一种血液中乙醇浓度的快速测定方法与流程

1.本发明涉及一种血液中乙醇浓度的测定方法，具体讲就是一种高速离心净化-连续流动分析仪快速测定血液中乙醇含量的方法。


背景技术：

[0002][0003]
目前公安交警往往采用手持式快速测定仪现场识别和血液样本检测两种方式来进行判别，以达到维护公共道路交通安全。现场检测依据《车辆驾驶醉酒驾车的测试人员血液、呼气酒精含量阈值与检验》（gb19522—2004）进行快速筛查判别，而要准确判别往往需要取血样实验室检测，依据《生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法》（ga/t 1073—2013）进行测定，由于样本中含有大量的水，造成乙醇不易完全气化分配，造成样品检测结果存在一定偏差；此外，制样过程中先使顶空瓶内为负压，操作较为繁琐，批次制备效果存在不一致现象。随着乙醇检验案件增多，需要检验周期短、人为干扰少的分析方法，基于此建立一套快速、标准化、自动化的乙醇检验体系，已成为现代法庭科学研究的主要方向之一。
[0004]
本发明针对当前血液中乙醇快速检测的需求，以及血液中乙醇检测往往是在gb19522—2004方法筛查后的样品，属于常量分析，建立一种快速简便样品前处理和高效的连续流动分析方法是十分必要的。


技术实现要素：

[0005]
本发明的主要目的是测定血液中乙醇含量，而建立一种高速离心净化-连续流动分析仪快速测定血液中乙醇含量的方法，该方法通过盐析高速离心处理，可有效去除样品带颜色的干扰物质，使样品得到充分净化；然后基于碱性条件下乙醇与重氮对氨基苯甲酸偶合反应生产橙黄色化合物的原理，设计了连续流动分析仪快速检测模块，从而实现样品自动化检测、效率高，方法重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。
[0006]
本发明的目的是通过以下步骤来实现的：一种血液中乙醇浓度的测定方法，采用饱和氯化钠溶液稀释样品高速离心后，去除样品中的干扰物质（如血红素等），取上层清液，用自行设计的连续流动分析模块快速测定萃取溶液中乙醇含量。
[0007]
本发明方法包括以下步骤：（1）样品稀释与净化：称取0.5~1.0ml待测样品用饱和氯化钠溶液稀释定容至5ml，然后在2000~50000rps转速下高速离心，以去除样品中干扰物质，如血红素等大分子物质；（2）乙醇含量测定：首先对分析仪反应模块管路进行改造，使分析仪上的玻璃四通11进入口a通过一个流量为1.20ml/min的泵管导入naoh溶液，进入口b通过一个流量为0.32ml/min的泵管导入空气，进液口c通过一个流量为0.23ml/min的泵管导入待测样品溶液，玻璃四通的出液口d与5匝混合圈相连接；该5匝混合圈出口与t型玻璃三通12的入口相
连接，t型玻璃三通的支端引入显色剂，显色剂由一个流量为0.23ml/min的泵管导入亚硝酸钠溶液和一个流量为0.23ml/min的泵管导入对氨基苯甲酸溶液在冰水浴反应池ⅰ中在线生成重氮对氨基苯甲酸络合物；t型玻璃三通的出口接入冰水浴反应池ⅱ中，冰水浴反应池ⅱ的出口端通过一20匝混合圈接入440nm比色池，通过样品溶液、氢氧化钠溶液和显色剂溶液导入该冰水浴反应池ⅱ进行显色反应从而进行测定，在测定过程中依次进行标准溶液和样品分析，最终得到待测溶液中乙醇的含量，再通过计算得到血液中乙醇浓度。
[0008]
在本发明中，所述冰水浴反应池ⅱ为内设有20匝混合圈的冰水浴反应池，所述冰水浴反应池ⅰ为内设有40匝混合圈的冰水浴反应池。
[0009]
所用试剂通过以下方式配制：氯化钠饱和溶液：称取36.5克氯化钠加入到100克水中溶解。
[0010]
对氨基苯甲酸溶液：称取12.5克对氨基苯甲酸加入到100ml5mol/l盐酸溶液中溶解。
[0011]
所述氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠加入到100克水中溶解。
[0012]
所述亚硝酸钠溶液：称取7.5克亚硝酸钠加入到92.5g水中溶解。
[0013]
在本发明中，用aaⅲ型（英国seal公司）进行组装的反应检测模块（原仪器未设计乙醇检测模块），可实现碱性条件下乙醇与重氮对氨基苯甲酸偶合反应生产橙黄色化合物的原理，模块设计为在线显色反应，能够显著降低试剂使用量，操作更加简便，降低检测成本。
[0014]
在本发明中，设计了显色剂重氮对氨基苯甲酸络合物的在线反应器——冰水浴反应池ⅰ，既能实现温度控制（0~4℃）又能实现显色剂的生成，从而避免了显色剂不易保存的缺点。
[0015]
在本发明中，设计了显色反应实现反应池——冰水浴反应池ⅱ，既能实现温度控制（0~4℃）又能实现碱性条件下乙醇与重氮对氨基苯甲酸络合物发生偶合反应生产橙黄色化合物。
[0016]
本发明中，偶合反应生产橙黄色化合物经20匝混合圈，以便反应液恢复室温下进行检测（通常比色法在室温下进行检测），避免反应液温度过冷造成吸热现象。
[0017]
与现有技术的ga/t 1073—2013的分析方法相比，样品净化处理操作简便，而且检测过程全自动、速度快效率高，该发明方法的精密度和回收率好，适用于gb19522—2004法筛查后的大批量血液样品的乙醇含量测定。
附图说明
[0018]
图1为本发明模块配置（即测试管路）连接示意图。
[0019]
图中序号：1是空气，2是10%氢氧化钠溶液，3是样品溶液，4是对氨基苯甲酸溶液，5是亚硝酸钠溶液，6是流量0.32ml/min泵管，7是流量1.20ml/min泵管，8是流量0.23ml/min泵管，9和10是流量0.23ml/min泵管，11是玻璃四通，12是玻璃三通，13是检测器（带有440nm滤光片和1cm流通池），14是冰水浴反应池ⅰ，15是冰水浴反应池ⅱ。
具体实施方式
[0020]
以下结合图1将测定方法说明如下：用饱和氯化钠溶液稀释血液样品，经高速离心
后，取上层清液，用自行设计的连续流动分析模块快速测定萃取溶液中乙醇含量。
[0021]
本发明方法包括以下步骤：（1）样品稀释与净化：称取0.5~1.0ml待测样品用饱和氯化钠溶液稀释定容至5ml，然后在2000~50000rps转速下高速离心，以去除样品中干扰物质，如血红素等大分子物质；（2）乙醇含量测定：首先对分析仪反应模块管路进行改造，使分析仪上的玻璃四通11进入口a通过一个流量为1.20ml/min的泵管导入naoh溶液，进入口b通过一个流量为0.32ml/min的泵管导入空气，进液口c通过一个流量为0.23ml/min的泵管导入待测样品溶液，玻璃四通11的出液口d与5匝混合圈相连接；该5匝混合圈出口与t型玻璃三通12的入口相连接，t型玻璃三通的支端引入显色剂，显色剂由一个流量为0.23ml/min的泵管导入亚硝酸钠溶液和一个流量为0.23ml/min的泵管导入对氨基苯甲酸溶液在冰水浴反应池ⅰ14(带有40匝混合圈)中在线生成重氮对氨基苯甲酸络合物；t型玻璃三通12的出口接入冰水浴反应池ⅱ15(带有20匝混合圈)中，冰水浴反应池ⅱ的出口端通过一20匝混合圈接入440nm比色池13，通过样品溶液、氢氧化钠溶液和显色剂溶液导入该冰水浴反应池ⅱ进行显色反应从而进行测定，在检测过程中依次进行标准溶液和样品分析，最终得到待测溶液中乙醇的含量，再通过计算得到血液中乙醇浓度。
[0022]
本发明以下结合具体实例做进一步描述：实例1按照该发明方法操作步骤，取10份0.1mg/ml最低浓度标准溶液0.3ml，分别加入4.7ml饱和氯化钠溶液于10ml离心管中混合均匀，将离心管置于高速离心机上，在2000rps转速下离心5min；然后再取上清液于样品杯中，即可用设计连续流动分析仪模块进行检测，计算10次检测结果的标准偏差，以3倍标准偏差为检出限、10倍标准偏差为定量限，得到方法检出限为0.024mg/ml、定量限为0.080mg/ml，表明方法有较低的检出限。
[0023]
实例2按照该发明方法操作步骤，取血样0.5ml，加入4.5ml饱和氯化钠溶液于10ml离心管中混合均匀，将离心管置于高速离心机上，在2500rps转速下离心5min；然后再取上清液于样品杯中，即可用设计连续流动分析仪模块进行检测，得到待测样品溶液中乙醇浓度12.5mg/ml，经结果换算得到血样样品中酒精含量为125mg/ml，依据该结果可醉酒程度进行判断。
[0024]
实例3按照该发明方法操作步骤，比较了该发明方法与ga/t 1073—2013方法，结果表明两种方法结果一致；该发明方法10个样品批处理约8min，检测完成约需30min；而ga/t 1073—2013方法样品前处理约需15min，检测完成约需120min，表明该发明方法要比ga/t 1073—2013方法简便快速，样品编号本发明（mg/ml）ga/t1073—2013（mg/ml）1125.0129.1267.564.8388.690.1435.634.2
[0025]
实例4
取某一血液样品，按照该发明方法操作步骤，依次考察了方法的精密度和加标回收率，结果表明：方法精密度为2.3%，加标回收率在97.2%~1019%之间，两个评价结果均优于ga/t 1073—2013方法（精密度3.9%和加标回收率94.7%~104.3%之间），表明该发明方法可以用于血液中乙醇的快速测定。