一种可负载乳酸菌的灵芝孢子及其制备方法

1.本发明涉及用灵芝孢子负载益生菌的载体制备技术领域，具体涉及一种可负载乳酸菌的灵芝孢子及其制备方法。


背景技术：

2.益生菌在维持人体健康，甚至是辅助疾病治疗方面发挥着重要作用。乳酸菌是一类功效显著，使用广泛的益生菌。但是，进入体内的乳酸菌能否发挥功效，在很大程度上取决于有多少活的乳酸菌能够在肠道定植和生存下来。虽然人们已经开发了包埋、胶囊壳衣包装等手段来减少乳酸菌经过胃液时的活性损失，但是很少有关于将乳酸菌定向运送到肠道粘膜表面，并使其有效定植下来的相关研究。
3.载体是人们用于靶向运输药物的重要手段，然而用于负载乳酸菌的载体报道极少。这主要是因为大多数载体都是通过多孔结构的吸附作用来负载药物，但是菌体相对于这些孔径来说要大很多，并不能有效进入载体内部，从而不能达到有效负载。
4.随着人们对灵芝孢子中功效成分认识度的提高，越来越多的灵芝孢子被用于提取其中的酯溶性物质，或者水溶性多糖，剩余大量的，破碎后的孢子壳，没有得到充分利用，造成浪费。
5.虽然一些研究人员用改性后的灵芝孢子去吸附污水中污染物(较为常见的是染料分子)，其作用机理主要是这些污染物分子可以进入灵芝孢子的小孔。然而，乳酸菌的体积要比这些分子大很多，无法进入孔径，因为，没有人研究怎样采用灵芝孢子负载乳酸菌。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供一种可负载乳酸菌的灵芝孢子及其制备方法，其可高效负载乳酸菌。
7.为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：一种可负载乳酸菌的灵芝孢子的制备方法，其特征在于：
8.所述方法包括以下步骤：
9.步骤一：将脂肽iturin a加入到去离子水中，搅拌至完全溶解，将溶解均匀的iturin a加入灵芝孢子(bgls)中，混合均匀，得悬液a；
10.步骤二：将步骤一得到的悬液a置于摇床中持续震荡；
11.步骤三：将步骤二得到震荡后的悬液a离心，用乙醇和去离子水交替洗涤三次，去除上清液，然后冷冻干燥，得到的iturin a处理后的灵芝孢子；
12.步骤四：将步骤三得到的iturin a处理后的灵芝孢子置于hcl溶液中，搅拌均匀，并置于摇床中持续震荡，得到悬液b；
13.步骤五：将步骤四得到悬液b离心，用乙醇和去离子水交替洗涤三次，去除上清液，然后冷冻干燥，得到的iturin a和hcl联合处理后的灵芝孢子，即为可有效负载乳酸菌的灵芝孢子。
14.进一步，步骤二中，摇床震荡温度为4～50℃，50～300rpm震荡4～24小时。
15.进一步，步骤三中，将悬液a在4000～10000
×
g的转速下离心1～20分钟，冷冻干燥是在真空冷冻干燥机内冻干。
16.进一步，步骤四中，hcl浓度为4～8m，摇床温度为4～50℃，50～300rpm震荡4-24小时。
17.进一步，步骤五中，悬液b在4000～10000
×
g的转速离心下1～20分钟，冷冻干燥在真空冷冻干燥机内冻干。
18.上述制备方法制备所得的灵芝孢子。
19.与现有技术相比，本发明的优点如下：
20.1)本发明在利用破碎的灵芝孢子上天然孔径的基础上，通过技术处理，增加了其表面的小孔数量和孔径，同时改变了其表面的亲水性，从而使其能够有效地吸附乳酸菌。
21.2)本发明利用下脚料破碎后的灵芝孢子壳，提高了下脚料的综合利用，符合持续发展的理念。
22.3)本发明选用处理方法所用材料安全，操作方法简单，步骤少。
23.4)本发明制备的载体，安全无毒。
24.5)本发明制备的载体，对鼠李糖乳杆菌具有很高负载能力。
25.6)本发明的载体能够促进肠道粘液分泌，有肋于靶向肠道递送乳酸菌，促进其肠道定植。
附图说明
26.图1处理后所得灵芝孢子的亲疏水性检测(用水接触角表示)；其中：(a)未处理的bgls；(b)处理后bgls。
27.图2处理后灵芝孢子的14天急性经口毒性评价中体重变化；其中：(a)雌性小鼠；(b)雄性小鼠。
28.图3处理后灵芝孢子28天经口毒性评价中体重变化；其中：(a)雌性小鼠；(b)雄性小鼠。
29.图4处理后灵芝孢子灌胃后，小鼠的胃、小肠、结肠组织的pas粘液染色和阿利新蓝粘液染色结果。
30.图5处理后灵芝孢子对鼠李糖乳杆菌的吸附效率。
31.图6处理后灵芝孢子负载鼠李糖乳杆菌的扫描电镜图；其中：(a)未处理的bgls；(b)处理后bgls。
32.图7fitc荧光标记处理后灵芝孢子灌胃小鼠后，在肠道中的滞留时间以及分布；其中：(a)不同时间点的胃肠道中滞留情况；(b)结肠组织用灵芝孢子的荧光强度；(c)统计并计算滞留在结肠组织表面的灵芝孢子荧光强度。
33.图8处理后灵芝孢子在胃肠道组织粘液中的吸附情况；其中：(a)处理后灵芝孢子在胃部、小肠和结肠粘液中的吸附情况；(b)罗丹明b荧光标记指示灵芝孢子在胃肠组织中黏附情况。
具体实施方式
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.实施例：
36.本发明涉及一种可负载乳酸菌的灵芝孢子制备方法，包括以下步骤：
37.步骤一，400μg脂肽iturin a加入到20ml去离子水中，使脂肽iturin a溶液的最终质量浓度为20μg/ml，搅拌至完全溶解，再加入1g灵芝孢子(bgls)，混合均匀，灵芝孢子的最终质量浓度为50mg/ml。
38.步骤二中，将混合均匀的iturin a与灵芝孢子悬液，置于摇床中持续震荡；震荡温度为25℃，180rpm震荡12小时。
39.步骤三中，将步骤二得到悬液在4℃温度下，以8000
×
g的转速离心5分钟，去上清留沉淀，并用乙醇和去离子水交替洗涤三次，以相同的方式离心去上清留沉淀，冷冻干燥操作为-80℃预冻2小时后置真空冷冻干燥机内冻干，得到的iturin a处理后的灵芝孢子。
40.步骤四中，取1g步骤三得到的iturin a处理后的灵芝孢子加入到10ml的hcl溶液中，灵芝孢子的最终质量浓度为100mg/ml，hcl浓度为6m置于摇床中持续震荡，摇床温度为25℃，180rpm震荡12小时。
41.步骤五中，将步骤四得到悬液在4℃温度下，以8000
×
g的转速离心5分钟，去上清留沉淀，并用乙醇和去离子水交替洗涤三次，以相同的方式离心，去上清留沉淀，冷冻干燥操作为-80℃预冻2小时后置真空冷冻干燥机内冻干，得到的iturin a和hcl联合处理后的破碎灵芝孢子，即一种可负载乳酸菌的灵芝孢子。
42.灵芝孢子购自中国吉林省长白山的市场。iturin从枯草芽孢杆菌cctccm207209培养上清液中制备并纯化，盐酸(hcl，液体)购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。
43.取上述实施例所得到的的灵芝孢子进行性能检测如下：
44.1.灵芝孢子的亲疏性分析
45.测定处理好的灵芝孢子的水接触角，所得结果如图1所示。从中可以看出，与未处理的灵芝孢子(图1a)相比，处理后的灵芝孢子(图1b)的水接触角明显增大，说明其疏水性增强，亲水性减弱。
46.2.食用安全性评价实验
47.根据gb 15193.3-2014和gb15193.22-2014的相关实验方法，进行小鼠急性经口毒性试验和28天经口毒性试验。饲养温度为20-23℃，管理标准为清洁级，12h光/暗循环。用spf级小鼠鼠粮喂养，自由饮水及摄食，适应性喂养3天后，将小鼠随机分为对照组和处理后bgls组，每组按性别分两笼(每组10只小鼠)。
48.其中，急性口服安全性评价实验方法为：取5周龄健康昆明小鼠，体重18～20g，急性经口毒性试验设15000mg/(kg
·
bw)1个剂量组。按20ml/(kg
·
bw)经口灌胃。灌胃前动物禁食16h，染毒后观察14天，并记录体重。所得结果如图2所示，可见小鼠在14天的观察期内没有出现个体死亡，而且体重增长正常。实验结束后处死动物进行解剖，也未发现肉眼可见的组织或器官异常。由此说明，处理后的灵芝孢子对小鼠急性经口ld50》5000mg/(kg
·
bw)。按照急性毒性分级，处理后灵芝孢子属于实际无毒级，即食品安全级。
49.28天口服安全性评价实验方法为：取6周龄健康昆明小鼠。28天喂养试验设500、1000、2000mg/(kg
·
bw)3个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的25、50、100倍)和对照组(对照组每天给每只小鼠灌胃等量无菌水)，染毒后观察28天，并记录体重。所得结果如图3所示。结果说明，小鼠经灌胃灵芝孢子28天后，身体状况良好，在中高低剂量下均无个体死亡，未发现中毒现象，而且体重增长正常。实验结束后处死动物进行解剖，组织和器官未见肉眼可见的异常损伤，说明其无慢性毒性。
50.3.促进胃肠组织的粘液分泌
51.在28天灌胃后，取500mg/(kg
·
bw)组的小鼠，解剖后，取其胃组织、小肠组织和结肠组织，制备切片，分别用pas和阿利新蓝染色，以评估处理后灵芝孢子对小鼠组织内粘液变化的影响。可得结果如图4所示。图中显示，与对照组相比，小鼠进食处理后的灵芝孢子后，胃、小肠和结肠组织切片的pas和阿利新蓝染色更深，表示粘液量较大，说明处理后灵芝孢子能够促进胃肠组织的粘液分泌。
52.4.处理后灵芝孢子的载菌效率分析与显微结构观察
53.以鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus cctccm2017839)作为待负载的乳酸菌，取100μl菌种保藏液，在mrs固体培养基上涂布，并置于37℃恒温培养箱中倒置培养48h。挑取mrs固体培养基生长的益生菌单菌落，接种于5ml mrs液体培养基中，并继续置于37℃恒温培养箱中静置培养48h。根据平板计数法计数结果与菌悬液于od600nm条件下的吸光度的标准曲线，由od值计算菌体浓度，待菌体浓度达到1
×
109cfu/ml，停止培养。
54.将达到浓度要求的上述菌悬液，经4℃、8000r/min离心5min，收集菌体沉淀，用生理盐水洗涤三次后，重新用生理盐水悬浮至其浓度为1
×
109cfu/ml以备用。
55.取对照组、bgls组和处理后bgls组灵芝孢子载体各5mg，分别加入1ml的1
×
109cfu/ml的益生菌悬液中，混合均匀后，室温条件下静置负载30分钟。然后将溶液在1000
×
g转速下离心1分钟后，从沉积物中收集负载菌体的灵芝孢子载体，同时测定上清液的od600nm值，根据标准曲线，测定残留的未负载上的菌体浓度。
56.根据负载过程前后菌体浓度的变化计算相应载体的益生菌负载效率。使用方程(1)计算灵芝孢子的菌体负载率(log cfu/g)：
57.负载率(log cfu/g)＝(菌悬液的初始浓度-负载后菌悬液的浓度)/灵芝孢子的质量方程(1)
58.实验结束后，可得结果如图5所示。从中可以看出，处理后灵芝孢子对鼠李糖乳杆菌的负载效率可达到10
11
cfu/g，与未处理的孢子相比，负载量提高了10倍。
59.用扫描电子显微镜观察负载了鼠李糖乳杆菌的灵芝孢子，可得结果如图6所示。从中可以看出，处理后的灵芝孢子，表面孔洞的数量和孔径增加，负载的菌体密集地镶嵌在灵芝孢子中，证明了菌体的确被灵芝孢子所负载。
60.5.处理后灵芝孢子在小鼠胃肠道中的滞留时间
61.取6周龄健康成年昆明雄鼠，将fitc标记后的处理后灵芝孢子按照500mg/(kg
·
bw)的剂量给小鼠灌胃，分别在灌胃后2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、72和96小时，解剖小鼠，取出从胃到肛门的部位，通过小动物活体成像仪观察灵芝孢子的荧光分布情况。将不同时间点的结肠组织取出，并进一步解剖，测定并计算黏附在结肠组织上的处理后bgls荧光强度。
62.可得结果如图7所示。从中可以看出，处理后的灵芝孢子在灌胃后，可以在体内滞留96小进以上，灌胃后6小时到达结肠部位，自6小时至96小时，处理后的灵芝孢子均可以滞留在结肠部位。解剖结肠部位并测定荧光强度，发现灌胃后48小时的结肠部位聚集的孢子最多，96小时观察到结肠组织内表面依旧带有较强的荧光，充分说明处理后灵芝孢子可以长时间黏附滞留在小鼠消化道内，从而有助于益生菌的长期定植。
63.6.处理后灵芝孢子对在胃肠道黏液层中的黏附情况
64.胃肠粘液对处理后灵芝孢子的吸附作用评价：取雄性6周龄健康成年昆明鼠，取出胃部、小肠和结肠组织(小肠和结肠组织2.5cm长)，将组织置于冰板上，沿组织侧边剪开，并用pbs轻轻洗涤以除去内容物，用刀片刮取组织内表面的粘液物质。用微量注射器吸取刮取物，按0.1ml加5ml pbs充分混匀后以5000r/min低温离心30min后，分别取上清1ml，分别向其中加入5mg未处理bgls和处理后的bgls，在37℃下，孵育3h后以1000r/min低温离心1min以分离出吸附有粘液的孢子。留上清与0.4mg/ml的阿利新蓝溶液20℃下孵育12h后，以2500r/min离心10min.取上清液，用酶标仪在615nm条件下读数，以此测定孢子本身对粘液的吸附作用。
65.根据吸附过程前后粘液量的变化计算相应孢子对不同部位组织粘液的吸附率。使用方程(2)计算：
66.粘液吸附率(％)＝(粘液总量-未被吸附的粘液量)/粘液总量方程(2)
67.处理后灵芝孢子在胃肠粘液中吸附的定量分析：处死雄性6周龄健康成年昆明鼠，取出胃部、小肠和结肠组织(小肠和结肠组织2.5cm长)，沿胃组织胃大弯处剪开、小肠和结肠组织的端口处剪开，并用pbs轻轻洗涤以除去内容物。将10μl alexa fluor 488结合的小麦胚芽凝集素(wga)分别添加到胃组织、小肠组织和结肠来染色粘蛋白纤维。胃组织、小肠和结肠组织的用外科缝线缝合。在pbs(ph 7.4)中37℃孵育30分钟后，注射用罗丹明b预染色的处理后bgls。孵育60分钟的组织，通过共聚焦显微镜采集并观察(alexa fluor 488结合wga激发波长/发射波长＝488/520nm；罗丹明b激发波长/发射波长＝546/568nm)。
68.所得结果如图8所示。从图8a可以看出，与未处理孢子相比，处理后的灵芝孢子在胃肠组织部位的粘液中吸附率有大幅度提升；图3b显示，胃肠粘液层的3d层扫结果显示，处理后的灵芝孢子能够深入黏附嵌入到胃、小肠及结肠组织的黏液层中，展示出将乳酸菌携带并使其在此处定植的应用潜力。
69.以上所述仅是本发明的优选实施例，并非用于限定本发明的保护范围，应当指出，对本技术领域的普通技术人员在不脱离本发明原理的前提下，对其进行若干改进与润饰，均应视为本发明的保护范围。