白喉酰胺在制备治疗或诊断DEDSSH的药物或试剂盒中的应用

白喉酰胺在制备治疗或诊断dedssh的药物或试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白喉酰胺修饰检测系统及检测方法与应用。


背景技术：

2.dph1基因(omim：616901)位于染色体17p13.3，其在人体各个组织及发育的各个阶段均可以表达。
3.研究表明，dph1基因常染色体隐性变异与一种罕见的神经发育障碍有关，通常称为dph1综合征或dedssh(developmental delay with short stature, dysmorphic facial features,and sparse hair，dedssh)。
4.dph1综合征的主要临床变现包括：身材矮小、牙齿异常、颅缝早闭、头发稀疏、精神运动发育迟缓、智力低下，以及面部畸形(包括三角头、舟状头、前额突出、小颔畸形、低耳位、眼距过宽、眉毛稀疏、塌鼻梁等)。dph1综合征或 dedssh通常于出生时发病，儿童时期可能会发生死亡。
5.目前，dph1综合征的诊断方法是通过提取疑似病人静脉外周血基因组，采用高通量测序，通过生物信息学与致病性分析，查询clinvar和hgdm数据库有无该突变的病例报道。通过gnomad和exac判断该突变在正常人群中的发生频率，采用mutation taster、pronean软件对dph1基因突变进行致病性预测。然而，大多情况下并不能通过突变而直接判断相关基因或蛋白的功能是否发生缺失或者增强，因此该种方法通常需将基因测序结果和病人临床症状相结合，进行推断。该方法所用时间周期长，及时性差，且费用高，诊断结果往往具有推断性，不能明确是否致病，缺乏明确的诊断依据。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供白喉酰胺在制备预防、治疗或诊断dph1综合征的药物或试剂盒中的应用，以解决采用现有方法无法明确判断白喉酰胺修饰程度，其判断结果仅为“猜测”式的技术问题。
7.本发明提供白喉酰胺在制备预防、治疗或诊断dph1综合征(或dedssh) 的药物或试剂盒中的应用。
8.可选地，所述药物是指提高白喉酰胺修饰水平的药物。
9.可选地，所述试剂盒是指检测白喉酰胺修饰水平的试剂盒。
10.如上所述，本发明的白喉酰胺在制备预防、治疗或诊断dph1综合征的药物或试剂盒中的应用，具有以下有益效果：
11.(1)白喉酰胺修饰水平降低，会造成dph1综合征，当外周血细胞蛋白上清液样本分别加入生物素化nad，假单胞菌外毒素a(促成白喉酰胺修饰)和 eef2抗体(均一化蛋白上清中eef2蛋白含量)后进行免疫印迹试验时，对照外周血的细胞蛋白上清液样本白喉酰胺偶联生物素显色的灰度值和eef2抗体免疫印迹灰度值的比值c与待测外周血蛋白上清液白喉
酰胺偶联生物素显色的灰度值和eef2抗体免疫印迹灰度比值p的比值c/p与dph1综合征具有一定相关性，故其可用于制备预防、治疗或诊断dph1综合征(或dedssh)的药物或试剂盒。
12.(2)本发明为dph1综合征的治疗和诊断提供了良好的理论基础和实践基础。
附图说明
13.图1为实施例1的灰度检测结果。
具体实施方式
14.以下通过特定的具体实例对本发明进行进一步的说明，但需要指出的是本发明的实施例中所描述的具体的物料配比、工艺条件及结果等仅用于说明本发明，并不能以此限制本发明的保护范围，凡是根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围内。
15.下面通过具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
16.实施例1
17.(一)细胞总蛋白上清液获取
18.分别获取待测抗凝外周全血淋巴细胞的总蛋白上清液和对照抗凝外周全血淋巴细胞的总蛋白上清液(对照为来自白喉酰胺表达水平处于正常水平的人体的对照外周血)，具体步骤如下：
19.(1)将待测抗凝外周全血5ml和5ml对照抗凝外周全血分别与等体积的无血清rpmi1640培养基(商品化，可购买)混匀，得到混合血液样本；
20.(2)向离心管中加入与抗凝外周全血等体积的淋巴细胞分离液(商品化，可购买)，将混合血液样本轻轻加入分离液中，随后于500g/min转速下水平离心 20min。
21.(3)离心后分层：离心后吸出淋巴细胞层，加入10ml无血清的rpmi1640 培养基(商品化，可购买)，混匀，接着于1500r/min转速下离心10min，离心后吸出淋巴细胞层，加入10ml无血清的rpmi1640培养基(商品化，可购买)，混匀，接着于1500r/min转速下离心10min，如此重复操作4次。
22.(4)将经步骤(3)处理后的样本中加入5ml eb病毒(人类疱疹病毒4型) 滤液中，作用15min后，加入2ml完全培养液，置于37℃，5vol％二氧化碳培养箱中培养。
23.(5)经过一周的培养，可见淋巴细胞明显增大，呈圆形或类圆形，形成大小不等的细胞团，2-3次换液后细胞增殖旺盛。
24.(6)收集20ml步骤(5)增殖培养的淋巴细胞，弃去上清液，保留细胞沉淀，向细胞沉淀中加入100ul带蛋白酶抑制剂的细胞裂解液ripa(radioimmunoprecipitation assay)(商品化，可购买)并混匀，冰上放置20min，然后于20khz超声频率下超声处理20s，冰上静置20min，4℃，14000r/min转速下离心15min，收集得到的细胞蛋白上清液。
25.(7)取5ul细胞蛋白上清液用bca蛋白浓度测定试剂盒(商品化，可购买) 测定样本
总蛋白浓度，对照细胞和待测细胞蛋白上清液的浓度均稀释到3ug/ul。
26.(二)对照灰度比值c与待测灰度比值p的比值c/p检测
27.(8)向细胞蛋白上清液(对照和待测细胞蛋白上清液的用量为：二者蛋白总量相同)中加入生物素化nad(商品化，可购买)和假单胞菌外毒素a(商品化，可购买)，生物素化nad的终浓度为10um/ul，假单胞菌外毒素a的终浓度为20ng/ul，混匀后，室温反应60min。加入wb上样缓冲液(商品化，可购买)混匀，直接进行免疫印迹试验western blot(wb)，所有样本不能蛋白变性处理，且免疫印迹试验的电泳液中不能添加十二烷基硫酸钠(sds)。
28.(9)wb实验结束后，将转移膜放入0.01％的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-hrp)(商品化，可购买)4℃过夜，第二天清洗后，用增强型化学发光试剂ecl(enhanced chemiluminescence)(商品化，可购买)发光显色。
29.(10)另取蛋白总量相同的且未经生物素化nad和假单胞菌外毒素a处理的浓度为3ug/ul的细胞蛋白上清液样本，加入wb上样缓冲液(商品化，可购买)混匀，95℃温度下处理5min后做wb，wb电泳液(商品化，可购买)中需加5％的sds，转膜封闭后，加入eef2抗体(商品化，可购买)，eef2抗体的终浓度为0.1μg/ml；4℃过夜，第二天敷辣根过氧化物酶二抗，清洗后用增强型化学发光试剂ecl(enhanced chemiluminescence)(商品化，可购买)发光显色。
30.(三)结果分析
31.(11)在全自动化学发光分析仪上，对wb结果进行显色拍照，结果如图1 所示。
32.(12)将图1所示结果图在quantity one软件上对wb显色条带进行灰度值测定，分别计算对照的灰度比值c(c＝对照白喉酰胺修饰/对照eef2)和待检测者的灰度比值p(p＝待测白喉酰胺修饰/待测eef2)，进而计算灰度比值c与灰度比值p的比值c/p。
33.(四)重复验证
34.按照步骤(一)-(三)检测另外两个待检测者的测样本的c/p，并记录不同病例的临床症状，结果如图1和表1所示。
35.表1检测结果
36.[0037][0038]
由表1和图1可知，c/p≥1.4，均存在dph1综合征的临床症状，当外周血细胞蛋白上清液样本分别加入生物素化nad，假单胞菌外毒素a(促成白喉酰胺修饰)和eef2抗体(均一化蛋白上清中eef2蛋白含量)后进行免疫印迹试验时，对照外周血的细胞蛋白上清液样本白喉酰胺偶联生物素显色的灰度值和 eef2抗体免疫印迹灰度值的比值c与待测外周血蛋白上清液白喉酰胺偶联生物素显色的灰度值和eef2抗体免疫印迹灰度比值p的比值c/p与dph1综合征具有一定相关性。该结果表明，白喉酰胺修饰水平降低，会造成dph1综合征，故其可用于制备预防、治疗或诊断dph1综合征(或dedssh)的药物或试剂盒。
[0039]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。