可食用且可灭菌的多孔3D支架及其用途的制作方法

可食用且可灭菌的多孔3d支架及其用途
技术领域
1.本发明涉及可食用且可灭菌的大孔三维(3d)组织工程支架，所述支架优选包含天然聚合物。此外，本发明的支架还包含添加剂和活细胞，所述活细胞黏附并增殖，从而定殖于支架的整个表面并产生用于随后形成在本领域中也被称为培养肉(cultured meat)、养殖肉(cultivated meat)、基于细胞的肉、细胞肉和/或清洁肉的体外工程化组织的原材料，所述体外工程化组织随后可以被加工成用于动物或人消费的食品，而无需修饰或从支架中移出细胞。本文还描述了使用所述支架来制造用于加工为食品的包含所述支架的培养肉和/或组织的方法。


背景技术：

2.人口增长预期将持续提高(到2050年达到97亿7千万，以及在世纪之交达到111亿8千万)，这将带来更多的废物产生，并且我们人类的营养需求将如同我们一样增长。肉在蛋白质食品中占有重要地位。如由联合国粮农组织(food and agriculture organization of the united nations)fao提供的信息(http：//www.fao.org/ag/againfo/themes/es/meat/backgr_composition.html)所透露的，食品法典(codex alimentarius)将肉定义为“动物的预期用于人消费或者被判定为安全的并且适用于人消费的所有部分”。
3.在过去的40年里，全球的肉产量显著增长，主要是由于国家的发展。该增长限制了生产系统，从而在自然资源(土地和水)、人类健康(流行病)和动物福祉(动物痛苦)方面不利地影响环境，由于这一点，培养肉的消费通过帮助创建更加可持续的系统而显著地有助于养活地球上的所有居民。fao估计，在接下来的40年里，对动物蛋白的需求将继续增长，并且进而满足该需求的挑战也将持续增加。如果不与新策略(例如培养肉或通过体外培养先前从动物中提取的肌肉细胞而生产的肉)相结合，则当前的生产模式将无法满足该需求。
4.对培养肉进行的大多数研究可以被认为是组织工程的变体或应用，所述组织工程是通过结合细胞、材料和工程工具试图设计用于修复、替代或再生受损组织的功能性生物结构的生物医学学科。在该领域取得的进展主要基于在多种生物医学应用例如骨组织、心脏组织、肝组织等的再生中使用三维支架/结构进行组织生长。
5.国际专利申请wo1999031222a1公开了通过体外培养被接种在传统二维基质例如胶原上的动物肌肉细胞来工业生产肉。此外，美国专利us7270829b2公开了通过非人组织工程获得的肉产品和用于生产所述肉产品的方法。所述肉产品包含离体培养的肌肉细胞，并且被用于食品消费。肌肉细胞可以生长并附着至支持结构，并且可以源自任何非人细胞。肉产品还可以包含与肌肉细胞一起离体培养的其他细胞，例如脂肪细胞或软骨细胞、或二者。该文献未提及用于细胞生长的支持物。
6.专利申请us 2006/0121006 a1涉及使用培养动物细胞来生产营养产品或治疗产品的用途，其中所述细胞源自稀有物种或濒危物种。还包括适用于人和非人消费的无论是作为食品还是作为食品补充剂的包含肉的可食用产品。本发明还涉及使用大规模培养方法用于细胞在被添加至所述产品之前的增殖的用途。本发明涵盖用于制造所述产品的方法、
所述产品本身及其方法和用途。示出优选培养锚定于支持物特别是呈不同材料的显微结构(微球、纤维等)形式的支持物例如胶原、几丁质、聚苯乙烯、聚酯或聚丙烯的细胞，这种选择将取决于产品的最终用途以及显微结构是否能保留在最终产品中。
7.专利申请us 2015/0079238 a1中还描述了细胞生长支持物包括被称为微载体的微球和微海绵，适用于在细胞培养物用生物反应器中使用，所述细胞生长支持物可以用于形成可食用工程肉产品。具体地，所描述的可食用支持物包括：(i)可以单独地用于培养细胞(例如，平滑肌细胞)的多孔微型阀；(ii)具有附着的细胞的支架，所述支架可以包含在最终肉产品中，而无需修饰或移出其中的细胞。在一个特定实施方案中，可食用支架可以通过交联的果胶例如硫代丙酰胺(ptp)和包含rgd序列的多肽例如硫醇化cardosin a来形成。最后，所述专利申请还描述了这样的用于在人工状态下制造肉的可食用支架的不同合成方法。有趣的是，应当注意这些发明人在美国申请us 2013/0029008 a1中描述了用于使用培养细胞精心制作可食用工程肉的不同方法。因此，最终的肉产品由多个部分融合的层形成，并且其中各层包含融合的多细胞体(非人肌细胞)。
8.基于天然聚合物的支架对医疗和制药应用显示出巨大的潜力。与由合成聚合物形成的基质相比，由这些生物聚合物(一些具有水凝胶行为能力)形成的基质在生物相容性和可生物降解性方面提供了一系列优点。由于生物聚合物水凝胶的固有特性例如其强大的吸水(溶胀/水合)能力，生物聚合物能够以受控的方式有效地包封和释放许多种疏水性和亲水性治疗分子，包括核酸、蛋白质、抗体等(m.efentakis,adv.polym.tech.2011,30,110-121)。在生物医学应用中，它们已经被用于例如细胞包封，该过程涉及将细胞捕获在聚合物中以保护其免受免疫系统的影响(g.orive等人,nat.med.2003,9,104)。对于成功的细胞包封，重要的是保持适当的扩散平衡以将氧气和营养物输送至细胞，从而提高生物聚合物的孔隙度和渗透性。
9.使用基于天然生物聚合物的不同技术制备大孔3d支架已经成为组织再生所采用的策略(cy,chen等人,theranostics.2015,5,643-655)，尽管这项工作主要以小规模并且在基础研究中进行。通常，在这项研究中已经提出，预期用于组织再生的聚合物基质随着新组织形成而缓慢降解。关于食品工业，由于它们主要由多糖单元形成，它们是许多制剂中的关键组分，它们的主要应用是作为乳化剂、胶凝剂和/或稳定剂(e.bouyer等人,int.j.pharm.2012,436,359-378)。
10.鉴于对直接从动物获得的肉的替代品的需求不断增长，开发如下可以由经批准用于食品用途的天然聚合物构成的具有3d结构和大表面积的基质或支架将是令人感兴趣的：其可以在培养肉的生产中甚至在大规模生物反应器中用作动物细胞用支持物，并且其由于由经批准用于食品用途的天然生物聚合物构成而可以保留在最终产品中。


技术实现要素：

11.本发明提供了可食用且可灭菌的大孔三维(3d)组织工程支架(在下文中为本发明的支架)，所述支架包含至少一种生物相容性聚合物。本发明的支架主要由天然来源或合成来源的生物相容性聚合物构成，其中细胞优选哺乳动物细胞在其为非人细胞的条件下可以充分地黏附和增殖，直到在支架的整个有用表面上定殖，其中细胞优选为黏附细胞。
12.使用支架技术来支持大规模培养肉生长的主要挑战之一是支架与大规模生物反
应器中所使用的灭菌技术的相容性。重要的是调整支架以实现用于大量生产食物产品的成本有效的过程。这些灭菌过程基于蒸汽、压力和时间的组合。该过程在高温和高压下操作，以杀死微生物和孢子。本领域已知的支架不适用于在不失去其用于组织工程的特性的情况下完成该过程。
13.相比之下，本发明的支架具有可优选通过热蒸汽灭菌的出乎意料的优点，因为所选择的用于其组成的生物相容性聚合物能够在不降解和/或变性的情况下在热的温度下抵抗高的水蒸汽压力。重要的是要注意，本发明的支架在经受优选通过热蒸汽进行的灭菌过程之后保持其组成和结构完整，从而允许适当的细胞黏附和组织形成。此外，本发明的支架的灭菌过程不仅不会因可能的降解和/或变性而改变材料的适用性，而且甚至改善了用于支持细胞增殖的机械特性。因此，本发明的支架可以是在不失去其作为细胞增殖用支架的特性的情况下可通过本领域技术人员已知的任何方法(优选通过热蒸汽)灭菌的，从而促进其并入到需要低成本和大量生产的工业过程中。
14.因此，本发明公开了可食用且可优选通过热蒸汽灭菌的大孔3d组织支架，其中大孔是相互连通的，并且其中支架包含被提议作为用于哺乳动物细胞优选非人细胞更优选贴壁非人细胞的生长、增殖和分化的支持材料的至少一种生物相容性聚合物，所述支架可以用于获得培养肉。
15.与提出了使用组织工程的构思来生长培养肉的想法，但是没有明确限定适当的支持物或者没有在组织工程的实例中实现的涉及培养肉的已知现有技术相反，本发明首次提出了使用可灭菌的可食用3d大孔宏观结构，所述3d大孔宏观结构包含优选来自天然来源的生物相容性聚合物作为用于遵循组织工程定义的指导方针的培养肉的增殖的支架，并且适用于大规模制造过程。
16.因此，在第一方面中，本发明涉及可食用且可优选通过热蒸汽灭菌的大孔3d组织工程支架，所述支架包含生物相容性聚合物和相互连通的大孔，优选其中大孔和支架包含活细胞。
17.如本文所用，术语“可食用”是指预期用于口腔接触或通过进食消耗的材料，优选食品材料。
18.本文所述的可食用支架适用于也被本领域技术人员称为或已知为适用于人消费的培养肉、养殖肉、基于细胞的肉、细胞肉和/或清洁肉的工程组织的生物制造。例如，本文所述的是用于形成具有高营养成分的组织和/或培养肉产品的可食用且可优选通过热蒸汽灭菌的大孔3d组织工程支架。虽然本文所述的支架及其合成方法和用途主要涉及可食用培养肉产品，但是这样的支架也可以在用于动物(包括哺乳动物和人)的细胞治疗中找到应用，其中期望在不存在动物来源的产品的情况下进行细胞扩增。
19.如本文所用，术语“可灭菌的”或“灭菌”是指破坏所有微生物优选给定环境或材料中或给定环境或材料上的病原微生物以防止感染传播的程序。这通常通过使用热、辐射或化学试剂来进行。在一个优选实施方案中，灭菌过程通过热蒸汽来进行。
20.如本文所用，可在整个本公开中互换使用的术语“支架”或“支持物”涉及允许细胞附着和增殖的3d基质或材料，或者根据本发明的其他化合物例如添加剂。如本文所使用的“附着(attachment)”、“附着(attach)”或“附着(attaches)”是指直接或间接黏附至支架的细胞以及黏附至其他细胞的细胞。
21.如本文所用，术语“生物相容性聚合物”是指例如对生物系统无毒和/或与生物过程一致的合成或天然材料/聚合物。在这方面，聚合物材料的生物相容性表示对活细胞、组织、器官和/或生物系统的免疫排斥、损伤、损害和/或毒性的最小、可忽略或没有风险。
22.在一个优选实施方案中，生物相容性聚合物为天然聚合物。在一个说明性实施方案中，天然聚合物为能够在不降解和/或变性的情况下抵抗高压和高温下的灭菌过程的任何聚合物。因此，天然聚合物或其任何衍生物为例如但不限于多肽、多核苷酸、天然树脂、橡胶、天然聚酯和多糖。在一个更优选实施方案中，天然聚合物选自由以下组成的列表：藻酸盐、壳聚糖、淀粉、葡聚糖、普鲁分支葡聚糖(pullulan)、肝素、硫酸肝素、纤维素、半纤维素、葡甘露聚糖、琼脂、黄原胶、瓜尔胶、硫酸软骨素、明胶、几丁质、多糖、糖胺聚糖、或其任意组合。在一个更优选实施方案中，天然聚合物选自壳聚糖和/或藻酸盐。
23.在使用明胶作为天然聚合物的特定情况下，其是不可通过热蒸汽和高压灭菌的，因为如果经受这些程序，其会部分水解和变性。在该天然聚合物在支架内部以少量与其他生物聚合物例如壳聚糖混合的情况下，支架特性的改变是最小的，仍然保持其黏附特性。
24.这些天然聚合物可以直接使用而无需任何来自商业来源的处理，或者作为替代可以在使用之前，在支架生产的任何步骤中进行化学修饰，以改善本发明的支架的特性。如本文所用，术语“衍生物”是通过化学改变化合物的一部分而获得的但具有与原始化合物相同或甚至更好的特性的类似化合物。因此，本发明的天然聚合物的衍生物是指化学修饰，包括并入不同的基团，例如氨基、醛基、羧酸基、酰胺基、酮基、酯基、烷氧基、硫酸酯基、磷酸酯基等。
25.本发明的支架包含以上所提及的天然聚合物，其具有由经诸如例如美国食品和药物管理局(u.s.food and drug administration，fda)和欧洲食品安全局(european food safety authority，efsa)的主管机构批准用于食品用途的天然生物聚合物构成的优点。在这种意义上，用于本发明的支架的可食用且生物相容性的聚合物被设计成使得支架是可食用的并且不必从最终产品中提取，即为了避免收集过程。
26.在本发明中，高度推荐避免使用选自由以下组成的列表的天然聚合物：胶原、白蛋白(所有类型和形式)、酪蛋白、透明质酸、纤维蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白等，因为它们不适用于热蒸汽灭菌过程。
27.在另一个优选实施方案中，生物相容性聚合物为合成聚合物或其任何变体。合成聚合物的实例包括但不限于来自微生物或通过化学合成技术制备的合成多肽，由从微生物中提取获得的或由其单体例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(poly(lactic-co-glycolic)acid)和聚羟基烷酸酯通过化学合成制备的生物酯，或者由通常公认的天然单体例如单糖(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、或任何衍生物或变体例如糖胺、氨基糖
…
等)、氨基酸或任何衍生物、核苷酸或任何衍生物、脂肪酸或任何衍生物、或其任意组合制备的任何其他合成聚合物。
28.在一个更优选实施方案中，生物相容性聚合物或其任何衍生物的分子量(mw)为1000da至5000000da，优选地10000da至1000000da，更优选地100000da至500000da。
29.本发明的支架具有大孔，优选分层次的和相互连通的大孔，所述大孔的平均孔尺寸为1μm至10000μm。在一个具体实施方案中，平均孔尺寸为50μm至1000μm，优选地50μm至100μm，更优选地100μm至1000μm，或者甚至更优选地100μm至500μm。为了获得更大的大孔，
在用于生产本发明的支架的方法中可以使用特定的模具，这使得可以沿着支架获得具有以上所提及的平均孔尺寸的横向或纵向孔。在这个意义上，通过形成水晶体(溶剂)而获得的孔以及横向大孔的排列使得能够获得具有相互连通的和分层次的多孔结构的生物聚合物支架。本发明的支架的最终孔尺寸受其形成中所使用的聚合物的浓度影响。此外，具有高聚合物浓度的水凝胶产生较小的孔尺寸。在这种情况下，3d大孔支架的生产过程产生50μm至10.000μm，优选地100μm至1000μm，更优选地100μm至500μm的孔尺寸。
30.在另一个优选实施方案中，溶解在水溶液、有机溶剂、培养基、或其任意组合中的本文所提及的生物相容性聚合物或其任意组合的重量/体积百分比为0.5％至16％。在另一个优选实施方案中，重量/体积百分比为1％至8％，更优选为1.5％至4％，还更优选为1.5％，或者作为替代，当最终支架中具有多于一种生物相容性聚合物时为任何可能的相对比率。
31.在另一个优选实施方案中，本发明的支架还包含活细胞，优选非人活细胞，并且更优选贴壁非人活细胞，所述活细胞均匀地分布在整个支架中。许多自黏附细胞类型可以用于形成本文所述的培养肉产品。在一些实施方案中，培养肉产品被设计成类似于传统肉产品，并且细胞类型被选择成接近于传统肉产品中所发现的那些。出于本公开的目的，用于沿着本发明的支架进行培养以提供本文所述的具有高营养成分的培养肉或组织的细胞可以包括但不限于例如肌肉细胞、肌肉祖细胞，优选骨骼肌细胞；平滑肌细胞、基质细胞、卫星细胞、成纤维细胞、成肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞例如脂肪细胞祖细胞(adipocyte progenitor cell)、肝细胞、心肌细胞等。由于其结构，本发明的支架使得能够实现多种细胞类型例如尤其是成肌细胞/肌管/成纤维细胞(肌肉细胞)、内皮细胞、脂肪细胞(adipocyte)(脂肪细胞(adipose cell))的增殖和分化，从而产生适用于人消费的具有最终消费者所期望的蛋白质-脂肪成分的培养肉作为最终产品。关于用于生产培养肉的细胞类型，应注意，本发明的支架使得能够实现广泛的细胞系的增殖和分化，使得我们可以进行单一细胞类型的不同培养，例如成肌细胞的培养，所述成肌细胞被分化成肌管以形成肉肌肉组织(蛋白质)。由于这些特征，除非进行成肌细胞与脂肪细胞的细胞共培养，否则最终产品是无脂肪的，如果期望的话，该过程也将是可能的。以这种方式，我们可以影响产品的最终特征，目的是使其对消费者更具吸引力，并且使其适应消费者的需求。
32.在又一个优选实施方案中，沿着本发明的支架培养的活细胞系可以从多种动物来源例如但不限于以下中获得：哺乳动物，例如猪、牛、羊、马、狗、猫；禽类；爬行动物；鱼；两栖动物；甲壳类动物等。这为巨大的市场打开了大门，因为其为最终消费者提供了非常多样化的产品(offering)。
33.为了提供具有改善的特性的支架，其可以与具有高营养价值或者为最终支架提供改善的质地或添加风味的选自以下的其他分子/物质/生物分子形成和/或组合：添加剂、生物活性分子和/或交联剂、或其任意组合。这些化合物或物质还可以提高可以与支架接种和培养的未来细胞的黏附特性和增殖。
34.因此，在另一个优选实施方案中，本发明的支架还包含生物活性配体。生物活性配体特异性地与一种或更多种细胞生物分子相互作用或者与分布在支架内的细胞生物分子或者在支架内增殖或迁移到支架中的细胞生物分子相互作用的生物分子结合。这样的相互作用对于指导细胞命运或诱导细胞以形成组织是有效的。这些化合物或物质还可以提高可
以与支架接种和培养的未来细胞的黏附特性和增殖。生物活性配体的身份将取决于靶细胞的身份，并且合适的生物活性配体的一些实例包括：羧基、胺、酚、胍、硫醇、吲哚、咪唑、羟基、硫酸根、降冰片烯、马来酰亚胺、层粘连蛋白、纤维蛋白原、肽序列，黏附分子例如免疫球蛋白-超家族、钙黏着蛋白(e-、n-、p
‑…
)、选择蛋白(p-、e-、l
‑…
)或整联蛋白；纤连蛋白、聚-l-鸟氨酸、胶原、玻连蛋白、凝集素、聚鸟氨酸、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、环肽、含rgd的肽(arg-gly-asp)、含rgds的肽(arg-gly-asp-ser)，或者被本领域专家认可的促进细胞黏附至支架的任何其他化合物或物质。优选地，本公开的生物活性分子是指在不显著影响其促进细胞黏附的能力的情况下抵抗灭菌过程的那些物质。在一个优选实施方案中，生物活性分子为聚-l-赖氨酸，更优选为聚-ε-赖氨酸。
35.聚-ε-赖氨酸(ε-聚-l-赖氨酸，epl)是天然存在的抗菌阳离子肽，是可溶于水的、可食用的、可生物降解的并且对人和对环境无毒的l-赖氨酸的均聚物。聚-ε-赖氨酸通常被用作天然食品防腐剂、乳化剂，以及用于药性化妆品和制药工业。在这个意义上，聚-ε-赖氨酸通常被用于食品应用例如煮熟的米饭、煮熟的蔬菜、汤、面条、切片鱼(寿司)和肉。
36.这是第一次将聚-ε-赖氨酸用作生物活性分子，优选地用作用于在体外细胞培养中改善细胞黏附的生物活性配体。如本发明中所使用的，聚-ε-赖氨酸不仅发现在本发明的支架的表面上，而且在其内部，是支架的整体3d结构的一部分，从而允许并改善其上的细胞黏附。此外，由于聚-ε-赖氨酸针对酵母、真菌和细菌的天然抗微生物活性，有助于抑制这样的病原微生物在本发明的支架中的生长。
37.此外，聚-ε-赖氨酸对于食品工业来说已经是可大量且低价获得的，从而使其在培养肉的生产中工业化使用。因此，该特性与特征在于可灭菌优选通过热蒸汽灭菌而不会使所选择的用于其组成的生物相容性聚合物降解和/或变性的本发明的支架的出乎意料的优点相结合，使得它们适合在如先前所提及的需要非常低的生产成本的大规模工业反应器中生产。
38.添加剂包括但不限于具有高营养价值或者为根据本发明的最终产品提供改善的质地或添加风味的分子/物质，此外是在不显著影响其促进细胞黏附的能力的情况下抵抗灭菌过程的那些物质。添加剂选自由以下组成的列表：调味剂；增味剂；着色剂；增色剂；盐；酸度调节剂；增稠剂；乳化剂；稳定剂；营养强化剂，例如维生素、氨基酸、纤维；低聚果糖；菊粉；β胡萝卜素；ω脂肪酸；螺旋藻属；益生菌；益生元；皂苷；抗氧化剂；必需脂肪酸；矿物质；等等；或其任意组合。所选择的用于本发明的支架的添加剂优选来自天然来源(origin)或来源(source)。此外，术语添加剂还涵盖提高可以接种在支架中的未来细胞的黏附特性和增殖的化合物。
39.合适的可交联基团的实例为羟基、羰基、醛基、羧酸酯基、碳酸酯基、羧基或衍生物、羧酰胺基、亚胺基、酰亚胺基、硫醇基和/或任何其他基团、聚电解质、无机离子或其任意组合。
40.在另一个优选实施方案中，本发明的支架可以呈水凝胶的形式。在一个优选实施方案中，呈水凝胶形式的本发明的支架可用于在形成组织的同时支持细胞的增殖，此外，可以用作稳定剂、质地构成剂和/或营养载体，从而赋予培养肉非常高的附加价值。此外，呈水凝胶形式的本发明的支架可用作用于靶向分子递送的储库。将水凝胶支架核心引入至培养肉中提供了在生产过程期间包封用于细胞增殖和分化的分子的储库，以及改善了最终组织
或培养肉产品的视觉和营养成分。
41.在另一个优选实施方案中，将本发明的支架用细胞培养基饱和。在一些实施方案中，将支架用促进细胞增殖或存活的培养基(即细胞生长培养基)饱和。在一个更优选实施方案中，细胞生长培养基选自市售的经典培养基例如dulbecco改良的eagle培养基(dmem，mem)及其变体，或者本领域技术人员已知的对于所使用的各细胞类型具体限定的培养基。在一些实施方案中，支架可以浸渍有预期用于递送至食品(优选肉)的生物分子或其他材料。
42.本发明的支架的结构根据需要成形。本发明的支架的形状可以是规则的(例如，圆柱形、球形、圆形、矩形、正方形等)或者不规则的。除了具有为可食用的并且不必移出以制备最终的可食肉食物产品的优点之外，所提及的大多数聚合物样品还用于为原本将被完全丢弃的产品提供了附加价值。例如，图1示出了具有圆柱形和盘形的支架的变化。这些形状中的任一者均可以是多孔的。
43.与其他先前提出的预期用于获得培养肉的细胞培养用支持结构相反，本发明的支架是可容易在大型生物反应器内灭菌的，并且其尺寸使得其适用于大规模生产，并且所述支架具有为具有可食用材料的预制结构的优点。在这个意义上，本发明的支架具有为可灭菌的出乎意料的优点，因为所选择的用于其组成的生物相容性聚合物能够在不降解和/或变性的情况下在热的温度下抵抗高的水蒸汽压力。重要的是要注意，本发明的支架在经受灭菌过程之后保持其组成和结构，从而允许适当的细胞黏附和组织形成。此外，本发明的支架的灭菌过程不仅不会因可能的降解和/或变性而改变材料的适用性，而且甚至改善了用于支持细胞增殖的机械特性。因此，本发明的支架可以是在不失去其作为细胞增殖用支架的特性的情况下可通过本领域技术人员已知的任何方法(优选通过热蒸汽)灭菌的，从而促进其并入到需要低成本和大量生产的工业过程中。在另一个优选实施方案中，本公开的支架的灭菌通过物理灭菌或化学灭菌，优选物理灭菌过程来进行，所述物理灭菌过程选自由以下组成的列表：热蒸汽、干热、间歇灭菌、和电离或非电离辐射，优选热蒸汽。在另一个更优选实施方案中，灭菌过程在高压釜或生物反应器中121℃(250
°
f)至134℃(273
°
f)的温度下以及在0.5巴至1.05巴的压力下通过热蒸汽进行10分钟至60分钟的时间，更优选地，通过热蒸汽进行的灭菌在至少121℃的温度下以及在1.05巴的压力下进行20分钟。
44.此外，由于如先前已经提及的支架的高度大孔结构允许营养物的输送，从而促进细胞黏附和增殖，并且产生可以随后加工成所制备的用于消费的食品的原材料。此外，本发明的支架将细胞分布在完整的3d空间中。迄今为止，这些支架从未被设想用于该目的，因为大规模培养肉生产技术正处于其早期。用于生产培养肉的这些支架的构思是新颖的，并且用于获得呈高度多孔可食用且可灭菌的支架的这种形式的支架的材料的应用也是新颖的。
45.因此，如以上所提及的用于本发明的支架的生物相容性聚合物以及因此包含其的本发明的支架具有以下优点：
46.(i)其也被用作黏合剂，从而使生长的肉的质地和紧密度更优；
47.(ii)其改善了消化过程阶段中营养物的分散、生物利用度和吸收；
48.(iii)考虑到生物相容性聚合物可以为具有水凝胶特性的生物聚合物，细胞所生长的支架还可以充当增粘剂和胶凝剂，从而提供味道和触感令人愉悦的质地；
49.(iv)其还可以充当增味剂和增色剂，因为其本身充当类似于药物释放系统(载体)
的释放系统；
50.(v)其还充当用于食品中公认的健康有益组分和/或游离氨基酸的选择性递送系统，从而为使用这些可食用结构作为维生素、矿物质、核酸或其他生物分子的可能载体开辟了广泛的可能性。
51.本发明的支架满足组织工程的基本要求，包括：高度互连的大孔促进营养扩散并促进细胞增殖、扩散、迁移和细胞-细胞通信。大的内表面积产生大的细胞增殖能力；以3d方式分布细胞促进营养输送，支持细胞迁移和增殖，并促进用于对组织新生产的机械支持。
52.如上所述，本发明的支架适用于多种应用，还包括再生医学和组织工程。所述支架作为组织工程特别有用。因此，可以将其用于促进细胞增殖和组织形成。大孔隙度适用于允许细胞迁移、细胞内基质的形成、营养物的供应、血管生成等。此外，用于再生医学和组织工程的本发明的支架的另外的优点是所述支架是生物相容性的。
53.本发明的支架与不同类型的反应器或生物反应器甚至其中将施加电流以刺激细胞增殖的反应器或生物反应器相容，并且它们也是导电的。
54.以上关于本公开的第一方面所提及的所有定义和术语经必要修改后适用于以下所提及的本公开的另一些方面。
55.在另一个方面中，本发明涉及用于获得本发明的支架的方法，其中所述方法包括：
56.a)制备根据本发明的生物相容性聚合物和合适的溶剂(优选培养基)的溶液，
57.b)将步骤a)的溶液添加到模具中以得到期望的形状和尺寸并冷冻，优选在低于溶液的冷冻温度的温度下冷冻，
58.c)将步骤b)中获得的冷冻支架冻干，
59.d)使步骤c)的经冻干的支架固化，以及
60.e)对支架进行灭菌，优选通过热蒸汽进行灭菌。
61.在用于获得支架的方法的一个优选实施方案中，在步骤a)中，将所选择的生物相容性聚合物优选如以上所提及的天然聚合物以所需浓度溶解在选自由以下组成的列表的溶剂中：水溶液、有机溶剂、培养基、或其任意组合。
62.在另一个优选实施方案中，有机溶剂选自由以下组成的列表：乙醇、二氧六环、丙酮、乙酸、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜、三氟乙酸，或者任何其他溶剂，以任何合适的比率在水溶液中作为纯溶剂或作为助溶剂。
63.在另一个优选实施方案中，培养基是指包含营养物以在所选择的细胞可以生长的条件下支持细胞存活的溶液。合适的培养基的实例选自市售的经典培养基例如dulbecco改良的eagle培养基(dmem，mem)或其任何变体。在这个意义上，技术人员知道什么特定培养基适用于所使用的各细胞类型。
64.在另一个优选实施方案中，本发明的生物相容性聚合物或其任意组合的浓度为0.5％至16％(w/w)，优选地1％至8％，更优选地1.5％至4％，或者作为替代，当最终支架中具有多于一种生物相容性聚合物时为任何可能的相对比率。
65.在另一个优选实施方案中，包含溶剂和生物相容性聚合物的溶液的ph可以为中性的，或者可以为1至14，优选地2至10的ph，以根据所使用的聚合物来提高聚合物的溶解度。为了改善所选择的生物相容性聚合物的溶解度，步骤a)的温度可以从室温升高直到180℃。在一个优选实施方案中，温度为22℃至70℃，更优选地30℃至70℃，还更优选地35℃至65
℃。
66.在另一个优选实施方案中，步骤b)的支架通过经由直接挤出对溶解液进行模塑来形成。
67.在另一个优选实施方案中，步骤b)的冷冻温度为-15℃至-80℃。
68.在另一个优选实施方案中，步骤c)的冻干在如下冷凝器中进行至少16小时至96小时，优选地24小时至72小时，更优选地18小时至24小时的一段时间：温度为25℃至-100℃，优选地25℃至-100℃，更优选地20℃至-50℃，更优选地-15℃至-45℃，以及压力为0.01pa至0.026pa(1毫巴至2.6
×
10-4
毫巴)，更优选地100pa至40pa(1毫巴至0.4毫巴)，更优选地20pa至40pa(0.2毫巴至0.4毫巴)。为了帮助升华，可以将冻干架加热直至20℃。建议样品与冷凝器之间的温差为15℃至20℃。在另一个优选实施方案中，然后将经冻干的支架用适当的交联剂和/或表面包被(coating)处理进行交联，其中该处理用提高细胞黏附和增殖的物质或生物分子进行。冻干过程中所使用的参数例如时间、温度和压力以使支架丧失至少98％的初始水的方式选择。参见图3，其中水的相图示出了冻干发生时的三相点。
69.在另一个优选实施方案中，步骤d)的固化过程优选为在30℃至180℃的温度下进行1分钟至48小时的一段时间的热固化过程。
70.在另一个优选实施方案中，本发明的方法还任选地包括在步骤a)中和/或在步骤c)与步骤d)之间的另外的步骤中，根据如整个本公开中所公开的，添加至少一种添加剂、至少一种黏附分子、至少一种交联剂和/或其任意组合。
71.在另一个优选实施方案中，过多的交联剂和/或表面包被分子被洗掉，并且支架可以立即使用或被冷冻和冻干，再次用于储存。
72.在另一个优选实施方案中，步骤e)的灭菌通过物理灭菌或化学灭菌优选物理灭菌过程来进行，所述物理灭菌过程选自由以下组成的列表：热蒸汽、干热、间歇灭菌、和电离或非电离辐射，优选热蒸汽。在另一个更优选实施方案中，灭菌过程在高压釜中在105kpa(1.05巴)下在至少121℃的温度下通过热蒸汽进行至少20分钟。
73.在另一个方面中，本发明涉及通过以上所公开的方法而获得的支架。
74.此外，一个特别创新的事实是，本发明的支架可以充当用于多种食品补充剂例如纤维、维生素、氨基酸等的载体，并且其适用于灭菌过程而不会失去组织工程支架特性。
75.因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的支架作为载体的体外用途。
76.因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的支架用于体外生产具有高营养成分的组织和/或培养肉产品的用途。
77.在又一个方面中，本发明涉及用于获得具有高营养成分的组织和/或培养肉的方法，其中所述方法包括在合适的营养培养基的存在下，用多个本发明的支架培养多个活的非人贴壁细胞，其中培养在合适的生物反应器中进行，使得初始细胞群可以扩增和生长以形成组织体积和/或培养肉。所得培养物可以生长至期望的水平，并且直接用于形成组织和/或培养肉(例如通过本发明的支架的融合)，而无需分离或以其他方式除去支架。
78.在一个优选实施方案中，以上已经公开了用于获得组织和/或培养肉的合适细胞。细胞通常可以与本文所述的任何可食用且可灭菌的支架一起在悬浮液中培养，包括在生物反应器中。例如，细胞可以与可食用且可灭菌的支架一起接种到培养基中，并且允许接触、黏附和生长在适当的可食用且可灭菌的支架上。在一些变型中，培养包括在可食用、可灭菌
且无动物产品的支架上培养多个肌细胞，其中可食用、可灭菌且无动物产品的支架包含调味剂、增味剂、着色剂、增色剂和营养强化剂。
79.在一些变型中，在生物反应器中孵育适当的时间(例如，12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天等)以使细胞附着和增殖之后，具有培养细胞的本发明的支架可以直接形成到培养肉产品中。在细胞已经在支架上充分分裂和增殖之后，形成其中支架至少部分被细胞覆盖(和/或填充有细胞)的
‘
定殖支架(colonized scaffold)’，并且定殖支架可以被定位并允许融合以形成培养肉产品。在一些变型中，定殖支架被细胞覆盖(例如，覆盖大于50％，覆盖大于60％，覆盖大于70％，覆盖大于80％，覆盖大于90％，覆盖至汇合)。
80.如前所述，所使用的细胞可以为一种或更多种类型，特别包括肌肉细胞。被细胞覆盖至适当程度(例如，》5％、》10％、》20％、》30％、》40％、》50％、》60％、》70％、》80％、》90％等)的支架可以被称为定殖支架。然后，定殖支架可以用于形成聚集体，培养肉由所述聚集体形成。例如，定殖支架的聚集体可以通过将定殖支架彼此紧邻放置来形成。例如，定殖支架可以彼此接触放置，使得相邻(紧邻)定殖支架上的细胞可以彼此接触并融合以形成具有高营养成分的组织体积和/或培养肉。
81.在工程肉形成之后，其必须保持无菌(没有细菌或其他污染)，而无需使用抗生素、药物等，因为这样的工程肉可能影响下面的最终肉产品。例如，具有高营养成分的组织体积和/或培养肉可以在工程肉形成之后冷冻。
82.在另一个方面中，本发明公开了通过以上所公开的方法而获得的培养肉产品。
83.在本发明的另一个方面中，其涉及组织工程培养肉，所述组织工程培养肉包含多个根据本发明的支架和多个活的非人细胞，优选肌肉细胞，并且任选地还包含多个卫星细胞、基质细胞、成肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、或其任意组合。
84.通常，这些培养的肉产品可以包括具有由多个定殖支架形成的体积的可食用主体，其中各定殖支架包括根据本发明的可食用且可灭菌的支架，此外其中定殖支架至少部分地彼此融合。如所提及的，这些可食用支架可以包含添加剂、生物相容性分子、交联剂、及其任意组合。在一个优选实施方案中，培养肉还包含选自由以下组成的组中的至少一种添加剂：调味剂、增味剂、着色剂、增色剂、营养强化剂、或其任意组合。
85.在一些实施方案中，培养肉产品是新鲜的。在另一些实施方案中，培养肉产品被保存。在另一些实施方案中，通过例如烹饪、干燥、烟熏、罐装、腌制、盐腌或冷冻来保存肉。
86.在一些实施方案中，培养肉产品基本上不含病原微生物。在另一些实施方案中，细胞制备、细胞培养、支架制备和培养肉制备的受控且基本无菌的方法产生基本不含病原微生物的产品。在另一些实施方案中，这样的产品的另外的优点是增加了实用性和安全性。
87.因此，即使通过本文所述方法形成的大量培养肉，也可能具有血管或不具有血管。此外，本文所述的培养肉可以具有或可以缺乏任何神经组分(例如，轴突、树突、神经细胞体)，因为它们可以在具有或不具有这样的组分的情况下生长。
88.本文所公开的培养肉产品是可食用的，并且预期用于人、非人动物、或二者消费。在一些实施方案中，培养肉产品为人食物产品。在另一些实施方案中，培养肉产品为动物饲料，例如牲畜用饲料、水产养殖用饲料或家养宠物用饲料。因此，根据本文所提供的公开内
容，本领域技术人员将认识到，来自过多的来源的非人细胞适用于在生产这样的产品和本文所公开的方法中使用。在多个实施方案中，通过非限制性实例的方式，支架和培养肉产品包含源自哺乳动物、禽类、爬行动物、鱼、甲壳类动物、头足类动物、昆虫类、非节肢无脊椎动物、及其组合的非人细胞。
89.在本文中，术语“包含/包括”及其派生词(例如“包含/包括”等)不应以排他性的含义理解，即，这些术语不应被解释为排除所描述和限定的内容可以包括另外的要素、步骤等的可能性。
90.另一方面，本发明显然不限于本文所述的一些具体实施方案，而是还涵盖可以由本领域技术人员考虑的在如权利要求中所限定的本发明的一般范围内的任何变化(例如，关于材料、尺寸、组分、配置等的选择)。
附图说明
91.为了完成描述并且为了对本发明提供更好的理解，提供了一组附图。所述附图形成说明书的组成部分，并且举例说明了本发明的实施方案，其不应被解释为限制本发明的范围，而仅仅作为本发明可以如何实施的实例。附图包括以下图：
92.图1.通过模塑形成的不同长度和直径的圆柱形支架。分别对应于实施例1、2和3的支架a)、b)和c)。
93.图2.挤出到冷冻表面的示意性描述。入口示出了可以通过该方法生产的最终丸料。
94.图3.表示三相点的水相图；其中冻干过程将在该三相点以下进行。
95.图4.实施例1(4a)、实施例2(4b)和实施例3(4c)的多孔支架在细胞接种之前的扫描电子显微术(sem)图像。利用实施例1(4d)、实施例2(4e)和实施例3(4f)的支架进行的组织增殖。
96.图5.实施例1中所公开的支架在灭菌过程之前(a)和之后(b)的汞(hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
97.图6.实施例2中所公开的支架在灭菌过程之前(a)和之后(b)的汞(hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
98.图7.实施例3中所公开的支架在灭菌过程之前(a)和之后(b)的汞(hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
99.图8.ftir(傅里叶变换红外光谱)。分别对应于来自实施例1(8a)、实施例2(8b)和实施例3(8c)的支架的样品在灭菌程序之前(顶线)和之后(底线)的光谱。
100.图9.该图示出了与初始葡萄糖(图例中的初始)和在不存在本发明的支架的情况下的培养对照(图例中的对照)相比，被接种在本发明的实施例1至3中获得的支架中的哺乳动物细胞在不同测定时间(以天数表示)下的葡萄糖消耗(以g/l表示)(图例中的实施例1、实施例2和实施例3)。
实施例
101.以下是本发明的通过由本发明人进行的测定的实施例，这些实施例证明了本发明的产品的有效性。以下实施例用于举例说明本发明，并且不得被认为是限制其范围。
102.实施例1.本发明的包含壳聚糖作为生物相容性聚合物的支架的合成
103.在将对其他生物相容性聚合物及其混合物同样有效的可食用且可灭菌的大孔3d支架的典型生产方法中，将市售mem eagle(极限必需培养基eagle，minimum essential medium eagle)w/earle的bss w/非必需氨基酸和l-谷氨酰胺，呈粉末的w/o钙(在0mg至600mg的范围内以实现相对于壳聚糖重量的0％至200％，更优选为75mg以实现相对于壳聚糖重量的10％)溶解在乙酸(0.1m，50ml)中，并在搅拌的同时缓慢添加壳聚糖(750mg，1.5％)，将混合物搅拌直到获得均匀的溶液(65℃，2小时)，并将溶液倒入模具中以得到期望的形状和尺寸。将所有样品在-20℃下冷冻24小时，并在0.263毫巴的压力下在-40℃下冻干持续72小时的时间。
104.这是用于制造具有受控形状的支架的方法，所述受控形状将由进行该过程的容器确定。
105.将支架从模具中取出，并在不通风的情况下放入135℃的烘箱中持续1小时(通过将烘箱预热至45℃开始固化，烘箱一达到135℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)。在该阶段，将支架用miliq水(3
×
100ml持续15分钟)、0.1m nahco3(3
×
100ml持续15分钟)和水(3
×
100ml持续15分钟)洗涤。
106.结果表明，在将本发明的包含mem粉末(0％)的支架浸入水中时，所述支架失去其一致性。因此，看起来交联温度和时间不足以获得具有期望的关于机械强度和外观的特性的支架。然而，结果表明，剩余的包含不同mem浓度(1％、8％、16％、33％、133％、200％，更优选8％)的支架显示出良好的一致性，并且未失去它们的形状。这些数据表明，mem的组分也充当着给予原本易碎的支架一致性的交联剂。
107.之后，将具有8％ mem浓度的支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟并进行测试。支架是稳定的，并且已发生一定程度的交联，因为支架没有过度溶胀，这就是交联减少了溶胀。
108.这些具有一定重量/体积百分比(1.5％)的壳聚糖聚合物的本发明的支架的大孔隙度可以控制，并且显示出高孔体积和90％的总孔隙度，从而产生泡沫状样品。如通过数字成像(图1a)和sem(图4a)可以观察到，优化的支架表现出高体积和1μm至500μm的尺寸的互连大孔隙度。
109.在图5中，示出了本实施例中获得的支架的hg(汞)侵入孔隙度分析。使用该技术来分析固体和粉末材料的总的连接孔隙度、孔体积、孔尺寸分布和表面积。被称为孔隙度计的仪器使用加压室来迫使汞侵入多孔基底的空隙中。随着施加压力，汞首先填充较大的孔。随着压力增加，填充进行至越来越小的孔。颗粒间孔(单个颗粒之间)和颗粒内孔(颗粒自身内部)二者均可以使用该技术来表征。侵入样品中的汞的体积通过被称为透度计的金属包层毛细管分析单元中的电容变化来监测。样品被保持在透度计单元的一部分中，所述透度计单元可以不同的体积用于容纳粉末或完整的固体块。样品尺寸被限制为约2.5cm长乘以1.5cm宽的尺寸。使用该强有力的技术来分析在对所述块进行灭菌之前(图5a)和之后(图5b)关于支架的多孔特性的变化。如在图5中可以看出，结果表明，总孔体积和总表面积由于来自灭菌步骤的收缩而略微降低。尽管如此，灭菌之后的值更加非常适用于显示出合适的孔体积范围和可用于细胞定殖的高表面积的应用。
110.为了证明在热蒸汽灭菌程序期间已经发生了可能损害支架对细胞培养的适用性
的非化学修饰，已经通过ftir(傅里叶变换红外光谱)分析了灭菌之前和之后的支架。ftir是用于鉴定有机(以及在某些情况下无机)材料的分析技术。该技术测量了样品材料相对于波长对红外辐射的吸收。红外吸收带确定了分子组分和结构。如在图8a中可以看出，在灭菌过程之前和之后，谱带的形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
111.实施例2.包含藻酸盐作为生物相容性聚合物并且包被有聚-ε-赖氨酸的本发明的支架的合成。
112.在剧烈搅拌下，将浓度为2.0g的海藻酸钠盐(sigma-aldrich)缓慢添加至水(200ml)中。将混合物在50℃下搅拌3小时，直到获得均匀、透明且澄清的溶液。将溶液静置以达到室温。
113.之后，将溶液倒入模具中以得到期望的形状和尺寸。将所有样品在-20℃下冷冻24小时，并在0.263毫巴的压力下在-40℃下冻干72小时。
114.将获得的经冻干的支架从模具中取出，并在氯化钙在miliq水(200ml)中的2％水溶液(4g，200ml)(可以使用任何其他水溶液，例如硫酸钙、碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙)中浸没15分钟以引发聚合物的交联。在该溶液中，藻酸盐支架立即凝胶化，并用miliq水充分洗涤以除去未结合的钙离子。然后将支架在0.2％聚-ε-赖氨酸溶液(在500ml中1.0g)中浸没16小时，然后用miliq水充分洗涤。将支架再次在-20℃下冷冻24小时，并在0.263毫巴的压力和-40℃下冻干72小时，之后，储存直到使用。
115.之后在不通风的情况下将经冻干的支架在115℃的烘箱中加热1小时(通过将烘箱预热至45℃开始固化，烘箱一达到115℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)。
116.之后，将支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟。
117.如通过数字成像(图1b)和sem(图4b)可以观察到的，优化的支架显示出高体积和1μm至500μm的尺寸的互连大孔隙度。
118.如图6中所示，在对所述块进行灭菌之前(图6a)和之后(图6b)，hg(汞)侵入孔隙度分析表明，总孔体积和总表面积略微降低。尽管如此，灭菌之后的值仍非常适用于显示出合适的孔体积范围和可用于细胞定殖的高表面积的应用。
119.如在图8b中可以看出，在灭菌过程之前和之后，谱带的形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
120.实施例3.包含壳聚糖作为生物相容性聚合物并且包被有聚-ε-赖氨酸的本发明的支架的合成
121.在40℃下在轻轻搅拌下，将食品级壳聚糖(9.0g)与乙酸(0.1m，600ml)混合，直到壳聚糖被溶解。在剧烈搅拌下，将聚-ε-l-赖氨酸(360mg粉末，mw：1000至300000)分批添加至先前的溶液中，并将混合物温热至65℃持续2小时30分钟，以获得均匀且澄清的溶液。
122.将先前的溶液静置以达到室温，并将其倒入模具中以得到期望的形状和尺寸的支架(图1c)。将模具内的溶液在-20℃下冷冻24小时，并在0.263毫巴的压力和-40℃下冻干72小时。
123.将支架从模具中取出，并将其用无水乙醇(2升)凝胶化4小时。将支架用高纯水洗涤，并将支架在naoh溶液(1％)中浸没3小时。将支架用高纯水充分洗涤，直到浸提液达到中性ph(6.5至7.5)。将如此形成的支架在-20℃下冷冻24小时并冻干(72小时，-40℃以及p＝
0.263毫巴)。直接使用支架而无需任何进一步处理，或者作为替代可以使其固化。通过在不通风的情况下将经固化的支架引入110℃的烘箱中1小时，使其经受热处理(通过将烘箱预热至45℃开始固化，烘箱一达到110℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)。之后，将支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟。如通过数字成像(图1c)和sem(图4c)可以观察到的，优化的支架显示出高体积和1μm至500μm的尺寸的互连大孔隙度。
124.如图7中所示，在对所述块进行灭菌之前(图7a)和之后(图7b)，hg(汞)侵入孔隙度分析表明，总孔体积和总表面积略微降低。尽管如此，灭菌之后的值仍非常适用于显示出合适的孔体积范围和可用于细胞定殖的高表面积的应用。
125.如在图8c中可以看出，在灭菌过程之前和之后，谱带的形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
126.实施例4.在生物反应器中用非人细胞培养本发明的实施例1至3的支架。
127.为了验证通过本发明的方法获得的基于壳聚糖的支架(实施例1和3)和基于藻酸盐的支架(实施例2)可用于获得培养肉，本发明人在生物反应器中通过本发明所提及的支架培养活细胞。
128.为此，将实施例1、2和3的支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟，之后无菌浸入最终体积为2升的培养基(gibco
tm
optipro
tm
)中。接着，将已知细胞密度(13.000个细胞/cm2)接种到所提及的支架中，并在48小时灌注生物反应器中长时间段(10天或更长)保持培养。接种的细胞为从肌肉活检中获得的并且按照jm spinazzola等人的bio protoc.2017年11月5日；7(21)中描述的方案提取的专有提取物的原代猪成肌细胞。用于适当的细胞增殖的培养条件需要保持37℃的温度和7.1至7.4的ph值。此外，保持气体的连续供应，使得溶解的氧的浓度在20％至30％的范围内。在10天的时段之后，将支架从生物反应器中取出并用乙醇脱水以进行sem(扫描电子显微术)可视化。sem图像(图4d、4e和4f)分别示出了利用实施例1、实施例2和实施例3的支架的完全组织增殖。
129.在10天的孵育时段期间，用带有葡萄糖生物传感器的生物分布图分析仪测量葡萄糖消耗。葡萄糖生物传感器为在其膜中具有固定化酶的电流式电极。在氧气和被测量的基底的存在下，这些酶膜产生过氧化氢(h2o2)，然后其在保持恒定电位下的铂阳极上被氧化。由此产生的电子流和电流变化与样品葡萄糖浓度成比例。在不同的测定时间下进行测量，作为利用本发明的支架进行的组织的增殖和形成的间接测量。所获得的数据示于图9中。结果表明，被接种在本发明的基质中的原代猪成肌细胞随着时间(1至10个测定日)存在葡萄糖消耗，因为与培养基的初始葡萄糖水平(约4g/l)相比，观察到葡萄糖浓度值降低。在各测定日进行了阳性对照。
130.因此，结果表明，本发明的支架可用于细胞培养并且可用于获得具有营养成分的体外组织和/或培养肉。