补肾益精丸指纹图谱检测方法、对照指纹图谱和应用与流程

1.本发明属于中药分析领域，涉及一种检测补肾益精丸指纹图谱的液相色谱方法、包含该方法的建立对照指纹图谱的方法、补肾益精丸对照指纹图谱和应用。


背景技术：

2.补肾益精丸主要成份为菟丝子(酒制)、女贞子、覆盆子、熟地黄、桑椹(黑)、肉苁蓉(酒制)、五味子(醋制)、墨旱莲，具有滋肾填精，补髓养血的功效，用于肾精不足，头晕目眩，腰膝酸软，遗精梦泄。
3.补肾益精丸的质量控制研究目前未见其指纹图谱研究报道。


技术实现要素：

4.因此本研究建立了补肾益精丸uplc指纹图谱同时结合相似度评价进行分析，可为补肾益精丸质量控制提供参考。
5.本发明一方面提供了一种检测补肾益精丸指纹图谱的液相色谱方法，所述方法采用配备有二极管阵列检测器(dad)的超高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：
6.色谱柱：waters acquity uplc hss t3，2.1mm
×
100mm，1.8μm，welch ultimate uplc xb-c
18
，2.1mm
×
150mm，1.8μm，或welch ultimate uplc aq-c
18
，2.1mm
×
150mm，1.8μm，优选welch ultimate uplc aq-c
18
，2.1mm
×
150mm，1.8μm，
7.柱温：30℃
8.流速：0.25ml/min-0.35ml/min，优选0.30ml/min
9.检测波长：325nm
10.进样量：1-3μl，优选2μl
11.流动相：甲醇(a)-0.1％甲酸水溶液(b)
12.梯度洗脱条件：0-6min，5
±
1％a～39
±
1％a；6-8min，39
±
1％a～40
±
1％a；8-12min，40
±
1％a；12-14min，40
±
1％a～41
±
1％a；14-14.5min，40
±
1％a～95
±
1％a；14.5-16.5min，95
±
1％a；16.5-17min，95
±
1％a～5
±
1％a，17-19min，5
±
1％a。
13.本发明中，流动相和梯度洗脱中的百分数为体积百分数，例如，0.1％指的是0.1体积％。
14.在检测补肾益精丸指纹图谱的液相色谱方法中，用于进行检测的补肾益精丸供试品溶液可以如下配制：取补肾益精丸以10倍的液固比(体积/质量，ml/g)用50％甲醇水溶液提取。提取方式可以为超声处理、回流提取等，优选为超声提取。提取时间可以为15分钟以上，例如15至60分钟，优选为30至45分钟。
15.特别地，补肾益精丸供试品溶液可以如下配制：取补肾益精丸内容物约1.0g，精密称定，精密移入50％甲醇水溶液10ml，称定质量，超声处理30min，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，10000r
·
min-1
离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得补肾益精丸供试品溶液。
16.本发明中，梯度洗脱条件中，数字
±
1％a表示流动相a的量可以在(数字 1)％至(数字-1)％范围内，例如，5
±
1％a表示流动相a可在4％至6％范围内，例如为4％、5％或6％，相应地，此时流动相b的量可在96％至94％范围内，例如为96％、95％或94％。
17.在一些实施方式中，梯度洗脱条件可为：0-6min，5％a～39％a；6-8min，39％a～40％a；8-12min，40％a；12-14min，40％a～41％a；14-14.5min，40％a～95％a；14.5-16.5min，95％a；16.5-17min，95％a～5％a，17-19min，5％a。
18.本发明另一方面提供了一种建立补肾益精丸对照指纹图谱的方法，所述方法包括：
19.(1)供试品溶液配制：
20.取补肾益精丸内容物约1.0g，精密称定，精密移入50％甲醇水溶液10ml，称定质量，超声处理30min，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，10000r
·
min-1
离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
21.(2)对照品溶液配制：
22.精密称定没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、金丝桃苷、芦丁对照品对照品，用50％甲醇水溶液配制成浓度依次为79.25μg
·
ml-1
、78.00μg
·
ml-1
、35.40μg
·
ml-1
、40.00μg
·
ml-1
、17.70μg
·
ml-1
、60.50μg
·
ml-1
、53.60μg
·
ml-1
、63.50μg
·
ml-1
、10.20μg
·
ml-1
的混合对照品溶液；
23.(3)uplc检测：
24.分别精密吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2μl，用根据本发明的检测补肾益精丸指纹图谱的液相色谱方法检测得到供试品色谱图和对照品色谱图；
25.(4)生成标准指纹图谱：
26.基于n批供试品的指纹色谱图中的共有峰生成对照指纹图谱，其中，选择补肾益精丸中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰，确定14个共有峰，所述n≥10，优选n＝10；
27.(7)共有峰的鉴定及归属：
28.对补肾益精丸指纹图谱中的共有峰进行归属及鉴定。
29.在上述方法中，共有峰的鉴定及归属可以通过与对照品溶液的色谱图的比对完成。
30.在一个实施方式中，上述步骤(2)中，所述对照品溶液通过以下方法配制：用十万分之一分析天平精密称定没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、金丝桃苷、芦丁对照品31.70mg、15.60mg、35.40mg、10.00mg、35.40mg、12.10mg、13.40mg、12.70mg、10.20mg，用50％甲醇水溶液溶解制备成3.170mg
·
ml-1
、1.560mg
·
ml-1
、3.540mg
·
ml-1
、1.000mg
·
ml-1
、3.540mg
·
ml-1
、1.210mg
·
ml-1
、1.340mg
·
ml-1
、1.270mg
·
ml-1
、1.020mg
·
ml-1
的储备液，分别精密依次量取各对照品储备液2.5ml、5ml、1ml、4ml、0.5ml、5ml、4ml、5ml、1ml，置于100ml量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释得没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、金丝桃苷、芦丁混合对照品溶液，其浓度依次为79.25μg
·
ml-1
、78.00μg
·
ml-1
、35.40μg
·
ml-1
、40.00μg
·
ml-1
、17.70μg
·
ml-1
、60.50μg
·
ml-1
、53.60μg
·
ml-1
、63.50μg
·
ml-1
、10.20μg
·
ml-1
。
31.本发明另一方面提供了一种补肾益精丸对照指纹图谱，其大体如图4-1所示，包括
14个特征峰。
32.本发明采用超高效液相色谱法，整体分析时间为14min。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)软件”分析数据，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，进行多点校正，选择出峰稳定、分离度良好的色谱峰为共有峰，共标定了14个共有峰，结合相似度评价得出补肾益精丸各批次与对照图谱之间的相似度均大于0.90，表明其相似度良好，并进一步建立补肾益精丸指纹图谱。经与对照品比对，共鉴定出9个成分，其中1号峰(没食子酸，3.48min)，2号峰(原儿茶酸，5.04min)，3号峰(新绿原酸，5.27min)，5号峰(绿原酸，6.52min)，6号峰(隐绿原酸，6.83min)，8号峰(松果菊苷，7.71min)，10号峰(毛蕊花糖苷，9.46min)，13号峰(金丝桃苷，11.563min)，14号峰(芦丁，11.84min)，为其指纹图谱质控提供依据。
33.在实施方式中，上述补肾益精丸对照指纹图谱采用根据本发明的建立补肾益精丸对照指纹图谱的方法得到。
34.另一方面，本发明提供了一种补肾益精丸的质量控制方法，该方法包括以下步骤：
35.(1)供试品溶液配制：
36.取补肾益精丸内容物约1.0g，精密称定，精密移入50％甲醇水溶液10ml，称定质量，超声处理30min，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，10000r
·
min-1
离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
37.(2)色谱条件：
38.采用根据本发明的检测补肾益精丸指纹图谱的液相色谱方法中所述的色谱条件；
39.(3)测定：
40.精密吸取上述(1)溶液2μl，注入液相色谱仪，测定，得到待检补肾益精丸样品的指纹图谱；
41.(4)合格判定：
42.计算待检补肾益精丸样品的指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似度，相似度大于等于0.8即为合格产品。
43.所述相似度可以通过将待检补肾益精丸样品的指纹图谱和补肾益精丸对照指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行比较，来计算样品指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似度，相似度大于等于0.8，优选大于0.9即为合格产品，否则即为不合格产品。
44.如实验结果所证实的，根据本发明的检测补肾益精丸指纹图谱的方法，所得到的色谱图中，峰数量较多，灵敏高，基线平稳、噪音小，响应敏锐，响应值大，分离度好。此外，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。方法的精密度、稳定性和重现性良好。
45.在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
46.除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施
方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.1％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.01％的变化。
47.本发明可以通过许多不同形式的实施方式来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施方式。在不偏离本发明的技术思想和技术实质的范围的情况下可以对本发明的技术方案进行各种各样的修改、变化或替换，这些经修改、变化或替换的技术方案仍然包括在本发明的范围内。
48.将理解的是，说明书和权利要求书中使用的词或术语不应解释为常用词典中定义的含义。将进一步理解的是，基于发明人可以适当地定义词语或术语的含义以最好地解释本发明的原则，这些词语或术语应当被解释为具有与其在相关领域的语境中和本发明的技术思想中的含义一致的含义。
附图说明
49.图1为显示补肾益精丸uplc指纹图谱精密度考察结果的图。
50.图2为显示补肾益精丸uplc指纹图谱重复性考察结果的图。
51.图3为显示补肾益精丸uplc指纹图谱稳定性考察结果的图。
52.图4-1为补肾益精丸对照指纹图谱；以及图4-2为10批补肾益精丸对照指纹图谱及指纹图谱。
53.图5为补肾益精丸对照指纹图谱(r)及混标色谱图(std)。
54.图6为补肾益精丸样品在不同浓度溶剂提取下色谱图。
55.图7为补肾益精丸样品不同流动相体系色谱图。
56.图8为补肾益精丸色谱条件1测定方法色谱图。
57.图9为补肾益精丸色谱条件2测定方法色谱图。
58.图10为补肾益精丸色谱条件3测定方法色谱图。
59.图11为补肾益精丸色谱条件4测定方法色谱图。
60.图12为补肾益精丸色谱条件5测定方法色谱图。
61.图13为补肾益精丸色谱条件6测定方法色谱图。
62.图14为补肾益精丸色谱条件7测定方法色谱图。
63.图15为补肾益精丸色谱条件8测定方法色谱图。
64.图16为补肾益精丸色谱条件9测定方法色谱图。
65.图17为补肾益精丸色谱条件10测定方法色谱图。
66.图18为不同色谱柱对补肾益精丸样品分离效果图。
67.图19为补肾益精丸样品在不同进样量下色谱图。
68.图20为补肾益精丸样品在不同流速下色谱图。
69.图21为补肾益精丸样品在不同梯度下色谱图。
70.图22为补肾益精丸样品在不同梯度柱温下色谱图。
71.图23为补肾益精丸样品在不同波长下色谱图。
具体实施方式
72.以下结合技术方案和附图详细说明本发明，但本发明不限于此。
73.1仪器与试药
74.1.1仪器：
75.表1仪器信息1.2试剂
[0076][0077]
表2试剂
[0078][0079]
1.3试药
[0080]
1.3.1样品
[0081]
补肾益精丸(s1～s10)，批号分别为191001、200602、200603、210101、181001、190401、200401、211101、220201、200601。厦门中药厂有限公司提供。
[0082]
1.3.2对照品
[0083]
表3对照品信息
[0084][0085]
2方法与结果
[0086]
2.1色谱条件
[0087]
除非另有说明，否则下面的试验中的色谱条件如下。
[0088]
色谱柱：welch ultimate uplc xb-c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)。流动相：甲醇(a)-0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱(0-6min，5％a～39％a；6-8min，39％a～40％a；8-12min，40％a；12-14min，40％a～41％a)，流速0.30ml
·
min-1
，柱温30℃，进样量2μl。
[0089]
2.2溶液的制备
[0090]
2.2.1供试品溶液的制备
[0091]
分别将10批补肾益精丸研磨成细粉，各取约1.0g，精密称定，置具塞瓶中，精密移入50％甲醇水溶液10ml，密塞，称定质量，超声(250w，40khz)处理30min，放冷，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，10000r
·
min-1
离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得10批补肾益精丸供试品溶液。
[0092]
2.2.2对照品溶液的制备
[0093]
用十万分之一分析天平精密称定没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、金丝桃苷、芦丁对照品对照品31.70mg、15.60mg、35.40mg、10.00mg、35.40mg、12.10mg、13.40mg、12.70mg、10.20mg，用50％甲醇水溶液溶解制备成3.170mg
·
ml-1
、1.560mg
·
ml-1
、3.540mg
·
ml-1
、1.000mg
·
ml-1
、3.540mg
·
ml-1
、1.210mg
·
ml-1
、1.340mg
·
ml-1
、1.270mg
·
ml-1
、1.020mg
·
ml-1
的储备液，分别精密依次量取各对照品储备液2.5ml、5ml、1ml、4ml、0.5ml、5ml、4ml、5ml、1ml，置于100ml量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释得没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷、金丝桃苷、芦丁混合对照品溶液，其浓度依次为79.25μg
·
ml-1
、78.00μg
·
ml-1
、35.40μg
·
ml-1
、40.00μg
·
ml-1
、17.70μg
·
ml-1
、60.50μg
·
ml-1
、53.60μg
·
ml-1
、63.50μg
·
ml-1
、10.20μg
·
ml-1
。
[0094]
2.3方法学考察
[0095]
2.3.1精密度试验
[0096]
精密吸取s1批次的补肾益精丸供试品溶液各2μl，按上述色谱条件连续进样测定6次，分别记为c1-c6。由于8号峰的单峰面积占总峰面积比例大，保留时间处于谱图的中间位
置，响应度高，分离度好，故选择8号峰作为参照峰。计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd，见图1，表4，表5，表明方法精密度良好。
[0097]
表4补肾益精丸指纹图谱方法精密度考察(相对保留时间)
[0098][0099]
表5补肾益精丸指纹图谱方法精密度考察(相对峰面积)
[0100][0101][0102]
2.3.2重复性试验
[0103]
取s1批次样品研磨成细粉，精密称取6份，制备供试品溶液6份，分别进样分析，分别记为c1-c6。以8号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd，见图2，表6，表7，表明各成分的重复性良好。
[0104]
表6补肾益精丸指纹图谱方法重复性考察(相对保留时间)
[0105][0106]
表7补肾益精丸指纹图谱方法重复性考察(相对峰面积)
[0107][0108]
[0109]
2.3.3稳定性试验
[0110]
精密吸取s1批次的补肾益精丸供试品溶液各2μl，分别在0，2，4，8，12，24h进样测定，分别记为c1-c6。以8号峰为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd，见图3，表8，表9，表明供试品溶液在24h内稳定。
[0111]
表8补肾益精丸指纹图谱方法稳定性考察(相对保留时间)
[0112][0113][0114]
表9补肾益精丸指纹图谱方法稳定性考察(相对峰面积)
[0115][0116]
2.4指纹图谱的建立
[0117]
2.4.1共有峰的标定
[0118]
分别精密吸取各批次补肾益精丸供试品溶液各2μl，分别进样分析，得到各批次补肾益精丸的色谱图，见图4-2中的s1-s10。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)软件”分析数据，将各批次的色谱图aia文件导入该软件，设定s1为参照图谱，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，进行多点校正，选择出峰稳定、分离度良好的色谱峰为共有峰，共标定14个共有峰，并在此基础上计算共有峰相对峰面积，见表10。
[0119]
表10 10批补肾益精丸共有峰相对峰面积
[0120][0121]
2.4.2相似度评价
[0122]
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)软件”分析数据，以s1为参照图谱，导入s2～s10图谱并与s1多点校正，生成补肾益精丸uplc对照指纹图谱r，计算得到供试品与r的相似度，进行相似度评价，得出补肾益精丸各批次与r之间的相似度均大于0.90，表明相似度良好。见表11。
[0123]
表11 10批补肾益精丸相似度
[0124][0125][0126]
2.4.3特征峰鉴定
[0127]
为指认补肾益精丸中含有的成分，按照2.2.2配置混合对照品溶液进行指认，共指
认9个色谱峰，如图5所示，其中1号峰(没食子酸，3.48min)，2号峰(原儿茶酸，5.04min)，3号峰(新绿原酸，5.27min)，5号峰(绿原酸，6.52min)，6号峰(隐绿原酸，6.83min)，8号峰(松果菊苷，7.71min)，10号峰(毛蕊花糖苷，9.46min)，13号峰(金丝桃苷，11.563min)，14号峰(芦丁，11.84min)。
[0128]
3方法优化
[0129]
3.1.提取溶剂的考察
[0130]
除了更换提取溶剂以外，按照2.2.1的方法制备供试品溶液，按照2.1的色谱条件进行检测。比较了10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液和90％甲醇水溶液作为提取溶剂的超声提取效率。不同溶剂提取的补肾益精丸样品中各色谱峰峰型基本一致，以50％甲醇水溶液提取的各个主要色谱峰峰面积最大，结果见表12和图6，因此，选择50％甲醇水溶液作为补肾益精丸提取溶剂。
[0131]
表12提取溶剂考察(峰面积(mau
·
s)/称样量(g))
[0132][0133]
3.2.色谱条件的考察
[0134]
3.2.1流动相的考察
[0135]
采用不同流动相洗脱系统(甲醇-水溶液，乙腈-水溶液，甲醇-0.1％甲酸水溶液，乙腈-0.1％甲酸水溶液)考察洗脱效果。根据供试品溶液的出峰较多，色谱峰达到较好的分离，基线稳定等指标，通过比较优选，优化后最终确定了甲醇-0.1％甲酸水溶液流动相系统，如图7。
[0136]
3.2.2色谱条件的建立
[0137]
3.2.2.1色谱条件的优化
[0138]
(1)色谱条件1：乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-0.5min，5％a；0.5-3min，5％a；3-5min，5％a～13％a；5-9min，13％a；5-25min，13％a～25％a；25-27min，25％a～30％a；27-32min，30％a～35％a；32-37min，35％a～57％a；37-39min，57％a～70％a；39-46min，70％a～85％a；46-46.5min，85％a～5％a；46.1-54min，5％a)，流速0.30ml
·
min-1
，柱温30℃，进样量5μl。如图8。
[0139]
(2)色谱条件2：乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0-0.5min，5％a；0.5-3min，5％a；3-4min，5％a～13％a；4-6min，13％a；6-26min，13％a～25％a；26-27min，25％a～30％a；27-32min，30％a～33％a；32-35min，33％a～57％a；35-37min，57％a
uplc xb-c
18
(2.1mm
×
150mm，1.8μm)，welch ultimate uplc xb-c
18
(4.6mm
×
150mm，2.7μm)，agilent infinitylab poroshell 120ec-c
18
(2.1mm
×
150mm，1.9μm)，waters acquity uplc hss t3(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，waters uplc cortecs(2.1mm
×
100mm，1.6μm)6种不同型号、品牌的色谱柱，经比对，发现waters acquity uplc hss t3(2.1mm
×
100mm，1.8μm)，welch ultimate uplc xb-c
18
(2.1mm
×
150mm，1.8μm)和welch ultimate uplc aq-c
18
(2.1mm
×
150mm，1.8μm)分离效果较好，基线平稳，再经过比较优选，选择welch ultimate uplc xb-c
18
(2.1mm
×
150mm，1.8μm)用于补肾益精丸的指纹图谱建立。如图18。
[0151]
3.2.2.3进样量的考察
[0152]
在建立的色谱梯度条件下考察了3种进样量(1μl、2μl、3μl)对分离性能的影响，进样量为1μl、2μl、3μl，进样量1-3μl均可满足，耐用性良好，其中2μl最佳，结果见图19。
[0153]
3.2.2.4流速的考察
[0154]
将三种不同流速(0.25ml/min、0.30ml/min、0.35ml/min)与对应的柱体积进行换算，在优化的梯度条件下分析流速对分离性能的影响，结果表明，流速在0.25ml/min～0.35ml/min范围内的变动均可满足分离要求，耐用性良好，其中0.3ml/min最佳，见图20。
[0155]
3.2.2.5梯度变动的考察
[0156]
考察流动相中甲醇比例
±
1范围内的变动对分离度的影响，其中，
[0157]
甲醇比例 1(简写为甲醇 1)指的是梯度洗脱条件为：0-6min，6％a～40％a；6-8min，40％a～41％a；8-12min，41％a；12-14min，41％a～42％a；14-14.5min，41％a～96％a；14.5-16.5min，96％a；16.5-17min，96％a～6％a，17-19min，6％a；
[0158]
正常甲醇比例(简写为甲醇0)指的是梯度洗脱条件为：0-6min，5％a～39％a；6-8min，39％a～40％a；8-12min，40％a；12-14min，40％a～41％a；14-14.5min，40％a～95％a；14.5-16.5min，95％a；16.5-17min，95％a～5％a，17-19min，5％a；
[0159]
甲醇比例-1(简写为甲醇-1)指的是梯度洗脱条件为：0-6min，4％a～38％a；6-8min，38％a～39％a；8-12min，39％a；12-14min，39％a～40％a；14-14.5min，39％a～94％a；14.5-16.5min，94％a；16.5-17min，94％a～4％a，17-19min，4％a；
[0160]
发现不管甲醇比例在
±
1的条件下， 1、-1和0均符合要求，其中变化0最佳，方法耐用性良好，结果见图21。
[0161]
3.2.2.6色谱柱柱温考察
[0162]
在建立的梯度条件下考察了不同色谱柱柱温(25℃、30℃、35℃)对分离性能的影响。温度对补肾益精丸分离性能的影响，柱温可以控制在25℃～35℃均可满足要求，温度30℃最佳。补肾益精丸样品在不同色谱柱柱温下的色谱图如图22所示。
[0163]
3.2.2.7最大吸收波长的考察
[0164]
在紫外光谱190～400nm下扫描共有峰的最大吸收波长(λ
max
)，结果显示325nm下化学成分较为丰富，峰容量大，245nm波长成分最为丰富，但是基线不稳定，特征性不强，因此选择325nm为检测波长，见图23。
[0165]
4结论
[0166]
补肾益精丸的质量控制目前未见其指纹图谱研究报道，因此本研究建立了补肾益精丸uplc指纹图谱同时结合相似度评价进行分析，可为补肾益精丸质量控制提供参考。