用于多糖定量的改进方法与流程

技术特征：
1.用于测量测试样品中的一种或多种多糖的浓度和/或量的方法，其包括或由以下步骤组成：a. 用盐酸和三氟乙酸对所述测试样品的酸水解；b. 步骤(a)的水解的测试样品的色谱分离；和c. 基于步骤(b)中产生的数据，确定一种或多种多糖的浓度和/或量。2.权利要求1的方法，其中所述色谱是分析性的色谱法，例如，柱色谱法、气相色谱法或液相色谱法(例如hplc [高效液相色谱法]或hpaec [高效阴离子交换色谱法])。3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述色谱是hpaec，例如hpaec-ped (高效阴离子交换色谱法和脉冲电化学检测)或hpaec-pad (高效阴离子交换色谱法和脉冲安培检测)。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述hpaec是hpaec-pad。5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多糖是细菌多糖，例如，荚膜多糖或脂多糖。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多糖对常见的酸水解具有抗性。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多糖含有2-氨基糖醛酸。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多糖选自：a. vi荚膜多糖；b. 宋氏志贺氏菌o-抗原；c. 鲍氏不动杆菌k1荚膜多糖；d. 肺炎链球菌血清型12a；e. 肺炎链球菌血清型12f；f. 金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖；g. 金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；h. 肠杆菌共同抗原(eca)。9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多糖是vi荚膜多糖。10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸水解步骤使用一定浓度的盐酸和三氟乙酸进行，以实现所述测试样品多糖的至少90%的单体回收，例如，所述测试样品多糖的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的单体回收。11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸水解步骤导致无单体降解或实质上无单体降解。12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸水解步骤没有导致与含有不同2-氨基糖醛酸的多糖共有的hpaec-pad峰。13.前述权利要求中任一项的方法，其中酸水解步骤(a)的盐酸和三氟乙酸混合使用。14.前述权利要求中任一项的方法，其中将盐酸和三氟乙酸混合至如下的浓度：a. 7m至10m hcl (例如8m至10m、8m至9m，或8m hcl)；和b. 5%至30% v/v tfa (例如10% 至25%、10%至20%，或10% tfa v/v tca).在一个实施方案中，优选地，所述酸水解步骤不使用<6m hcl进行。15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸水解步骤在72.0℃至85.0℃进行，例如，75.0℃至82.5℃、77.5℃至82.5℃，或80℃。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸水解步骤进行3.5至6.0小时，例如，4.0至6.0小时、4.0至5.5小时、4.0至5.0小时或4.5小时。17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述hpaec-pad步骤运行≤30分钟，例如，≤25分钟、≤20分钟、≤19分钟、≤18分钟、≤17分钟、≤16分钟、≤15分钟、≤14分钟、≤13分钟、≤11分钟、≤10分钟或≤9分钟。18.前述权利要求中任一项的方法，其中在酸水解之前，对所述测试样品进行脱盐和/或缓冲液交换，例如，通过透析或凝胶过滤色谱。19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括或由以下步骤组成：i. 可选地，通过凝胶过滤色谱对测试样品脱盐.ii. 将所述测试样品与tfa-hcl溶液以0.3:1 v/v的比率混合(例如通过涡流混合)；iii. 将步骤(ii)的混合物在80℃加热4.5小时；iv. 将步骤(iii)的混合物冷却至室温；v. 使步骤(iv)的混合物蒸发(例如通过氮冲洗，由此充分干燥所述测试样品[例如至少99 w/w %干燥的，优选99.5 w/w %、99.6 w/w %、99.7 w/w %、99.8 w/w %、99.9 w/w %、99.99 w/w %干燥的])；vi. 将步骤(v)的混合物溶解在水中(例如300 ml的水并溶解，例如通过涡流)；vii. 通过0.2 μm过滤器过滤步骤(vi)的混合物；viii. 对步骤(vii)的混合物进行hpaec-pad；ix. 确定在所述测试样品中所述或一种多糖的量和/或浓度。20.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(c)中，通过与一种或多种对照样品的色谱测量结果比较，来确定一种或多种多糖的浓度和/或量。21.根据权利要求20的方法，其中所述一种或多种对照样品包含预定浓度和/或量的有待于在所述测试样品中测量的多糖。22.根据权利要求20或21的方法，其中所述一种或多种对照样品经过与所述测试样品相同的样品制备、酸水解和色谱步骤。23.根据权利要求20-21中任一项的方法，其中所述测试样品的样品制备、酸水解和色谱步骤与所述一种或多种对照样品的样品制备、酸水解和色谱步骤同时进行或连续进行。24.权利要求20-23中任一项的方法，其中使用足够数量和/或浓度范围的不同浓度的对照样品，以提供最佳拟合线，例如，导致(a) 显著的回归模型，(b) 非显著的失拟，和/或(c) 正态分布而不需要数据变换的残差的最佳拟合线。25.权利要求20-24中任一项的方法，其中在所述一种或多种对照样品中多糖的下列浓度是0.05至15
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g/ml，例如，0.05、0.08、0.10、0.15、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5和10
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g/ml。26.权利要求20-25中任一项的方法，其中在所述一种或多种对照样品中的多糖浓度是5.0至10
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g/ml。27.权利要求20-26中任一项的方法，其中通过与一种或多种对照样品的比较确定测试样品中多糖的量，例如使用由对照样品数据生成的校准曲线。28.在一个实施方案中，所述测试和/或对照样品的色谱运行顺序是随机的. 在一个实施方案中，所述测试和对照样品以一式三份、四份或五份重复运行。
29.一种测量样品中多糖的浓度和/或量的方法，其基本如本文在说明、实施例和附图中所述。30.一种测试样品，其使用权利要求1-29中任一项所定义的酸水解步骤制备。31.一种用于实施权利要求1-28中任一项所定义的方法的试剂盒，其包括(a)盐酸、(b)三氟乙酸、(c)可选地，如权利要求20-28中任一项定义的一种或多种对照样品，和(d)可选地，使用说明。

技术总结
本发明提供一种用于测量测试样品中的一种或多种多糖的浓度和/或量的方法，其包括或由以下步骤组成：(a)用盐酸和三氟乙酸对测试样品的酸水解；(b)步骤(a)的水解的测试样品的色谱分离；和(c)基于步骤(b)中产生的数据，确定一种或多种多糖的浓度和/或量，还一起提供了经处理的测试样品和用于其使用的试剂盒。了经处理的测试样品和用于其使用的试剂盒。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
技术研发日：2021.04.12
技术公布日：2023/1/31