ITGA6阳性iPSC源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法与流程

itga6阳性ipsc源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法
技术领域
1.本发明属于细胞治疗技术领域，具体涉及itga6阳性ipsc源小梁网类细胞在制备治疗高眼压疾病药物中的应用及筛选方法。


背景技术：

2.青光眼是由视网膜神经节细胞的凋亡导致视觉损失的一类眼科疾病，是仅次于白内障的第二位的致盲性眼病。2010年全球青光眼患者约为6050万。其中，约840万患者失明。综合我国流行病学分析，40岁以上的中国青光眼患者多达940万人，其中，单眼失明的患者占55％，双眼失明的患者占18.1％，给我国社会及患者家庭带来巨大的经济负担。
3.青光眼主要分为原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,poag)和原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,pacg)。全球流行病学统计数据表明原发性开角型青光眼为青光眼的主要类型。
4.小梁网(trabecular meshwork,tm)的生理作用是通过调节房水(aqueous humor,ah)流出来维持正常的眼内压。随着年龄的增长，驻留在tm内的细胞数量显著减少，导致ah外流减少，眼压(intraocular pressure,iop)升高，最终导致细胞应激、功能障碍和视网膜神经节细胞死亡，从而丧失视力。这也正是原发性开角型青光眼重要的致病因素之一。
5.降低眼压通常会有效减缓并及时防止poag患者的视力丧失。通过药物或手术手段降低iop的方法是目前治疗青光眼的标准治疗方法之一。然而，手术干预并非没有风险且副作用多(例如瘢痕化小梁网的形成)；此外，自愿或非自愿的手术都不符合慢性疾病的医学治疗原则。大多数降低眼压的药物学手段多集中于增加小梁网途径房水外流或非小梁网途径房水外流以及减少房水的产生。然而，通过tm的房水流量减少，可能引起代谢物的堆积并进一步损伤细胞；此外，尚无小梁网重塑治疗手段。本发明的研究团队前期研究发现，将ipsc源小梁网类细胞(ipsc-tm)移植到青光眼小鼠模型眼睛和青光眼人眼灌注模型中，均可有效促进内源性tm细胞再生，致使小梁网细胞总数增加，小梁网房水外排能力提高，眼压降低。然而，ipsc-tm降眼压效果存在明显的个体差异，治疗效果不均一。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了itga6阳性ipsc源小梁网类细胞在制备降低眼压药物中的应用及筛选方法。
7.本发明的目的是提高ipsc-tm降低眼压的均一性。
8.本发明为后续用于青光眼治疗的手段之一及为探讨青光眼发病机制奠定基础。
9.itga6阳性ipsc源小梁网类细胞，简称为itga6阳性ipsc-tm细胞。
10.本发明的技术方案如下：
11.itga6阳性ipsc-tm细胞样品在制备治疗高眼压疾病药物中的应用。
12.根据本发明优选的，itga6阳性ipsc-tm细胞样品中itga6阳性ipsc-tm细胞比率为
20％以上；进一步优选为22.8％以上。
13.进一步优选的，itga6阳性ipsc-tm细胞样品中itga6阳性ipsc-tm细胞比率为30％以上。
14.更有优选的，itga6阳性ipsc-tm细胞样品中itga6阳性ipsc-tm细胞比率为40％以上。
15.根据本发明优选的，高眼压疾病包括高眼压症、青光眼。
16.一种筛选上述itga6阳性ipsc-tm细胞样品的方法，包括如下步骤：
17.(1)将人源ipsc-tm细胞与fitc-itga6抗体混合在2-8℃下孵育20-30分钟；孵育完成，离心孵育完成的细胞，并用缓冲液洗涤，然后用缓冲液重悬，避光加入带有anti-fitc的磁珠，混匀，4℃以下避光孵育15-20分钟，制得磁珠细胞混合物；
18.(2)将步骤(1)制得的磁珠细胞混合物用缓冲液洗涤后，再用缓冲液重悬后，置于磁场中的ls分选株进行纯化，无磁性细胞通过ls分选柱，磁性细胞保留在ls分选柱上，将磁性细胞在ls分选柱上分离收集，获得磁性细胞样品，将收集的磁性细胞样品由bd facscalibur确定itga6阳性ipsc-tm细胞的比率，筛选itga6阳性ipsc-tm细胞比率为5.8％以上的细胞样品。
19.根据本发明优选的，步骤(1)中，ipsc-tm细胞与itga6抗体混合的数量体积比为1.0
×
106个：(90-110)μl。
20.根据本发明优选的，步骤(1)中，带有anti-fitc的磁珠加入量，以ipsc-tm细胞数与磁珠体积比计为1.0
×
106个：(9-11)μl。
21.根据本发明优选的，步骤(2)中，筛选itga6阳性ipsc-tm细胞比率为20％以上的细胞样品。
22.进一步优选的，步骤(2)中，筛选itga6阳性ipsc-tm细胞比率为30％以上的细胞样品。
23.更优选的，步骤(2)中，筛选itga6阳性ipsc-tm细胞比率为40％以上的细胞样品。
24.根据本发明优选的，步骤(2)中，将磁性细胞在ls分选柱上分离收集的方法是通过柱塞推挤收集。
25.根据本发明优选的，步骤(1)或步骤(2)中的缓冲液为含有体积分数为0.5％牛血清白蛋白和2mm乙二胺四乙酸的1
×
d-pbs缓冲液。
26.有益效果
27.1、本发明发现itga6阳性ipsc-tm细胞能有效降低高眼压，降低高眼压的效果显著优于ipsc-tm细胞，itga6阳性ipsc-tm细胞可重塑tm组织结构，减小组织损伤；itga6阳性ipsc-tm细胞的比率为20％以上时降低高眼压的效果明显，提高了ipsc-tm降低眼压的均一性。
28.2、本发明还提供了一种筛选itga6阳性ipsc-tm细胞的方法，本发明提供的方法能有效筛选出itga6阳性ipsc-tm细胞。
附图说明
29.图1为磁珠分选itga6阳性ipsc-tm细胞示意图。
30.图2为不同itga6阳性比例的细胞分选及移植后细胞在青光眼小鼠模型眼内的分
布图；
31.图中：a为不同itga6阳性比例的细胞分选图；b为移植后细胞在青光眼小鼠模型眼内的分布图。
32.图3为不同itga6阳性比例的细胞刺激原代tm增殖图；
33.图3中：htm表示人源的tm细胞。
34.图4为不同itga6阳性比例的细胞分选图及纳米颗粒标记的不同itga6阳性比例的ipsc-tm细胞形态图；
35.图中：a为不同itga6阳性比例的细胞分选图；b为纳米颗粒标记的不同itga6阳性比例的ipsc-tm细胞形态图。
36.图5为不同itga6阳性比例的ipsc-tm恢复青光眼小鼠的iop稳态图。
37.图6为不同itga6阳性比例的细胞分选图及纳米颗粒标记的移植不同itga6阳性比例的ipsc-tm细胞形态图；
38.图中：a为不同itga6阳性比例的细胞分选图；b为纳米颗粒标记的不同itga6阳性比例的ipsc-tm细胞形态图。
39.图7为itga6阳性ipsc-tm降低高眼压恒河猴眼的iop图及房水流出系数图；
40.图中：a为itga6阳性ipsc-tm降低高眼压恒河猴眼的iop图；b为房水流出系数图。
具体实施方式
41.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于此，实施例中主要采用常规的分子生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。
42.主要材料来源
43.磁珠：anti-fitc micro beads(miltenyi biotec，130-048-701)；
44.itga6抗体：fitc anti-human itga6 antibody(miltenyi biotec，130-097-245)；
45.ls分选柱：ls separation columns(miltenyi biotec，130-042-401)；
46.macs分离器：midimacs separator(miltenyi biotec，130-042-302)；
47.ipsc-tm：制备过程参照zhu w等人，transplantation of ipsc-tm stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes.sci rep.2020feb 19；10(1):2905.doi:10.1038/s41598-020-59941-0.pmid:32076077；pmcid:pmc7031365。
48.实施例1
49.一种筛选itga6阳性ipsc-tm细胞的方法，包括如下步骤：
50.(1)纯化过程的示意图如图1所示。将1.0
×
106个分化细胞(人ipsc-tm)与100μl20％(wt/vol)fitc抗人itga6抗体在4℃下孵育20钟；室温离心孵育完成的细胞120
×
g，3分钟后用80μl含有体积分数为0.5％牛血清白蛋白和2mm乙二胺四乙酸的1
×
d-pbs缓冲液(后文简称为缓冲液)重悬；重复此步骤，加入90μl缓冲液重悬，避光加入10μl磁珠anti-fitc micro beads，混合均匀，4℃避光孵育15分钟，制得磁珠细胞混合物；
51.(2)加2ml缓冲液洗涤步骤(1)制得磁珠细胞混合物，120
×
g，离心3分钟，弃上清，加1ml缓冲液重悬细胞。将ls分选柱置于macs分离器的磁场中，先加入2ml的缓冲液润洗ls分选柱，然后加入1ml细胞悬液，使用2ml缓冲液冲洗柱子3次。收集留出的细胞为无磁性细
胞，命名为itga6阴性细胞。将3ml的缓冲液加入到ls柱中，立即用柱塞将标记的细胞推出，获得磁性细胞样品，将收集的磁性细胞样品由bd facscalibur确定itga6阳性ipsc-tm细胞的比率。
52.根据上述方法，筛选出来itga6阳性ipsc-tm细胞的比率分别为1.9％、6.0％、8.1％、11.5％、12.8％、22.8％、31.7％、40.6％和65.8％的细胞样品。
53.实施例2
54.实施例1制备的不同itga6阳性比率的ipsc-tm对体外细胞的促生作用，具体步骤如下：
55.(1)本发明以一系列不同itga6阳性比率的ipsc-tm(6.0％-31.7％；图2)与lenti-egfp病毒感染的原代tm共培养，感染成功的原代tm表达绿色荧光，即为egfp阳性细胞。共培养过程参照zhu w等人，transplantation of ipsc-tm stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes.sci rep.2020feb 19；10(1):2905.doi:10.1038/s41598-020-59941-0.pmid:32076077；pmcid:pmc7031365，并分析了共培养后原代tm的细胞数目；
56.(2)将与原代tm细胞相同数量(853.2个细胞/6cm2皿)的不同itga6阳性比例的ipsc-tm共培养，以原代tm数目作对照，计数egfp阳性细胞(图3)；
57.(3)本发明检测到ipsc-tm刺激细胞增殖的能力随着itga6阳性率的增加而增强(6.0％：588.8个细胞/皿；8.1％：528.5个细胞/皿；11.5％：786.5个细胞/皿；31.7％：1356.0个细胞/皿；图3)。阳性比例小的细胞增殖能力弱，但是阳性比率为31.7％及以上增值效果明显。
58.实施例3
59.itga6阳性ipsc-tm在体内的再生作用，具体步骤如下：
60.(1)本发明在ad5-myoc
y437h-egfp和tg-myoc
y437h
的两种青光眼c57bl/6小鼠(2月龄，雄性)模型中测试了itga6阳性ipsc-tm对iop稳态和ah流出的影响。突变体myoc
y437h
是通过人myocilin基因编码区1309位置的t碱基突变为c碱基，得到myoc
y437h
突变基因(nm_000261.2)，并将这些构建体克隆到腺病毒质粒(pbhglox e1,3)。将pdc311和pbhglox e1、3myoc
y437h
的质粒共转染到hek293细胞中，使用lipofiter转染试剂产生重组腺病毒，简称ad5-myoc y437h-egfp。仅表达egfp的ad5病毒，称为ad5-egfp，用作对照；
61.(2)使用与无菌针头(30号，1/2英寸)相连的hamilton注射器将ad5-myoc
y437h-egfp(7.8-8.2
×
107pfu；2.5μl)病毒前房注射到小鼠的一只眼睛。对侧眼接受相同量的ad5-egfp；
62.(3)本发明使用带有磁珠的纳米颗粒标记了ipsc-tm，以提高细胞递送效率，具体的合成及标记过程参考wang x等人，magnetic nano-platform enhanced ipsc-derived trabecular meshwork delivery and tracking efficiency.int j nanomedicine.2022mar 22；17:1285-1307.doi:10.2147/ijn.s3461
63.41.pmid:35345785；pmcid:pmc8957401，如图4所示，纳米颗粒标记没有改变细胞形态。
64.(4)在小鼠的前房内注射ad5-myoc
y437h-egfp病毒后(7.8-8.2
×
107pfu，n＝8)，通过回弹眼压计测量眼压，相比对照组ad5-egfp小鼠(第25天：17.8mmhg vs.14.1mmhg，p＝
0.0001，n＝8)或者野生型小鼠(第25天：17.8mmhg vs.14.6mmhg，p＝0.0002，n＝10)的眼压，实验组眼压显著增加(图5)；
65.(5)接下来，本发明以一系列不同itga6阳性比率的ipsc-tm(1.9％、22.8％和40.6％)进行前房内移植，移植数目为5.0*104个细胞/眼球，并使用环形磁铁将其引导至tm区域。每周跟踪眼压，直到实验结束(第45天)；移植后，野生型小鼠(pbs组：浅灰色；ad5-egfp组：深灰色)和接受pbs注射的青光眼小鼠(glaucoma，g)(橙色)的眼压没有显著变化。与接受pbs的青光眼小鼠相比，1.9％(绿色)、22.8％(蓝色)和40.6％(紫色)的itga6阳性ipsc-tm细胞移植通常会导致眼压降低(图5a)，但效率不同(第45天：pbs vs.1.9％＝3.6％vs.20.4％，p＝0.23；第45天：pbs vs.22.8％＝3.6％vs.38.2％，p《0.0001；第45天：pbs vs.40.6％＝3.6％vs.36.9％，p《0.0001)。例如，在第24天，40.6％ itga6阳性ipsc-tm在降低iop方面的效率高于22.8％ itga6阳性ipsc-tm(44.4％vs.22.1％，p＝0.005)(图5b)。在细胞移植后第45天，1.9％ itga6阳性ipsc-tm(绿色)和pbs(橙色)之间的显著差异减少，相比之下，22.8％(蓝色)和40.6％(紫色)的ipsc-tm移植仍然显著降低眼压。
66.实施例4
67.itga6阳性ipsc-tm对非人类灵长类青光眼中的作用，具体步骤如下：
68.(1)据报道，氩激光光凝可导致猴子小梁网jct中的细胞外基质更密集，施螺姆管塌陷，ah流出减少，眼压持续升高，这与人类poag的病理变化非常相似。为了研究itga6阳性ipsc-tm是否在非人类灵长类青光眼中也起作用，本发明使用环氩激光光凝术(第一次：180
°
；第二次：150
°
；第三次：30
°
)刺激恒河猴的一只眼睛，并每月跟踪眼压。对侧眼用作对照；
69.(2)造模后，本发明研究了itga6阳性ipsc-tm的移植是否也可以在青光眼猴中以更高的效率降低升高的眼压。环氩激光光凝术导致两只猴子(4和5)的眼压持续升高(图7a)。本发明接下来将以两个itga6阳性比率(12.8％和65.8％)(图6)的磁性ipsc-tm(3.0*104个细胞)移植到右侧眼(od)中。对侧眼(os)用作配对对照；
70.(3)与12.8％ itga6阳性ipsc-tm(4od)相比，移植65.8％ itga6阳性ipsc-tm(5od)导致iop显著下降(橙色星星：4od与4os；绿色星星：5od与5os)(图7a)。这种差异可以保持到实验结束(113天)。此外，相比4od的房水流出系数，5od的房水流出系数也有所下降(图7b)。
71.总上所述，itga6阳性ipsc-tm细胞在体外细胞培养中促进tm细胞增殖，在小鼠眼球及恒河猴眼球有降低高眼压的作用。itga6阳性ipsc-tm细胞的比率为20％以上时降低高眼压的效果明显，提高了ipsc-tm降低眼压的均一性。