TCH-165在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

tch-165在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于药物新应用技术领域，具体涉及一种tch-165在制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.心肌缺血再灌注损伤在许多情况下均可发生，比如急性心肌梗死患者血管内溶栓、心脏介入手术、心脏外科手术、心肺复苏、器官移植及休克器官血液再通等等。随着社会人口老龄化的加速，治疗手段的不断完善，进行溶栓，行心脏外科手术患者的数量逐年增长，因此阐明心肌缺血再灌注损伤发生、发展的机制，研究能够延缓甚至逆转这一病理生理进程的治疗手段显得尤为重要。
3.心肌组织缺血时，尽早恢复血供是最重要的治疗手段，然而，当心肌组织缺血后血流恢复引起血液再灌注时，导致的心肌损伤比缺血本身更严重，包括心肌的组织结构、能量代谢、电生理及心功能等方面会产生更加严重,甚至不可逆的损伤，这种损伤被称为缺血再灌注损伤(iri)。iri可引起心肌舒张功能和收缩功能下降心室阈值升高，不应期缩短，表现为恶性心律失常、心功能不全，甚至猝死。iri的主要机制包括氧化应激反应、血管内皮损伤、钙超载、内质网应激、炎症损伤及线粒体膜通透性转换孔(mptp)开放等。这些机制在缺血再灌注中相互作用，共同促进iri的发展。
4.因此，开发有效减少心肌iri损伤的药物或治疗方法已成为亟待解决的关键问题。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种tch-165在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。tch-165是一种蛋白酶体激动剂，应用在预防或治疗心肌缺血再灌注损伤中，能够有效缓解心肌损伤，改善心脏功能，提高蛋白酶体活性，从而进一步调节线粒体的结构和功能，进而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
6.为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
7.本发明一方面提供一种tch-165在作为或制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。
8.需要说明的是，tch-165是一种蛋白酶体激动剂，其是能直接结合20s的α1/α2亚基间口袋以促进20s开门并增强蛋白酶体活性的激动剂。其分子式c39h37n3o3，分子量595.73，结构式如下所示：
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还需要说明的是，线粒体是高度动态的细胞器，为了维持其完整性、分布和大小而不断经历着生物发生、融合、裂变和降解的协调循环，这个过程称为线粒体动力学。越来越多的证据表明，心肌iri中的线粒体功能障碍和再灌注过程中线粒体通透性转换孔(mptp)的开放是细胞死亡的关键因素。因此，在心肌iri期间保持线粒体健康和预防mptp开放是心脏保护的两个重要治疗靶点。研究还发现，在心肌iri时线粒体分裂增多，融合减少，同时相关分裂蛋白表达增多，融合蛋白表达减少。由此表明，减少线粒体分裂，增加线粒体融合，是潜在改善心肌iri的治疗方法。
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另外，蛋白酶体是一种多酶复合物，通过降解错误折叠、冗余和受损的蛋白质来维持蛋白质稳态(蛋白酶稳态)和重要的细胞功能。蛋白酶体活性的下降与衰老、受损和错误折叠的蛋白质的积累相平行。tch-165作为蛋白酶体激动剂，能够提高蛋白酶体活性，诱导20s圆环的门打开。本研究发现，tch-165能够促进蛋白酶体降解线粒体分裂蛋白，从而改善线粒体功能，改善心肌iri。蛋白酶体活性的增强有许多治疗潜力，但确实是可行的，是一个相对未被开发的领域。但是，目前关于蛋白酶体激动剂tch-165在治疗心肌缺血再灌注损伤中的作用还未见报道。
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在一些具体示例中，上述应用中，tch-165通过改善心脏功能从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
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在一些具体示例中，上述应用中，tch-165通过减少线粒体分裂和增加线粒体融合从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
[0014]
在一些具体示例中，上述应用中，tch-165通过提高蛋白酶体活性从而预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
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在一些具体示例中，上述应用中，蛋白酶体包括糜蛋白酶样和/或胰蛋白酶样和/或半胱天蛋白酶样活性。
[0016]
在一些具体示例中，上述应用中，药物为注射药剂剂型。需要说明的是，施药方法为腹腔注射。
[0017]
在一些具体示例中，上述应用中，tch-165还可以同其他一些预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物联用，进行增效。
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需要说明的是，本发明中建立了小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，利用ttc和evans blue双染色、心超、ldh测定、蛋白酶体活性检测及分子生物学技术等，评估心功能、药物毒性、蛋白酶体活性及相关信号分子，发现蛋白酶体激动剂tch-165能够有效缓解心肌损伤，改善心脏功能，提高蛋白酶体活性，从而进一步调节线粒体的结构和功能。心肌iri后蛋白
酶体活性下降，而蛋白酶体激动剂tch-165作为20s激活剂，诱导20s圆环的门打开，提高蛋白酶体糜蛋白酶样(ct-l)、胰蛋白酶样(tryp-l)和半胱天蛋白酶样(casp-l)活性以降解衰老、受损和错误折叠的蛋白质。说明tch-165对改善症状、降低病死率，具有重要的临床意义。
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本发明有益效果包括：本发明通过实施例验证，tch-165可以有效提升iri后心脏功能、提高蛋白酶体活性以及改善线粒体的结构和功能，从而有效预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
附图说明
[0020]
图1为心肌缺血再灌注24后小鼠左心室m型超声心动图的代表性图像；
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图2为心肌缺血再灌注24后小鼠左室射血分数(ef％)和缩短分数(fs％)(n＝6)；
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图3为心肌缺血再灌注24后小鼠心脏evans blue和ttc染色梗死面积的代表性图像；
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图4为心肌缺血再灌注24后小鼠心脏危险区/左心室和梗死区/左心室的定量分析(n＝6)；
[0024]
图5为血清ldh测定统计图；
[0025]
图6为心肌组织蛋白酶体活性统计图。
具体实施方式
[0026]
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0027]
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
[0028]
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
[0029]
一、构建小鼠缺血再灌注损伤模型
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c57bl/6雄性小鼠，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；分笼饲养，恒温(23-25℃)，恒湿(55-70％)；
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缺血再灌注：6-8周雄性c57bl/6小鼠随机分为以下4组(n＝6)：(1)假手术 玉米油 dmso；(2)假手术 tch-165；(3)i/r 玉米油 dmso；(4)i/r tch-165。小鼠进行30min缺血后再灌注24h，并于术前1h腹腔注射药物。小鼠胸前消毒，于胸骨左侧第3、4肋间剪开皮肤，钝性分离，打开胸腔，暴露心脏，于心耳下缘1mm处结扎左冠状动脉的前降支，关闭胸腔、缝合皮肤和肌肉。小鼠进行30min缺血后拔线，待小鼠苏醒后，拔除气管插管，将其置于37℃保温毯上，24h取材。
[0032]
实施例1心脏超声心动图评价
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上述小鼠缺血再灌注损伤模型再灌注后24h，将四组小鼠分别放在5％异氟烷的麻醉箱中麻醉后，仰卧位固定于操作台上，以1％异氟烷维持麻醉；先找到胸骨旁长轴切面，保存b-mode数据，旋转探头90
°
获取小鼠心脏左心室胸骨旁短轴切面，胸骨旁短轴切面以左心室乳头肌水平的切面为标志点，用m型超声模式记录下左心室射血分数(lvef)，左心室短轴缩短率(lvfs)，左心室收缩末期内径(lvesd)，左心室舒张末期内径(lvedd)，左心室收缩末期容积(lvesv)，左心室舒张末期容积(lvedv)；胸骨旁长轴切面以左心室流出道水平切面为标志点，用b型超声心动图记录室壁运动图像。
[0034]
如上所述，wt小鼠分别术前腹腔注射玉米油和dmso、tch-165(50mg/kg)，并进行假手术或i/r手术；在i/r术后24h对小鼠进行经胸超声心动图检查，并计算左室射血分数lvef(ef％)和左室缩短分数fs(fs％)。
[0035]
检测结果如图1和图2所示，小鼠心肌i/r损伤后左心室收缩功能降低，如ef％和fs％的降低，而tch-165(50mg/kg)可明显逆转i/r手术处理的小鼠，lvef和fs较基线水平改善。
[0036]
实施例2 2，3，5-三苯基四氯化唑(ttc)染色
[0037]
上述将4组小鼠腹腔注射0.2ml三溴乙烷过饱和溶液，小鼠麻醉后进行固定，未造模两组(vehicle、tch-165)与i/r造模时一样结扎左前降支，而造过模的两组(i/r、tch-165 i/r)沿心梗造模肋间开口处，将心脏再次挤出，在上次结扎处再次将心脏左前降支结扎，在心尖处注射0.9ml4％伊文氏蓝染料，让其沿血流流向全身，可观察到小鼠全身变蓝；取下小鼠心脏用pbs清洗，将组织中的线取出，灌胶并将心脏放入-20℃冰箱冷冻定型30min，结束后将心脏放入模具中切成等厚的4个薄片并放入2％ttc染料中，37℃孵箱孵育30min，结束后将心脏切片放入4％组织固定液中固定一晚上，第二天取出拍照。
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检测结果如下：图3为梗死面积的代表性图像，其中，红色为危险区(aar),白色为梗死区域(infract area)；图4为危险区/左心室和梗死区/左心室的定量分析结果，结果显示，各组间危险面积(aar)与左心室(lv)面积比值无统计学差异，梗死面积占比较基线水平改善。
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实施例3 ldh测定
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6-8周雄性c57bl/6小鼠于假手术前1h分别腹腔注射玉米油和dmso、tch-165(20mg/kg)、tch-165(50mg/kg)，然后于24h后取血清冻于-80℃冰箱；小鼠血清40倍稀释用于测定ldh，按照说明书进行操作(南京建成生物工程研究所，a020-2)。
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检测结果如图5所示，ldh活性分析表明，20mg/kg及50mg/kg的tch-165剂量对小鼠心肌没有显著的毒性作用。
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实施例4蛋白酶体活性测定
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取组织，剪碎，超声，bca测浓度，20mg定量，将底物、缓冲液、抑制剂1、抑制剂2和荧光素检测试剂平衡至室温，按比例配制并在室温下静置30分钟；试剂与样品按1：1加入96孔板内，15min后在酶标仪上进行测定。
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检测结果如图6所示，i/r后糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样蛋白水解活性(蛋白酶体内β5i/β5、β2i/β2和β1i/β1三种亚基分别表现出糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)、胰蛋白酶样(trypsin-like)和半胱天蛋白酶样(caspase-like)蛋白水解活性)均下
降，而tch-165可以改善这种情况，并且无论假手术还是i/r术后，tch-165均能提高糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样蛋白水解活性。
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最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。