基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法及其应用

1.本发明属于荧光微塑料计数技术领域，具体涉及基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法及其在荧光微塑料标准溶液配制上的应用。


背景技术：

2.随着社会经济发展、科学进步和人民生活水平的提升，人们的饮用水安全意识也在不断地提高。微塑料是一种三维尺寸均在0.001-5mm范围内的塑料颗粒，是目前在饮用水中发现的新兴污染物之一，近年来已引起了学界和民众的广泛关注。
3.在围绕饮用水中微塑料展开的一系研究中，荧光微塑料模型粒子的应用已十分常见。由于制作工艺的制约，目前科研工作者使用的荧光微塑料模型粒子大多为球形颗粒。现有研究中，荧光微塑料水样丰度的检测方法有流式细胞仪法、显微镜-肉眼计数法和显微镜-图像识别法等。
4.流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，近年来开始被用于水样中荧光微塑料的定量分析。但流式细胞仪对样品中荧光微塑料的丰度有一定要求，一般要求水样中荧光微塑料的丰度在105-107个/ml，此丰度远远高于饮用水中微塑料的赋存丰度(2-30个/ml)和饮用水-微塑料研究中所设计的微塑料丰度(1-100个/ml)。上述原因导致流式细胞仪定量分析饮用水样品中的荧光微塑料需要进行大体积采样与繁琐的浓缩操作。而实验室内开展的饮用水相关实验(如烧杯实验)多采用小体积采样法，且浓缩过程也极易造成样品的损失与破坏，因此流式细胞仪法不适用于定量检测低浓度、小采样体积的荧光微塑料样品。
5.由于饮用水中荧光微塑料样品具有低浓度、小采样体积的特点，研究中一般优先选择显微镜-图像识别法。显微镜-肉眼计数法和显微镜-图像识别法都需要将水样中的微塑料抽滤至滤膜上，然后使用显微镜对滤膜进行观察，其中显微镜-肉眼计数法采用人眼直接观察、人工判断与计数，效率低下且错误率高，现阶段的研究已基本不采用此方法。更为常见的是显微镜-图像识别法，该方法可根据图像处理的不同逻辑分为显微镜-荧光强度法和显微镜-连通区域法。显微镜-荧光强度法是使用显微镜拍摄滤膜上的荧光微塑料图像后，根据所摄图片的不同荧光强度代表荧光微塑料的相对数量。显微镜-荧光强度法对微塑料荧光强度的稳定性、一致性以及图像拍摄的参数一致性有较高的要求，且无法避免荧光杂质带来的较大误差。显微镜-连通区域法同样采用显微镜采集滤膜上的荧光微塑料图像，使用image j对图像中前景像素的联通区域进行识别与计数。显微镜-连通区域法无法分离团聚的荧光微塑料，同时也无法避免荧光杂质的干扰。此外，现有的显微镜-图像识别法使用的显微镜不具备大视野扫描功能，导致拍摄方式局限于随机/分区随机拍照，此类拍摄方式将严重受到微塑料在滤膜表面分布不均匀性的影响，进而造成较大误差。因此，现有的显微镜-图像识别法无法实现荧光微塑料标准球形粒子的高准确性、高稳定性计数。
6.olympus vs120虚拟数字切片扫描系统是应用于组织病理学、神经生物学、发育生
物学等研究领域的虚拟切片扫描类大型仪器。vs120利用全自动显微镜扫描系统，结合虚拟切片软件，把传统切片进行扫描、无缝拼接，生成一整张全视野的数字切片，以此化解高分辨率和大视野间的矛盾。
7.使用超声、磁力搅拌、涡旋振荡后的荧光微塑料溶液仍然存在微塑料分布不均匀的问题，因此传统的溶解性药品标准溶液配制方法并不适用于荧光微塑料标准溶液。由于现有的计数方法对样品溶液中荧光微塑料绝对数量的计数存在较大误差，因此荧光微塑料标准溶液的配制问题一直无法被解决。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法，该方法能够快速准确的测定饮用水样品中荧光微塑料的丰度。
9.一种基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法，包括：
10.(1)使用虚拟数字切片扫描系统vs120对球形荧光微塑料样品进行全面积扫描拍摄得到全面积数字图像，对全面积数字图像进行无损切割成多张待处理图像；
11.(2)将待处理图像转换为梯度信息灰度图像，对梯度信息灰度图像进行二值化处理得到二值化的边缘图像，利用霍夫梯度法基于设定的半径范围从二值化边缘图像中识别圆心坐标，以及所述圆心坐标对应的圆半径和圆强度；将识别的多个圆心坐标按照横坐标升序排列得到第一圆心坐标序列；
12.(3)去除重叠或覆盖圆的步骤为：将第一圆心坐标序列的第一圆心坐标与第二圆心坐标的横坐标进行差值计算得到横坐标差值绝对值，当所述横坐标差值绝对值大于第一圆心坐标和第二圆心坐标的最大圆半径时，保留第一个圆心坐标和第二圆心坐标，当所述横坐标差值绝对值小于等于所述最大圆半径时，首先获得第一个圆心坐标和第二圆心坐标的圆心距，然后当所述圆心距大于所述最大圆半径时，保留第一个圆心坐标和第二圆心坐标，当所述圆心距小于等于所述最大圆半径时，比较第一圆心坐标和第二圆心坐标对应的圆强度，保留圆强度最大的圆心坐标；
13.(4)按照步骤(3)将第一圆心坐标与剩余圆心坐标依次进行比较直至第一圆心坐标与当前比较的圆心坐标的横坐标差值大于最大半径则完成比较，或者第一圆心坐标的圆强度低于当前比较圆心坐标的圆强度则完成比较，或者第一圆心坐标与最后的圆心坐标比较完成则完成比较；
14.(5)步骤(4)完成比较后按照横坐标升序顺序对第一圆心序列中除第一圆心坐标和经(3)-(4)去除的圆心坐标后的第一顺位圆心坐标执行步骤(3)-(4)，直至第一圆心坐标序列中的最后两个圆心坐标完成步骤(3)-(4)，停止比较，以得到去除重叠或覆盖杂质的第二圆心坐标序列；
15.(6)对所述第二圆心坐标序列中的圆心坐标分别按照对应的圆强度和圆半径进行升序排列，基于圆强度阈值和圆半径阈值去除较小圆半径且较小圆强度对应的圆心坐标以得到第三圆心坐标序列从而去除单独存在的荧光杂质，将所述第三圆心坐标序列中的圆心坐标数量作为待处理图像的球形荧光微塑料数量。
16.荧光微塑料样品的制备方法为：将待测溶液的荧光微塑料抽滤至聚碳酸酯滤膜上得到荧光微塑料样品。
17.对全面积数字图像进行无损切割成多张待处理图像，包括：采用olyvia或photoshop软件的切图功能将全面积数字图像无损分割成多张待处理图像。
18.将待处理图像转换为梯度信息灰度图像，包括：
19.将待处理图像转换为8位灰度图，采用sobel边缘检测算子分别计算所述8位灰度图中每个像素点在x轴方向梯度值gx和y轴方向梯度值gy，并将作为每个像素点的总梯度值，每个带有总梯度值的像素点构建了梯度信息灰度图像。
20.对梯度信息灰度图像进行二值化处理得到二值化的边缘图像，包括：
21.使用大律法计算梯度信息灰度图像的全局图像阈值，并采用所述全局图像阈值对梯度信息灰度图像进行二值化处理得到二值化的边缘图像。
22.对梯度信息灰度图像进行二值化处理，包括：当总梯度值大于等于全局图像阈值的像素点值设为1，将总梯度值小于全局图像阈值的像素点值设为0，从而得到二值化的边缘图像。
23.利用霍夫梯度法基于设定的半径范围从二值化边缘图像中识别初始圆心坐标，以及初始圆心坐标的圆半径和圆强度，包括：
24.基于设定的半径范围从二值化边缘图像中识别圆形边缘，基于圆形边缘像素点的梯度方向和设定半径范围获得多个候选圆心坐标，对多个候选圆心坐标进行投票，将总票值最高的候选圆心坐标作为圆心坐标，圆心坐标的投票结果作为圆强度；
25.获得为圆心坐标投票的像素点和所述像素点对应的多个半径值，对多个半径值进行投票，将总票值最高的半径值作为圆心坐标的圆半径。
26.对多个候选圆心坐标进行投票和对多个半径值进行投票，投票的单票票值p0均为：
[0027][0028]
r为经过像素点的设定半径值。
[0029]
一种基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法在荧光微塑料标准溶液配制上的应用，，包括：
[0030]
(1)将微塑料分散液进行抽滤，将荧光微塑料富集到黑色聚碳酸酯滤膜上，通过如权利要求1-8任一项所述的基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法得到滤膜上的球形荧光微塑料数量；
[0031]
(2)对所述黑色聚碳酸酯滤膜富集面进行冲洗，保留洗脱液，通过如权利要求1-8任一项所述的的基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法对洗脱后的滤膜进行计数得到滤膜上未被洗脱的球形荧光微塑料数量；
[0032]
(3)将步骤(1)得到的球形荧光微塑料数量和步骤(2)得到的洗脱后的球形荧光微塑料数量进行差值得到洗脱溶液中的球形荧光微塑料数量，将洗脱溶液中的球形荧光微塑料数量与洗脱溶液的体积相比得到洗脱溶液中荧光微塑料的丰度，从而完成荧光微塑料标准溶液的配制，也可以将洗脱液稀释成更低丰度的荧光微塑料标准溶液。
[0033]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0034]
(1)本发明通过虚拟数字切片扫描系统vs120，实现对滤膜的全面积拍照，避免由
于随机拍照导致的荧光微塑料在滤膜表面分布的不均匀性而带来的随机误差。
[0035]
(2)本发明提出使用形状判别算法，利用霍夫变换对图像中的球形边缘进行初步识别，随后增加算法去除重叠/覆盖圆。本发明在避免产生大量计算过程的同时，也实现了令人满意的处理效果和较高的处理速度。形状判别算法、去除重叠/覆盖圆算法、去除小半径且低强度圆算法的加入使得本发明涉及的算法在处理图象时对r1(目标识别圆的最小半径)、r2(目标识别圆的最大半径)参数不敏感，因此可以实现大批量处理图片，并保证令人满意的准确度和稳定度。
[0036]
(3)本发明可辅助配制已知浓度的微塑料标准溶液。本发明对富集有荧光微塑料的黑色聚碳酸酯滤膜lm1进行计数操作，得到其上富集的荧光微塑料数量n1，对滤膜富集面使用注射器进行冲刷，将微塑料冲刷到洗脱液中，得到洗脱后滤膜lm2。对lm2进行计数操作得到其上剩余的荧光微塑料数量n2。n＝n
1-n2即为洗脱液中荧光微塑料数量。本发明避免了荧光微塑料在水相中分布不均匀带来的标准溶液难配制问题，基于本发明的球形荧光微塑料计数方法实现了丰度明确的荧光微塑料标准溶液的配制。
附图说明
[0037]
图1为本发明具体实施方式提供的基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法的流程图；
[0038]
图2为本发明具体实施方式提供的抽滤至聚碳酸酯滤膜上的待测样品图像；
[0039]
图3为本发明具体实施方式提供的采用虚拟数字切片扫描系统vs120拍摄的全面积数字图；
[0040]
图4为本发明具体实施方式提供的对全面积数字图像进行无损切割后得到的待处理图；
[0041]
图5为本发明具体实施方式提供的对待处理图像进行边缘识别后得到的边缘图像；
[0042]
图6为本发明具体实施方式提供的采用霍夫梯度法筛选圆形边缘后的效果图；
[0043]
图7为本发明具体实施方式提供的进行重叠/覆盖圆去除处理后的效果图；
[0044]
图8为本发明具体实施方式提供的进行低亮度杂质、不规则杂质去除处理后的效果图；
[0045]
图9为本发明具体实施方式提供的对待处理图像进行虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法标记图和image-pro plus计数标记图，其中，图9(a)为待处理图像，图9(b)为对待处理图像进行虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法标记图，图9(c)为采用image-pro plus计数标记图；
[0046]
图10为本发明具体实施方式提供的使用随机/分区拍照的数字图；
[0047]
图11为本发明具体实施方式提供的荧光微塑料标准溶液配制流程图。
具体实施方式
[0048]
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。
[0049]
本发明提供了一种基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法，如图1所示，包括：
[0050]
(1)获取需要检测的溶液，将溶液中的微塑料抽滤至直径25mm，孔径0.8μm的聚碳酸醋滤膜上。
[0051]
(2)使滤膜的待测面朝上，用金属镊子将滤膜平整地放置于洁净、无荧光物质污染的载玻片上，完成样品的制备，如图2所示。
[0052]
(3)将步骤(2)制备的待测样品置于虚拟数字切片扫描系统vs120的电动载物台上，并固定与载玻片槽内，打开cellsens软件(虚拟数字切片扫描系统vs120的操作软件)，选择荧光模式，选择对应的载玻片槽，填写保存路径和载玻片名称，选择低倍镜(
×
2)在明场或荧光环境下预览扫描整张玻片后，选择合适的物镜放大倍数并框选需要拍摄的区域，设置适当数量和合适位置的聚焦点，选择需要的荧光通道和曝光时间，进一步的，对所选聚焦点进行手动调焦，最后点击“立即扫描”开始对目标区域进行扫描拍摄。拍摄结束后，保存拍摄得到的全面积数字图像，全面积数字图像格式为vsi，见图3。
[0053]
(4)受到电脑整体内存要求和处理速度的限制，需要先使用olyvia软件将全面积数字图像分割成四等分，并将分割后的图片格式保存为jpg/jpeg/bmp格式，并使用photoshop切图功能将四等分后的图像无损切割成合适大小的多张待处理图像，如图4所示。
[0054]
(5)将待处理图像转换为8位灰度图，采用sobel边缘检测算子分别计算所述8位灰度图中每个像素点在x轴方向梯度值gx和y轴方向梯度值gy，并将作为每个像素点的总梯度值，每个带有总梯度值的像素点构建了梯度信息灰度图像。使用大律法计算梯度信息灰度图像的全局图像阈值，当总梯度值大于等于全局图像阈值的像素点值设为1(logical)，将总梯度值小于全局图像阈值的像素点值设为0(logical)，从而得到二值化的边缘图像，如图5所示。
[0055]
(6)采用霍夫梯度法筛选圆形边缘得到的效果图如图6所示：利用霍夫梯度法基于用户指定的半径范围[r1，r2]从二值化边缘图像中识别圆心坐标，以及所述圆心坐标对应的圆半径和圆强度，并得到第一圆心坐标序列，具体步骤为：
[0056]
以0.5为步长遍历设定半径，基于设定的半径从二值化边缘图像中识别圆形边缘，根据圆形边缘像素点的梯度方向和预设半径计算得出多个候选圆心坐标，对多个候选圆心坐标进行投票，将总票值最高的候选圆心坐标作为圆心坐标，圆心坐标的投票结果作为圆强度；获得为圆心坐标投票的像素点和所述像素点对应的多个半径值，对多个半径值进行投票，将总票值最高的半径值作为圆心坐标的圆半径。
[0057]
其中，对多个候选圆心坐标进行投票和对多个半径值进行投票，投票的单票票值p0均为：
[0058][0059]
r为经过像素点的设定半径值。通过上述单票票值的设定将设定半径中的具有较多投票次数的圆半径，即半径值较大的半径，单票票值设定较低，将由于半径值较大从而获得较多的票数，通过降低单票票值来平衡达到公平性。
[0060]
将识别的多个圆心坐标按照横坐标升序排列得到第一圆心坐标序列，第一圆心坐标序列包括第一圆心坐标、第二圆心坐标
…
第n圆心坐标。
[0061]
(7)去除待处理图像中的重叠或覆盖圆，具体步骤为：
[0062]
(7.1)将第一圆心坐标序列的第一圆心坐标与第二圆心坐标的横坐标进行差值计算得到横坐标差值绝对值，当所述横坐标差值绝对值大于第一圆心坐标和第二圆心坐标的最大圆半径时，保留第一个圆心坐标和第二圆心坐标，当所述横坐标差值绝对值小于等于所述最大圆半径时，首先获得第一个圆心坐标和第二圆心坐标的圆心距，然后当所述圆心距大于所述最大圆半径时，保留第一个圆心坐标和第二圆心坐标，当所述圆心距小于等于所述最大圆半径时，比较第一圆心坐标和第二圆心坐标对应的圆强度，保留圆强度最大的圆心坐标；
[0063]
(7.2)按照步骤(7.1)将第一圆心坐标与剩余圆心坐标依次进行比较直至第一圆心坐标与当前比较的圆心坐标的横坐标差值大于最大半径则完成比较，说明比较完成后第一圆心序列中剩余的圆心坐标与第一圆心坐标横坐标差值均大于最大圆半径值，或者第一圆心坐标的圆强度低于当前比较圆心坐标的圆强度则完成比较，说明第一圆心坐标对应的圆为荧光杂质从而剔除第一圆心坐标完成比较，或者第一圆心坐标与第一圆心坐标序列中的末位圆心坐标比较完成则完成比较；
[0064]
(7.3)步骤(7.2)完成比较后按照横坐标升序顺序对第一圆心坐标序列中除第一圆心坐标和经(3)-(4)去除的圆心坐标后的第一顺位圆心坐标执行步骤(7.1)-(7.2)，直至第一圆心坐标序列中剩余的最后顺位圆心坐标完成步骤(7.1)-(7.2)，停止比较，以得到去除重叠或覆盖杂质的第二圆心坐标序列，处理后的效果图如图7所示；
[0065]
(8)对待处理图像中的低亮度、不规则杂质进行去除：对所述第二圆心坐标序列中的圆心坐标分别按照对应的圆强度和圆半径进行升序排列，去除半径小于前a％水平且圆强度小于前b％水平的圆。其中a值与b值根据图像中杂质含量大小灵活调整以得到第三圆心坐标序列从而去除单独存在的荧光杂质，进行低亮度杂质、不规则杂质去除处理后的效果，如图8所示，将所述第三圆心坐标序列中的圆心坐标数量作为待处理图像的球形荧光微塑料数量。
[0066]
(9)处理输出数据，推算样品丰度：本发明对每张图片的荧光微塑料计数结果和识别后效果图均会输出，以便用户掌握处理效果并及时调整参数，也便于用户处理数据。数据的具体处理方式如下为将一张全视野扫描图片分割后的每一小张待处理图片对应的荧光微塑料数量求和，即得到完整扫描图片对应的荧光微塑料总数，最后根据目标样品体积推算出目标样品溶液中荧光微塑料的丰度。
[0067]
基于此，本发明首次将olympus vs120虚拟数字切片扫描系统应用于荧光微塑料模型粒子的计数中，实现对滤膜的全面积拍照，避免随机/分区拍照与荧光微塑料在滤膜表面分布的不均匀性带来的误差；本发明提出利用形状判别算法识别图像中的球形荧光微塑料，较image j等仅以连通域为计数对象的识别软件有了更高的准确度；本发明提出消除重叠/覆盖圆、消除低亮度荧光杂质算法，在保证识别准确度的情况下，实现批量处理荧光微塑料图片的功能，极大程度地提高了图片处理效率，节省了科研工作者的时间。
[0068]
本发明还提供了一种洗脱定量配制荧光微塑料标准溶液的方法，如图11所示，具体步骤为：
[0069]
(1)对微塑料分散液进行抽滤得到富集有荧光微塑料的黑色聚碳酸酯滤膜lm1；
[0070]
(2)对富集有荧光微塑料的黑色聚碳酸酯滤膜lm1采用所述基于虚拟数字切片扫
描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法进行计数操作，得到其上富集的荧光微塑料数量n1，对滤膜富集面使用注射器进行冲刷，将微塑料冲刷到洗脱液中，得到洗脱后滤膜lm2；
[0071]
(3)对lm2进行采用所述基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法进行计数操作得到其上剩余的荧光微塑料数量n2。n
洗脱液
＝n
1-n2，即为洗脱液中荧光微塑料数量。将洗脱溶液中的球形荧光微塑料数量n
洗脱液
与洗脱液的体积或洗脱液的稀释后体积v0相比得到洗脱溶液中荧光微塑料的丰度c0，从而完成已知浓度的荧光微塑料标准溶液的配制。
[0072]
从微塑料分散液中富集到黑色聚碳酸酯滤膜上的微塑料总个数(n1)为146个，滤膜经过洗脱后仍留存在滤膜上的荧光微塑料个数(n2)为9个。为掌握洗脱过程中损失的荧光微塑料数量，对该实施例得到的洗脱液进行抽滤、计数，结果显示，洗脱液经过抽滤富集到滤膜(lm3)上的荧光微塑料个数(n3)为135个。则在洗脱和对洗脱液的抽滤过程中损失的总荧光微塑料个数n4的计算公式如下：
[0073]
n4＝n
1-n
2-n3[0074]
本实施例中，n4为2。则在洗脱和对洗脱液的抽滤过程中荧光微塑料损失率η的计算公式如下：
[0075][0076]
本实施例中荧光微塑料损失率η为1.36％，能够满足实验精度要求，因此可以直接将n
1-n2作为洗脱液中荧光微塑料数量。此外，本实施例中使用的洗脱液体积为75ml，若需要配制丰度更高的荧光微塑料标准溶液，可以通过提高洗脱液流速，降低洗脱液体积来提高洗脱液中荧光微塑料的丰度。
[0077]
对比例
[0078]
使用随机/分区拍照对抽滤后的样品进行拍照，如图10所示，右侧存在微塑料溢散的情况，具有明显的不均匀性。在原图中取五个分区，分别为正中、正上、正下、正左和正右，分区编号分别为1、2、3、4、5。对五个分区的图像分别采用人眼计数的方式得到分区区域内球形荧光微塑料模型粒子数量的准确值，人眼识别荧光微塑料模型粒子的判断依据和标准为：图片中粒径范围在10μm左右且圆心在图像内的荧光微塑料模型粒子。下表为五个分区内球形荧光微塑料模型粒子的准确值和统计学指标：
[0079][0080]
由上表数据可见，五个分区间的离散系数达到了0.20，这说明滤膜上荧光微塑料的分布不均匀程度较高，这也说明随机/分区拍照将带来较大的误差。
[0081]
而对于本专利利用vs120实现的全面积拍摄来讲，荧光微塑料在滤膜上的分布均匀性不会对最终计数结果有影响，完全避免了随机/分区拍照带来的较大随机误差。
[0082]
效果说明：
[0083]
使用本发明提供的基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法与image-pro plus软件的计数功能对同一张荧光微塑料模型粒子图片进行计数处理，比对效果与结果的准确性，如图9a-图9c所示。图片中荧光微塑料模型粒子的准确值以人眼识别为准。人眼识别荧光微塑料模型粒子的判断依据和标准为：图片中粒径范围在10μm左右且圆心在图像内的荧光微塑料模型粒子。
[0084]
本组实验中，经过人眼识别，此荧光微塑料模型粒子原图1中的粒子准确数量为248，如图9c所示本发明提供的基于虚拟数字切片扫描系统和图像识别的球形荧光微塑料计数方法的识别效果达到100％的准确率，而如图9b所示image-pro plus软件仅达到76.21％的准确率。