5-甲氧基黄酮在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于流感病毒预防治疗领域，具体涉及5-甲氧基黄酮在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.流感病毒为包膜rna病毒，属于正粘病毒科，分为为甲、乙、丙三型。由甲型病毒引起的急性上呼吸道传染性疾病的传染性强、传播速度迅速，给公众健康带来了严重威胁和给社会带来了严重的经济和医疗负担。由于流感病毒的基因易于突变，其抗原变异能力极强，使得疫苗的接种滞后而效果不显著。目前，批准用于临床治疗流感感染的药物有m2离子通道抑制剂：多金刚烷、金刚乙胺和神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦、扎那米韦。但经过监测多重流行的流感株已经发生耐药性。因此，新流行的流感随时都有可能爆发。面对这种状况，寻找具有抗流感药物就显得相当重要。
3.国内外的研究表明，宿主机体的过度免疫反应是导致肺脏组织损伤是其主要的致病机制之一。目前，临床上应用的糖皮质激素治疗急性及慢性的炎症显示良好的作用。但是报道显示2009年流行的h1n1流感病毒中，应用糖皮质激素治疗却提高病人的病死率。因此，使用糖皮质激素对流感引起免疫炎症治疗疗效具有有限性。流感病毒作为外来的病原体，其相关分子结构作为病原相关分子模式刺激机体细胞信号转导产生大量炎症反应。因此，研发出既能抗病毒又能阻断宿主细胞信号转导的化合物，可为临床治疗流感病毒感染提供新型的药物。
4.黄酮类化合物广泛存在于各种类型的植物中，因其抗炎、抗肿瘤、抑菌等多种生物活性而被受到广泛关注。值得注意的是，文献报道甲氧基化的黄酮化合物生物活性和口服生物利用度优于未甲基化的黄酮。5-甲氧基黄酮(5-methoxyflavone，5-mf)是一种在c5原子被甲基化的黄酮化合物，已有文献报道其具有抗癌的性质。但是，5-甲氧基黄酮对流感病毒引起的呼吸道疾病尚未报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的5-甲氧基黄酮在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.5-甲氧基黄酮在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用。
8.进一步地，所述5-甲氧基黄酮的结构式为：
[0009][0010]
进一步地，所述预防或治疗流感病毒感染的药物是以5-甲氧基黄酮作为药物活性成分制成的药剂。
[0011]
进一步地，所述流感病毒为甲型流感病毒。
[0012]
进一步地，所述流感病毒包括h1n1、h3n2和h9n2。
[0013]
进一步地，所述5-甲氧基黄酮由白茅根分离得到。
[0014]
5-甲氧基黄酮在制备用于抑制甲型流感病毒介导的炎症反应的药物中应用。
[0015]
5-甲氧基黄酮在抑制h1n1诱导a549细胞信号通路活化中的应用。
[0016]
5-甲氧基黄酮在改善h1n1感染导致肺部病变中的应用。
[0017]
一种预防或治疗流感病毒感染的药剂，以5-甲氧基黄酮作为药物活性成分。
[0018]
本发明的有益效果：本发明利用空斑技术证实5-甲氧基黄酮的抗流感病毒作用；采用luminex技术证实5-甲氧基黄酮在体外抑制甲型流感病毒h1n1感染a549细胞表达炎症因子；免疫印迹技术显示，5-甲氧基黄酮在体外抑制甲型流感病毒h1n1感染a549细胞活化nf-κb、p38mapk信号通路；同时，体内结果显示，5-甲氧基黄酮能改善流感病毒h1n1诱导肺病理损伤；因此，本发明披露的5-甲氧基黄酮可以作为一种新型的抗流感药物进行开发，为流感的预防和治疗提供新型的药物选择。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]
图1是利用细胞空斑法检测5-甲氧基黄酮对不同流感病毒株的抑制作用；
[0021]
图2是利用luminex技术检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)诱导人a549细胞表达系列炎症基因的作用；
[0022]
图3是利用免疫印迹技术检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)诱导细胞信号通路活化的作用；
[0023]
图4是检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)感染小鼠肺指数的影响；
[0024]
图5是利用h&e染色技术检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)感染小鼠肺部病理的影响。
具体实施方式
[0025]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它
实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
从白茅根中分离5-甲氧基黄酮；
[0027]
具体步骤如下：
[0028]
步骤一：取白茅根10kg，切碎后用95％的乙醇加热回流提取2次，第一次用10倍量溶剂提取2h，第二次用8倍量溶剂提取1.5h，合并提取液，减压回收得浸膏，将浸膏混悬在水中，依次用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚部位(56g)、乙酸乙酯部位(49g)和正丁醇部位(120g)；
[0029]
步骤二：对乙酸乙酯部位经硅胶柱色谱，并用用氯仿-甲醇(60:1～1:1)梯度洗脱，得到a～i个部位，d部分经反复的硅胶柱色谱，再经ods柱色谱，用甲醇-水(1:1)洗脱，再经sephadexlh-20纯化得到淡黄色化合物7.3mg，经鉴定化合物为5-甲氧基黄酮(c
16h12
o3)，纯度为98.5％。
[0030]
且5-甲氧基黄酮的结构式为：
[0031][0032]
利用细胞空斑法检测5-甲氧基黄酮对不同流感病毒株的抑制作用；
[0033]
具体步骤如下：
[0034]
步骤一：mdck细胞的准备；将长于100cm2培养皿中的mdck细胞加入1ml胰酶消化20min，用2ml完全培养基终止消化；转移至15ml离心管中离心1000rmp
×
5min；加入10ml完全培养基混匀重悬细胞后，种入6孔板中；置于孵箱中培养24h，观察细胞是否100％铺满6孔板底部，如铺满则可开始下述空斑实验；
[0035]
步骤二：病毒稀释；取ep管，做好标记，加入1080μl的dmem培养基；取120μl病毒液加入第一个ep管，于旋涡混合器上面混匀，从中取120μl加入到下一个ep管，以此类推根据病毒的存储浓度将病毒稀释至100pfu；
[0036]
步骤三：病毒感染mdck细胞；将6孔板取出，弃去完全培养基并用pbs洗2次细胞；加入稀释至100pfu的毒，置于培养箱中孵育2h，每隔20min取出摇匀一次；
[0037]
步骤四：铺琼脂；弃去病毒液，将含有相应药物浓度的dmem培养基(含有1μg/ml的tpck-trypsin)与等体积的70℃、2％琼脂糖溶液混合，并加入到6孔板中，静置5min；待琼脂凝固后，将6孔板倒扣置于37℃培养箱中孵育48h；
[0038]
步骤五：固定、染色；取出6孔板，加入2ml、4％甲醛固定2h；吸走4％多聚甲醛，加入结晶紫染色5min；弃去结晶紫，加入pbs洗涤6孔板，即可拍照保存结果；
[0039]
实验结果如图1所示，5-甲氧基黄酮能抑制不同流感病毒株[a/pr8/3/4(h1n1)、a/hk/8/68(h3n2)、a/hk/y280/97(h9n2)]导致空斑的出现。
[0040]
利用luminex技术检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)诱导人a549细胞表达系列炎症基因的作用；
[0041]
具体步骤如下：
[0042]
步骤一：将a549细胞以5
×
106的细胞密度种至6孔板，放置于培养箱中培养；待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入pbs洗涤两次，然后加入含流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)无血清的dmem/df12(1：1)培养基吸附细胞2h；用pbs洗涤细胞2次除去未吸附的病毒；
[0043]
步骤二：设置正常组、病毒组(模型组)、5-甲氧基黄酮干预组(10μm、20μm、30μm)和单独5-甲氧基黄酮处理组(20μm)；病毒组未添加药物干预；单独5-甲氧基黄酮处理组，其a549细胞未经病毒吸附。
[0044]
步骤三：药物干预24小时后，收集各组别的上清并移至1.5mlep管；置于4℃预冷的离心机中进行13000rpm离心15min；离心完毕，取上清进行小份分装，然后于-80℃冰箱中冻存，待检测时使用；
[0045]
步骤四：利用bio-plex悬浮芯片技术检测细胞细胞培养上清中炎症因子含量；
[0046]
1)平衡试剂盒：取出bio-plex悬液芯片检测试剂盒防止室温下，使其平衡。同时，取出细胞培养上去于冰上进行缓慢解冻；
[0047]
2)设置检测板：设置检测板上标准品孔、空白孔、样品孔的位置；
[0048]
3)按照试剂盒说明书，在检测板每孔加入50μl检测抗体和在检测板加入相应的样品；并置于96孔板摇床中300rpm孵育30min；
[0049]
4)孵育完毕进行洗涤检测板和加入报告抗体，在96孔板摇床300rpm孵育10min。
[0050]
实验结果如图2所示，5-甲氧基黄酮干预后明显抑制流感病毒诱导的炎症因子(il-6，il-8，tnf-α，ip-10，mcp-1，mip-1α，mip-1β，gm-csf)的水平；提示5-甲氧基黄酮干预可能通过抑制流感感染诱导过度炎症应答发挥治疗流感感染作用(与正常组比较，##p《0.01，###p《0.001；与h1n1组比较*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
[0051]
利用免疫印迹技术检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)诱导细胞信号通路活化的作用；
[0052]
具体步骤如下：
[0053]
步骤一：将a549细胞以5
×
106的细胞密度种至6孔板，放置于培养箱中培养；待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入pbs洗涤两次，然后加入含流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)无血清的dmem/df12(1：1)培养基吸附细胞2h；用pbs洗涤细胞2次除去未吸附的病毒；
[0054]
步骤二：设置正常组、病毒组(模型组)、5-甲氧基黄酮干预组(10μm、20μm、30μm)和单独5-甲氧基黄酮处理组(20μm)；病毒组未添加药物干预；单独5-甲氧基黄酮处理组，其a549细胞未经病毒吸附；
[0055]
步骤三：药物干预24小时后，弃去细胞培养上清，并用冷的pbs洗涤两次；洗涤完毕，加入200ul细胞裂解液ripa(含有蛋白酶抑制剂cocktail，其与细胞裂解液ripa体积比(v/v)为1：100加入及终浓度为10μm的pmsf)，进行提取细胞总蛋白；
[0056]
步骤四：将细胞裂解物移至1.5ep管并置于4℃预冷的离心机进行13000rpm离心15min；
[0057]
步骤五：离心完成后，按bca蛋白检测试剂盒说明书对细胞总提取物的蛋白浓度进行测定：取96孔板，加入10μl/孔的标准品及样品(2复孔)，然后逐孔加入bca检测工作液200μl/孔(配置工作液a:b＝1：50)，混匀后37℃孵育30min，于酶标仪于吸光度572nm测定od值；绘制标准曲线，根据标准品将样品od值转换为浓度；
[0058]
步骤六：sds聚丙烯酰胺凝胶的准备：
[0059]
配置10％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶：
[0060][0061]
充分混匀后并在在分离玻璃板间灌注，灌注完毕上层加入ddh20封住分离胶液面，等待30min分离胶凝结；
[0062]
步骤七：配置5％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶：
[0063][0064]
充分混匀后在分离玻璃板间灌注浓缩胶，灌注毕插入梳子，等待30min分离胶凝结；
[0065]
步骤八：变性蛋白：用5
×
蛋白上样缓冲液与各组样品(20μg)按体积与质量比(v/v)(μl/μl)的比例(1：4)混合，置于95℃金属加热器中变性蛋白10min；
[0066]
步骤九：上样和电泳：拔下梳子并逐孔加样；设定bio-rad垂直电泳仪90v恒压电泳，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时停止电泳；
[0067]
步骤十：转膜：预先甲醇激活pvdf膜15min；电泳结束后取下凝胶；按whatman3m滤纸-凝胶-pvdf膜-whatman3m滤纸的顺序叠放整齐后置于湿转负极板上；在冷库中，以380ma的恒流转膜2h；
[0068]
步骤十一：转膜结束后，加入5％脱脂奶粉(5％milk/tbst)封闭pvdf膜2h；
[0069]
步骤十二：抗体孵育：配置5％bsa/tbst，按1：1000比例将兔抗人p-ikbα抗体、兔抗人ikbα抗体、兔抗人p-p65抗体、兔抗人p65抗体、兔抗人p-p38抗体、兔抗人p38抗体、兔抗人p-erk1/2抗体、兔抗人erk1/2抗体稀释于5％bsa中；并置于4℃冰箱中过夜孵育；
[0070]
步骤十三：二抗孵育；隔夜后，取出pvdf膜并恢复至室温；用洗液tbst洗膜3次，5min/次后，加入辣根过氧化物酶(hrp)偶联的羊抗兔二抗，室温孵育1h；
[0071]
步骤十四：显影；移去二抗并用洗液tbst洗膜3次，5min/次；加入ecl免疫荧光化学发光显色剂显影；
[0072]
步骤十五：结果分析与整理；
[0073]
结果整理后如图3所示，5-甲氧基黄酮明显抑制流感a/pr8/3/4(h1n1)诱导人a549细胞信号通路nf-κb，p38mapk信号通路的活化。
[0074]
检测5-甲氧基黄酮对流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)感染小鼠肺部病理的影响；
[0075]
步骤包括：
[0076]
步骤一：将购自广东省医学实验动物中心4-6周龄spf级的c57/b6小鼠随机分成五组，分别为：正常组、h1n1组(模型组)、h1n1 5-甲氧基黄酮(20mg/kg/d)、h1n1 5-甲氧基黄酮(40mg/kg/d)；
[0077]
步骤二：提前两天灌胃给予5-甲氧基黄酮(20mg/kg/d，40mg/kg/d)；
[0078]
步骤三：将流感病毒a/pr8/3/4(h1n1)冻融后用无血清dmem/f12稀释成5ld50，小鼠经10％水氯合醛(质量/体积比)(m/v)麻醉后，经滴鼻50μl制备流感感染模型；正常组同法滴入等量的dmem/f12；
[0079]
步骤四：制备流感感染模型第7天，使用10％水氯合醛麻醉小鼠，解剖取肺脏测定肺指数(肺指数＝肺脏重量(g)/体重(g)
×
100)，评价小鼠体重及肺指数的变化；解剖取肺脏进行多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片和h&e染色，显微镜下观察小鼠肺脏病变和拍照。
[0080]
结果如图4中所示，其中h1n1组肺指数与正常组比较，明显升高，有明显差异(##p《0.01)；5-甲氧基黄酮干预组的肺指数与病毒组相比有统计学差异(*p《0.05)。
[0081]
肺脏病理结果如图5中所示，其中h1n1组肺部大量炎症细胞浸润，肺泡结构破环；5-甲氧基黄酮干预组明显改善h1n1感染导致的肺部病变。
[0082]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0083]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。