一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法

1.本发明属于生物传感技术领域，涉及疾病标志物检测，具体提供一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法。


背景技术：

2.随着医学和生物分子学的融合发展，重大疾病标志物检测成为了疾病诊断和治疗的重要组成部分；并且，随着越来越多的疾病标志物被发现和研究，疾病与标志物的相互关系也逐渐清晰，疾病与标志物之间不是一一对应关系，往往一种疾病有多种标志物，疾病的发展往往伴随着不同标志物的释放和吸收过程，而同一标志物也可能对应多种疾病；因此，单一疾病标志物检测已不能满足对疾病进行有效诊断的需求。除此之外，通过研究两种不同疾病的代表性标志物可以对疾病与疾病间的作用机理进行研究，因此，双标志物检测方法是具有现实意义的，尤其是快速、高灵敏的双标志物检测方法。
3.针对这一需求，被作为金标准的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)也被广泛应用于标志物检测中，例如文献“x.wu.,et al."optofluidic laser for dual-mode sensitive biomolecular detection with a large dynamic range."nature communications2014,5,3779”公开了激光elisa以实现高灵敏标志物检测，对白细胞介素-6探测极限达到了1fg/ml(38am)，但是该方法需要繁琐的前期处理过程和较为昂贵的标记试剂，并且预处理时间通常需要几个小时，若elisa被用于双标志物的检测方案中，对于前期处理的要求更高，时间更长，不利于临床和商业化。
4.相比之下，免疫比浊法作为一种无标记免疫分析方法，具有操作简单、快速检测的优势，但较低的检测灵敏度限制了其在标志物检测中的应用；针对这一问题，专利文献cn202010528691.8中通过粒子增强免疫比浊，放大信号，提高灵敏度，但是这种方法还是基于一次透射的光损耗，并不能从原理上对灵敏度有质的提升。而将激光引入到免疫比浊法中，是行之有效的方法，例如专利文献cn109490202a中公开了一种基于光微流激光的免疫比浊分析仪，通过激光和腔增强信号，实现高灵敏快速的蛋白质分子检测；进一步的，文献“yang,x.,et al."turbidimetric inhibition immunoassay revisited to enhance its sensitivity via an optofluidic laser."biosensors and bioelectronics 2019,131 60-66”中演示了免疫球蛋白g的高灵敏、快速检测，但该方法只演示了一种抗原检测，无法实现双标志物联合检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有激光免疫比浊法无法实现双标志物检测问题，提出一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法基于激光免疫比浊法，通过对传感方法的创新改进，实现了快速、高灵敏的双标志物检测，并且具有操作简单、流程清楚、更少试剂用量与样本量等优势。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，基于fp腔的光微流激光系统实现，其特征在于，所述双标志物检测方法具体包括以下步骤：
8.步骤1：配制待检测溶液；
9.首先，于待检测样品中加入第一抗原对应的第一抗体，并于37℃下孵育5～10分钟，然后，再加入第二抗原对应的第二抗体，并于37℃下孵育5～10分钟；最后，加入罗丹明6g作为激光染料，形成待检测溶液；
10.步骤2：采用移液器将待检测溶液拍打均匀，并注射到微流通道中，测量得到光微流激光强度积分值；
11.步骤3：将光微流激光强度积分值带入先验已知联合传感图谱，分别得到第一抗原与第二抗原的浓度；所述联合传感图谱为：
[0012][0013]
其中，y1与y2为先验选定常数；p1、p2、p3、q1、q2、q3为先验拟合参数，均为常数；f为光微流激光强度积分值，c1为第一抗原浓度，c2为第二抗原浓度。
[0014]
进一步的，所述联合传感图谱的计算过程为：
[0015]
设置第一抗原浓度的合集为(c
1,1
,c
1,2
,...,c
1,n
)、第二抗原浓度的合集为(c
2,1
,c
2,2
,...,c
1,m
)；固定第一抗原浓度为c
1,n
、n＝1,2,...,n，依次设置第二抗原浓度为(c
2,1
,c
2,2
,...,c
1,m
)，分别测量得到每个浓度组合(c
1,n
,c
2,m
)、m＝1,2,...,m下的光微流激光强度积分值；调节第一抗原浓度，重复此过程，最终测量得到每个浓度组合(c
1,n
,c
2,m
)、n＝1,2,...,n、m＝1,2,...,m下的光微流激光强度积分值；
[0016]
在每一个第一抗原浓度下，根据测量数据得到光微流激光强度积分值关于第二抗原浓度的拟合函数关系式：
[0017]fn
(y)＝kny bn、y＝lgc
2,m
[0018]
其中，kn、bn均表示拟合参数；
[0019]
任意选取两个y值：y＝y1、y＝y2，在y＝y1、y＝y2下，根据拟合光微流激光强度积分值fn(y1)、fn(y2)，分别得到fn(y1)、fn(y2)关于第一抗原浓度的拟合函数关系式：
[0020]fn
(y1)＝p1x q1、fn(y2)＝p2x q2、x＝lgc
1,n
[0021]
则得到先验拟合参数p1、p2、q1、q2；
[0022]
再根据拟合参数bn得到bn关于第一抗原浓度的拟合函数关系式：
[0023]bn
＝p3x q3[0024]
则得到先验拟合参数p3、q3；
[0025]
最终，得到光微流激光强度积分值关于第一抗原浓度与第二抗原浓度的联合传感图谱：
[0026][0027]
其中，f为光微流激光强度积分值，c1为第一抗原浓度，c2为第二抗原浓度。
[0028]
进一步的，待检测溶液中，第一抗体与第二抗体均保持过量、以确保免疫复合物的大小与体积同抗原浓度正相关，罗丹明浓度为0.16mm。
[0029]
进一步的，所述基于fp腔的光微流激光系统包括：光路模块、fp腔模块和数据采集模块；其中，光路模块包括：泵浦激光源1、第一反射镜2、第二反射镜3、衰减片4、分束镜5、凸透镜6及第三反射镜7，所述泵浦激光源提供泵浦激光，泵浦激光沿光路依次经过第一反射镜、第二反射镜、衰减片、分束镜、凸透镜、第三反射镜后以入射角度～10
°
入射到fp腔模块上；所述fp腔模块由两片高反镜9夹心两根方形管11构成，任意一根方形管作为微流通道、且两端连接软管10，另一根方形管作为支撑管，微流通道用于通入待测样本；所述数据采集模块包括：探头12、光谱仪13及能量计14，所述能量计通过分束镜实时监控泵浦激光的能量，所述探头位于fp腔模块正上方以收集光谱，且探头通过光纤连接光谱仪。
[0030]
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
[0031]
本发明提供一种基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法，从基本工作原理上讲：对于具有两种抗原的混合样本溶液，在加入第一抗原对应抗体后，激光强度会随着第一抗原抗体复合物产生而降低，再加入第二抗原对应的抗体后，激光强度会对第二抗原抗体复合物产生响应，表现为强度进一步降低，最终激光强度通过光微流激光强度积分值表征；在此基础上，本发明创造性的构建了针对第一抗原与第二抗原的先验联合传感图谱，将测量得到的光微流激光强度积分值带入先验联合传感图谱，直接得到第一抗原与第二抗原的浓度，检测灵敏度高，即实现高灵敏度双标志物检测；并且，整个检测过程在25分钟内，检测速度极快；同时，具有操作简单、流程清楚、更少试剂用量与样本量等优势；另外，本发明具有普遍适用性，能够应用到不同蛋白质检测中，还具有强特异性。
附图说明
[0032]
图1为本发明中基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法的系统结构示意图。
[0033]
图2为本发明中基于激光免疫比浊法的双标志物检测方法的原理示意图。
[0034]
图3为本发明实施例中针对心肌肌钙蛋白i(ctni)与免疫球蛋白g(igg)的光微流激光强度积分值测量结果。
[0035]
图4为本发明实施例中针对心肌肌钙蛋白i(ctni)与免疫球蛋白g(igg)的联合传感图谱。
具体实施方式
[0036]
为使本发明的目的、技术方案与有益效果更加清楚明白，下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0037]
针对双标志物联合检测的需求，本实施例提供一种基于激光免疫比浊法的快速、高灵敏的双标志物联合检测方法，该方法基于fp腔的光微流激光系统实现，该系统如图1所示，包括：光路模块、fp腔模块和数据采集模块；其中，光路模块包括：泵浦激光源1、第一反射镜2、第二反射镜3、衰减片4、分束镜5、凸透镜6及第三反射镜7，所述泵浦激光源提供泵浦激光，泵浦激光沿光路依次经过第一反射镜、第二反射镜、衰减片、分束镜、凸透镜、第三反射镜后以入射角度～10
°
入射到fp腔模块上，所述第一反射镜与第二反射镜用于抬高光路，所述衰减片用于控制泵浦能量，所述凸透镜用于实现泵浦激光汇聚，所述第三反射镜用于保证泵浦激光的入射角度；所述fp腔模块由两片高反镜9夹心两根方形管11构成，任意一根方形管作为微流通道、且两端连接软管10，另一根方形管作为支撑管，微流通道用于通入待
测样本；所述数据采集模块包括：探头12、光谱仪13及能量计14，所述能量计通过分束镜实时监控泵浦激光的能量，所述探头位于fp腔木块正上方以收集光谱，且探头通过光纤连接光谱仪。
[0038]
基于fp腔的光微流激光系统上述fp腔的光微流激光系统，本实施例中双标志物联合检测方法的检测原理示意图如图2所示，具体包括以下步骤：
[0039]
步骤1：配制待检测溶液；
[0040]
首先，于待检测样品中加入第一抗原对应的第一抗体，并于37℃下孵育15～0分钟(产生第一抗原对应的抗原抗体复合物)，然后，再加入第二抗原对应的第二抗体，并于37℃下孵育5～10分钟(产生第二抗原对应的抗原抗体复合物)；最后，加入罗丹明6g作为激光染料，形成待检测溶液；加入的抗体均保持过量、以确保产生的免疫复合物的大小和体积与抗原浓度正相关，罗丹明6g浓度为0.16mm；
[0041]
步骤2：采用移液器将待检测溶液拍打均匀，并注射到微流通道中，测量得到光微流激光强度积分值；
[0042]
步骤3：将光微流激光强度积分值带入先验已知联合传感图谱，分别得到第一抗原与第二抗原的浓度；所述联合传感图谱为：
[0043][0044]
其中，y1与y2为先验选定常数；p1、p2、p3、q1、q2、q3为先验拟合参数，均为常数；f为光微流激光强度积分值，c1为第一抗原浓度，c2为第二抗原浓度；
[0045]
进一步的，从工作原理上讲，上述联合传感图谱的计算过程为：
[0046]
设置第一抗原浓度的合集为(c
1,1
,c
1,2
,...,c
1,n
)，第二抗原浓度的合集为(c
2,1
,c
2,2
,...,c
1,m
)；固定第一抗原浓度为c
1,n
、n＝1,2,...,n，依次设置第二抗原浓度为(c
2,1
,c
2,2
,...,c
1,m
)，分别测量得到每个浓度组合(c
1,n
,c
2,m
)、m＝1,2,...,m下的光微流激光强度积分值；调节第一抗原浓度，重复此过程，最终得到每个浓度组合(c
1,n
,c
2,m
)、n＝1,2,...,n、m＝1,2,...,m下的光微流激光强度积分值；
[0047]
根据测量数据可以得到在第一抗原的浓度为固定值时、光微流激光强度积分值关于第二抗原浓度的拟合函数关系式：
[0048]fn
(y)＝kny bnꢀꢀ
(1)
[0049]
y＝lgc
2,m
、m＝1,2,...,m
ꢀꢀ
(2)
[0050]
对于式(1)中的kn，kn任由传感曲线上的两个点就可以计算得到，那么，任意选取两个y值：y＝y1、y＝y2，则得到：
[0051]fn
(y1)＝kny1 bnꢀꢀ
(3)
[0052]fn
(y2)＝kny2 bnꢀꢀ
(4)
[0053]
则，kn表示为：
[0054][0055]
进一步的，对于式(5)中fn(y1)与fn(y2)，即第二抗原浓度为固定值(y＝y1、y＝y2)时，fn(y1)与fn(y2)(光微流激光强度积分值)又只与第一抗原浓度相关，则拟合得到fn(y1)、fn
(y2)关于第一抗原浓度的函数关系式：
[0056]fn
(y1)＝p1x q1ꢀꢀ
(6)
[0057]fn
(y2)＝p2x q2ꢀꢀ
(7)
[0058]
x＝lgc
1,n
、n＝1,2,...,n
ꢀꢀ
(8)
[0059]
对于式(1)中的bn，其表示fn的截距值，即bn的取值只与第一抗原浓度相关，则根据测试数据可以拟合得到bn关于第一抗原浓度的函数关系式：
[0060]bn
＝p3x q3ꢀꢀ
(9)
[0061]
联立上述所有式子得到光微流激光强度积分值关于第一抗原浓度与第二抗原浓度的函数关系式：
[0062][0063]
其中，y1与y2为预先选取定值；p1、p2、p3、q1、q2、q3为上述式(6)、(7)、(9)中函数关系表达式中的拟合参数值，均为根据测试数据拟合得到的常数；f为光微流激光强度积分值，c1为第一抗原浓度，c2为第二抗原浓度；
[0064]
基于此，上述函数关系式则直接作为光微流激光强度积分值关于第一抗原浓度与第二抗原浓度的联合传感图谱，针对待检测溶液，基于该联合传感图谱则能够实现第一抗原与第二抗原的双标志物联合检测。
[0065]
更为具体的讲：本实施例中，对第一抗原：肌钙蛋白(ctni)与第二抗原：免疫球蛋白(igg)浓度进行联合检测；首先需要构建联合传感曲线，具体过程为：
[0066]
首先，将第一抗原标准液和第二抗原标准液按照10倍浓度梯度稀释，得到一系列第一抗原浓度溶液(样本液a)和第二抗原浓度溶液(样本液b)；再分别配置得到待检测溶液：取10μl样本液a和4μl样本液b加入到225μl缓冲液中、并于37℃下孵育5分钟，再加入12μl第一抗体、并于37℃下孵育10分钟，再加入12μl第二抗体、并于37℃下孵育10分钟，得到复合抗原抗体混合液，最后于复合抗原抗体混合液中加入1.5mm的rh6g水溶液，得到待检测溶液，其中染料浓度为0.16mm；
[0067]
然后，将上述一系列待检测溶液依次拍打均匀后注入微流通道中，分别测量得到对应的光微流激光强度积分值；测量过程中保持泵浦激光的光强不变、入射角度不变，每次通入待检测溶液前都需用超纯水清洗微流通道，防止上一个浓度下残留待测液的干扰；
[0068]
最后，根据先验已知第一抗原浓度、第二抗原浓度及其组合下测量得到的光微流激光强度积分值，进行数据处理，得到联合传感图谱：
[0069]
第一抗原浓度依次为26.55fm、265.5fm与2655fm下，第二抗原浓度依次为7.35fm、7.35
×
101fm、7.35
×
102fm、7.35
×
103fm、7.35
×
104fm、7.35
×
105fm，分别测量得到光微流激光强度积分值如图3所示，其中，f1，f2与f3分别表示第一抗原浓度为26.55fm、265.5fm与2655fm，分别拟合为：
[0070]
f1＝-18162y 190837
[0071]
f2＝-15046y 157406
[0072]
f3＝-6035y 118021
[0073]
选取y1＝0、y2＝0.887，当y1＝0时，则fn＝bn，将fn(y1)、fn(y2)分别与第一抗原得浓度线性拟合得到：
[0074]fn
(y1＝0)＝bn＝p1x q1＝p3x q3＝-33555x 234859
[0075]fn
(y2＝0.887)＝p2x q2＝-28881x 212584
[0076]
即：y1＝0、y2＝0.887，p1＝p3＝-33555、p2＝-28881，q1＝q3＝234859、q2＝212584，进而得到联合传感图谱；基于此联合传感图谱，则能够实现第一抗原：肌钙蛋白(ctni)与第二抗原：免疫球蛋白(igg)浓度的联合检测。
[0077]
更进一步的，本实施例在第一抗原依次浓度为26.55fm、50fm、100fm、200fm、265.5fm、400fm、800fm、1600fm与2655fm下，第二抗原浓度范围取值在实际测量范围内(如图4所示)，进一步得到联合传感图谱如图4所示；其中，l1至l9依次表示了第一抗原浓度为26.55fm、50fm、100fm、200fm、265.5fm、400fm、800fm、1600fm、2655fm的第二抗原的传感曲线，由图可见，该联合传感图谱中每一个积分强度值唯一对应一组第一抗原与第二抗原浓度值，即基于该联合传感图谱能够实现第一抗原：肌钙蛋白(ctni)与第二抗原：免疫球蛋白(igg)浓度的高灵敏度的联合检测，并且联合检测时间在25分钟以内。
[0078]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本说明书中所公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换；所公开的所有特征、或所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以任何方式组合。