为水溶性维生素，每250ml细胞保存液中，含1/48～1/24支水溶性维生素。
14.在另一优选例中，每支水溶性维生素包含：硝酸硫胺2-5mg，核黄素磷酸钠4-6mg，烟酰胺30-50mg，盐酸吡多辛4-6mg，泛酸钠15-18mg，维生素c钠100-135mg，生物素50-80ug，叶酸0.2-0.6mg，维生素b12 3-8ug。
15.在另一优选例中，每支水溶性维生素包含：硝酸硫胺3.1mg，核黄素磷酸钠4.9mg，烟酰胺40mg，盐酸吡多辛4.9mg，泛酸钠16.5mg，维生素c钠113mg，生物素60ug，叶酸0.4mg，
维生素b12 5.0ug。
16.本发明中，水溶性维生素符合卫生部药品标准(二部)第五册第44页“注射用水溶性维生素”的标准要求。
17.在另一优选例中，所述的细胞保存液中，所述氨基酸的体积占所述保存液总体积的0.2％-3％，较佳为0.2％-2.5％。
18.在另一优选例中，每250ml氨基酸包含：丙氨酸2-5g、精氨酸1-4g、天冬氨酸0.4-0.8g、胱氨酸0.01-0.08g、谷氨酸0.8-1.5g、甘氨酸1-2g、组氨酸0.8-1.5g、亮氨酸1-2g、异亮氨酸0.8-1.5g、甲硫氨酸0.8-1.5g、苯丙氨酸1-2g。
19.在另一优选例中，每250ml氨基酸包含：丙氨酸3.05g、精氨酸2.10g、天冬氨酸0.63g、胱氨酸0.05g、谷氨酸1.05g、甘氨酸1.48g、组氨酸1.2g、亮氨酸1.48g、异亮氨酸1.05g、甲硫氨酸1.05g、苯丙氨酸1.48g。
20.在另一优选例中，每1000ml复方电解质注射液中包含：氯化钠4-6g、葡萄糖酸钠4-6g、醋酸钠3-5g、氯化钾0.2-0.5g、氯化镁0.2-0.5g。
21.在另一优选例中，每1000ml复方电解质注射液中包含：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。
22.在另一优选例中，复方电解质占保存液的体积比为80％～98％(v/v)，较佳为85％～96％(v/v)。
23.在另一优选例中，每100ml葡萄糖氯化钠注射液中含4-6g葡萄糖，含0.85-0.95g氯化钠。
24.在另一优选例中，所述葡萄糖氯化钠注射液的体积占所述保存液总体积的1％-15％。
25.在另一优选例中，所述葡萄糖氯化钠注射液中葡萄糖含量5％，氯化钠含量0.9％。
26.在另一优选例中，所述葡萄糖氯化钠注射液的体积占所述保存液总体积的2％-14％，较佳为3％-12％。
27.本发明的第二方面，提供一种脂肪间充质干细胞混合物，所述脂肪间充质干细胞混合物包含脂肪间充质干细胞和第一方面所述的保存液。
28.在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞为复苏后的脂肪间充质干细胞。
29.在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞与保存液的比例为：1～5
×
107个细胞：1-3ml保存液。
30.在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞中，占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原cd90，
31.占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原cd73；
32.占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原cd105；
33.具有表面抗原hla-dr的细胞占总细胞数量的0-0.5％；
34.具有表面抗原cd45的细胞占总细胞数量的0-5％；和/或
35.具有表面抗原cd14的细胞占总细胞数量的0-5％。
36.本发明的第三方面，提供一种细胞低温保存方法，所述方法包括步骤：将细胞悬浮于第一方面所述的细胞保存液中，然后在低温下进行保存。
37.在另一优选例中，所述低温是指2-8℃。
38.在另一优选例中，所述细胞为脂肪间充质干细胞。
39.在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞为复苏后的脂肪间充质干细胞。
40.本发明的第四方面，提供一种脂肪间充质干细胞库，所述脂肪间充质干细胞库包含第二方面所述的脂肪间充质干细胞混合物。
41.本发明的第五方面，提供第一方面所述的保存液的用途，用于保存脂肪间充质干细胞，或用于建立脂肪间充质干细胞库，或用于保持脂肪间充质干细胞的活率，或用于保持脂肪间充质干细胞表面标记物。
42.在另一优选例中，所述保存是指低温保存，其中低温是指2-8℃。
43.在另一优选例中，所述脂肪间充质干细胞为复苏后的脂肪间充质干细胞。
44.本发明提供的用于保存脂肪间充质干细胞的保存液，复方电解质加入氨基酸、维生素及葡萄糖氯化钠，于2-8℃低温条件下保存细胞72h后，细胞活率达到70％以上，满足临床需求。
45.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
46.图1为0h细胞形态图，其中a：保存在ce01ks中0h的细胞接种后第1天的细胞形态；b：保存在ce01ks中0h的细胞接种后第3天的细胞形态c：保存在生理盐水中0h的细胞在接种后第1天的细胞形态；d：保存在生理盐水中0h的细胞在接种后第3天的细胞形态。
47.图2为24h细胞形态图，其中e：保存在ce01ks放置冰箱24h的细胞在接种后第1天的细胞形态；f：保存在ce01ks放置冰箱24h的细胞在接种后第4天的细胞形态；g：保存在生理盐水中放置冰箱24h的细胞在接种后第1天的细胞形态；h：保存在生理盐水放置冰箱24h的细胞在接种后第4天的细胞形态。
48.图3为48h细胞形态图，其中i：保存在ce01ks放置冰箱48h的细胞在接种后第1天的细胞形态；k：保存在ce01ks放置冰箱48h的细胞在接种后第6天的细胞形态；j：保存在生理盐水中放置冰箱48h的细胞在接种后第1天的细胞形态；l：保存在生理盐水放置冰箱48h的细胞在接种后第6天的细胞形态。
49.图4为0h、冰箱放置24h、48h、72h后的细胞凋亡流式图。
50.图5为0h、冰箱放置24h、48h后的细胞表面标记物的变化。
51.图6为0h的细胞表面标记物的流式图。
52.图7为冰箱放置24h后的细胞表面标记物的流式图。
53.图8为冰箱放置48h后的细胞表面标记物的流式图。
具体实施方式
54.本发明人基于长期而深入的研究，研发出一种用于保存脂肪间充质干细胞尤其是复苏后的脂肪间充质干细胞的保存液，复方电解质加入氨基酸、维生素及葡萄糖氯化钠作为保存液，于2-8℃低温条件下保存细胞72h后，细胞活率达到70％以上。在此基础上，完成
了本发明。
55.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
56.实施例
57.保存液的配制
58.采用表1所示的组分和量配制保存液，标记为ce01ks。
59.表1 ce01ks保存液配方(按总体积250ml配制)
[0060][0061]
每1000ml复方电解质注射液中包含：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。
[0062]
每100ml葡萄糖氯化钠注射液中含5g葡萄糖，含0.9g氯化钠。
[0063]
250ml氨基酸包含：丙氨酸3.05g、精氨酸2.10g、天冬氨酸0.63g、胱氨酸0.05g、谷氨酸1.05g、甘氨酸1.48g、组氨酸1.2g、亮氨酸1.48g、异亮氨酸1.05g、甲硫氨酸1.05g、苯丙氨酸1.48g。
[0064]
每支水溶性维生素包含：硝酸硫胺3.1mg，核黄素磷酸钠4.9mg，烟酰胺40mg，盐酸吡多辛4.9mg，泛酸钠16.5mg，维生素c钠113mg，生物素60ug，叶酸0.4mg，维生素b12 5.0ug。
[0065]
ce01ks与生理盐水细胞悬液的制备
[0066]
1)细胞复苏：ceo1ks与生理盐水2组各取30ml提前于37℃水浴锅中预热10min后，各取1支冻存脂肪间充质干细胞进行细胞复苏，取300ul计数。
[0067]
2)细胞离心：放置于已预冷的离心机中4℃，800～1000rpm,离心5～10分钟；
[0068]
3)细胞洗涤：弃去上清，重悬细胞，加入30ml上述2种液体用于洗涤，按照上述细胞离心方式离心，再次弃去上层细胞上清，取300ul计数。
[0069]
4)过滤：重悬底层沉淀，加上述2种液体至30ml，100um滤器过滤去除大团的细胞块，取300ul计数。
[0070]
5)nc200细胞计数仪计数：完全按照细胞计数仪操作说明书操作，取50ul细胞悬液与配套solution 1 1:1混合，取via1上样，选取“viability and cell count-aggregated cells assay”，再取一块新via1吸取未加solution的原液，上样，读取细胞数。
[0071]
6)细胞悬液定容：细胞过滤后，按照步骤2离心后，按照1.3*107/ml重悬。
[0072]
7)活细胞、坏死及凋亡占比以及细胞活率、细胞表面标记物、细胞形态
[0073]
细胞凋亡检测：将细胞发放装瓶，该时间点定为0h，放置于2-8℃冰箱内，分别于0h、24h、48h，各组取60ul细胞，用1％hsa dpbs洗涤2次后，每组流式管中细胞加入5ul fitc annexin v，在室温闭光15min，加入5ul的propidium iodide在美天旎macsquant analyzer 10检测。
[0074]
细胞表面marker检测：分别于0h、24h、48h取60μl细胞，用1％hsa-dpbs洗涤液洗涤1次后，分装成3份，再次洗涤1次后，第1管加入hla-dr-pe/cd14-fitc/cd45-apc各1ul，第2管加cd73-pe/cd90-fitc/cd105-apc各1ul，第3管加pe/fitc/apc ios各1ul，4℃孵育40分钟，洗涤后加入7aad后孵育10分钟，在美天旎macsquant analyzer 10检测。
[0075]
分别于0h、24h、48h取6*105细胞于6ml cbmg培养基中，接种3孔，每孔2ml，分别在接种再培养后每天拍照。
[0076]
结果
[0077]
经保存的细胞的活率结果如表2所示，细胞形态如图1-3所示。
[0078]
表2：保存细胞的细胞活率变化
[0079][0080]
从表中看出细胞活率变化情况：0h细胞活率达90％以上，放置72h后，ce01ks保存的细胞的活率仍然维持在70％以上，而生理盐水保存的细胞活率低于35％。
[0081]
图1为0h细胞形态图，其中a：保存在ce01ks中0h的细胞接种后第1天的细胞形态；b：保存在ce01ks中0h的细胞接种后第3天的细胞形态c：保存在生理盐水中0h的细胞在接种后第1天的细胞形态；d：保存在生理盐水中0h的细胞在接种后第3天的细胞形态。
[0082]
图2为24h细胞形态图，其中e：保存在ce01ks放置冰箱24h的细胞在接种后第1天的细胞形态；f：保存在ce01ks放置冰箱24h的细胞在接种后第4天的细胞形态；g：保存在生理盐水中放置冰箱24h的细胞在接种后第1天的细胞形态；h：保存在生理盐水放置冰箱24h的细胞在接种后第4天的细胞形态。
[0083]
图3为48h细胞形态图，其中i：保存在ce01ks放置冰箱48h的细胞在接种后第1天的细胞形态；k：保存在ce01ks放置冰箱48h的细胞在接种后第6天的细胞形态；j：保存在生理盐水中放置冰箱48h的细胞在接种后第1天的细胞形态；l：保存在生理盐水放置冰箱48h的细胞在接种后第6天的细胞形态。
[0084]
表3：冰箱放置0h、24h、48h、72h后的细胞凋亡情况
[0085][0086]
细胞凋亡结果如表3所示，表中看出细胞在发放0h、放置24h、48h及72h后的细胞凋亡情况。在发放0h到放置72h，活细胞会随着细胞放置时间延长而降低，坏死细胞随之增加，但是保存在ce01ks中细胞活细胞降低幅度较慢，能较好维持细胞活率，而生理盐水细胞活细胞降低较快，仅维持24h细胞活率达70％，具体细胞凋亡如图4所示。
[0087]
表4：冰箱放置0h、24h、48h后的细胞表面标记物的变化
[0088][0089]
表4中示出放置在冰箱不同时间点检测表面标记物结果，可以看出，阳性》95％，阴性《2％。
[0090]
实验结论
[0091]
保持较好的细胞活率及细胞功能是临床细胞发挥细胞效能最大的挑战。本实验复方电解质加入氨基酸、维生素及葡萄糖氯化钠，按照细胞悬液制备标准操作规程发放细胞，放置在2-8℃冰箱保存细胞，分别在0h、24h、48h、72h取样，比较细胞在不同时间点细胞活率稳定性、细胞凋亡变化趋势、细胞表面标记物、细胞形态及细胞增殖能力，获得以下结果：
[0092]
细胞保存在ce01ks与生理盐水细胞形态差异不大，但是对于细胞疗法，fda制定了细胞最低生存能力标准(通常设置为70％)，本发明中采用ce01ks，在放置72h后细胞活率大于70％，且细胞凋亡也很缓慢(而生理盐水仅能维持24h)，且细胞表面标记物及在发放后变化不大，各时间点阳性均在95％以上，阴性低于2％。
[0093]
综合所述：相对于生理盐水，ce01ks较好保存细胞。
[0094]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。