利鲁唑靶向治疗Wolfram综合征

利鲁唑靶向治疗wolfram综合征
技术领域
1.本发明涉及医药领域，特别是涉及利鲁唑在制备药物或试剂盒中的用途。


背景技术：

2.wolfram综合征是一种常染色体隐性遗传疾病，由wfs1基因功能丧失突变引起的。wolfram综合征的特征是青少年发病的糖尿病、尿崩症、双侧视神经萎缩、耳聋以及广泛的神经和精神病学表现，包括脑干和小脑萎缩、周围神经病变、癫痫、认知能力下降、抑郁和焦虑，大多数患者死于脑干萎缩和神经病变引起的呼吸衰竭。分子遗传学研究显示90％的ws患者存在wfs1基因功能丧失突变，wfs1编码位于er膜上的跨膜蛋白wolframin(wfs1)，在脑、心脏和胰腺中有较高表达。随着患者年龄的增长，wolfram综合征的发病率和死亡率不断增高。患有ws的患者的平均预期寿命是30岁，目前尚无特异性和有效的治疗方法，对ws尤其是神经病变的有效治疗方法亟待研发。
3.根据已有研究报道，wolfram综合征的致病机制主要是由wfs1基因突变引起的以下几方面问题：内质网高水平持续应激引起未折叠蛋白反应、内质网钙离子稳态失衡、线粒体功能障碍等。针对多方面的致病机理，研究人员对wolfram综合征的药物研发也从不同方面寻找药物靶点。wolfram综合征的常见分子特征是由wfs1等位基因突变导致wfs1蛋白结构突变，从而引起细胞内质网应激。研究人员针对这一特性，测试了相关可优化突变wfs1蛋白结构的化学分子伴侣，如4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid)和牛磺去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid)，可恢复或稳定突变的wfs1蛋白的天然构象来减轻内质网应激，从而减少蛋白质聚集。针对wolfram综合征中高水平内质网应激，研究人员发现丙戊酸(valproic acid)可诱导wfs1表达并调节内质网应激反应，对出现的细胞凋亡提供保护作用，此药物正在进行第2阶段双盲试验；研究发现在啮齿类动物模型和细胞模型中，胰高血糖素样肽受体激动剂(glp-1receptor agonists)可抑制细胞凋亡。针对内质网钙离子稳态失衡，研究人员发现已获得fda批准的用于治疗恶性体温过高和肌肉痉挛的药物丹曲林钠(dantrolene sodium)，可以通过靶向内质网钙离子转运蛋白来充当内质网钙离子稳定剂。研究发现dantrolene sodium可以抑制wolfram综合征小鼠模型中神经元和β细胞以及诱导多能干细胞(ipscs)模型中的细胞凋亡和功能障碍，目前此药物正在进行2期临床试验，以评估其在儿童和成人中的功效、安全性和耐受性。针对wolfram综合征中线粒体的功能障碍，尚无相关的药物研究，一些恢复线粒体功能的线粒体调节剂可进行进一步的研究。同时，也有研究从基因疗法和细胞替代疗法的角度，探索未来对患者突变细胞进行修复或者再生正常细胞进行替代治疗的可能性。综上所述，目前已有的药物研究主要针对wfs1基因突变引起的细胞自身内质网应激、内质网钙离子稳态失衡导致的缺陷。
4.星型胶质细胞一直以来被认为是一种重要的细胞类型，它的数量将近占大脑细胞的一半，为神经元提供必要的支持。近年来，研究发现星型胶质细胞与多种神经发育和神经退行性疾病相关的致病机制有紧密的联系，功能异常的星型胶质细胞会导致神经元凋亡，轴突和树突生长减少以及突触形成受损。其中，星型胶质细胞调节谷氨酸稳态的失衡是多
种疾病的核心特征。在阿尔茨海默氏病中，β淀粉样蛋白诱导体外神经元和星型胶质细胞释放谷氨酸，抑制星型胶质细胞中glt-1和glast的水平，导致星型胶质细胞谷氨酸摄取能力降低。唐氏综合症患者特异性ipscs衍生的星型胶质细胞会诱导神经元细胞凋亡，并且无法促进神经元成熟和突触形成。在果蝇神经元和神经胶质细胞中敲低wfs1，会导致果蝇过早死亡，并显著加剧果蝇的行为缺陷和神经退行性病变，这表明wfs1在两种细胞类型中均具有重要功能。目前，wfs1在星型胶质细胞中的作用和功能尚不清楚，并且对wfs1缺乏对星型胶质细胞的影响以及其对神经元的影响仍未知。因此，我们将利用人胚胎干细胞研究wfs1在星型胶质细胞中的作用，并且靶向星型胶质细胞对神经元的影响，首次进行相关的药物研发。
5.目前，对于wolfram综合征的神经病变尚无特异性和有效的治疗方法，对已获得监管机构批准的药物进行再研发，从安全性、耐受性和不良反应方面都极具优势，通常来说是对于研发wolfram综合征药物最快速、有效的方式。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供利鲁唑在制备药物或试剂盒中的用途，用于解决现有技术中的问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供利鲁唑在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：
8.1)治疗wfs1基因异常相关疾病；或，
9.2)治疗wolfram综合征。
10.在本发明一些实施方式中，所述利鲁唑是单一有效成分。
11.在本发明一些实施方式中，所述wfs1基因异常为wfs1低表达。
12.在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗谷氨酸摄取异常相关的wfs1基因异常相关疾病。
13.在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗谷氨酸摄取异常相关的wolfram综合征。
14.在本发明一些实施方式中，所述谷氨酸摄取异常为谷氨酸水平升高。
15.在本发明一些实施方式中，所述谷氨酸摄取异常为glt-1基因异常导致的谷氨酸摄取异常。
16.在本发明一些实施方式中，所述glt-1基因异常为glt-1低表达。
17.在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗神经元损伤相关的wfs1基因异常相关疾病，所述神经元损伤为神经元的形态结构缺陷和/或神经元凋亡。
18.在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗神经元损伤相关的wolfram综合征，所述神经元损伤为神经元的形态结构缺陷和/或神经元凋亡。
附图说明
19.图1显示为本发明实施例3中wfs1敲除组与对照组之间的神经元的树突长度和分支数量的对比结果示意图。
20.图2显示为本发明实施例3中wfs1敲除组与对照组之间的神经元的树突棘数量的
对比结果示意图。
21.图3显示为本发明实施例3中wfs1敲除组与对照组之间的神经元数量的对比结果示意图。
具体实施方式
22.为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本技术发明的其他优点及功效。
23.为了简便，本技术仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围，以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
24.在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两种以上。
25.本发明的上述发明内容并不意欲描述本发明中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施方式提供了指导，这些实施方式可以以各种组合形式使用。在各个实施方式中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
26.本发明第一方面提供利鲁唑在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于治疗wfs1基因异常相关疾病和/或wolfram综合征。在人胚胎干细胞中敲除wfs1基因后，通过体外诱导分化将wfs1基因敲除的胚胎干细胞诱导分化为wfs1敲除的神经前体细胞(npcs)、神经元(neurons)和星型胶质细胞(astrocytes)。本发明发明人发现，当对照组神经元(wt neurons)和wfs1敲除星型胶质细胞(wfs1-/-astrocytes)共培养之后，会明显引起神经元的凋亡，且会对神经元的结构会带来明显的缺陷，而wfs1敲除星型胶质细胞本身则会发生谷氨酸稳态受损，但是，当上述细胞出于利鲁唑存在的条件下时，星型胶质细胞的凋亡水平被逆转神经元损伤的情况也被改善，从而证明了利鲁唑能够用于治疗wfs1基因异常相关疾病和/或治疗wolfram综合征。
27.利鲁唑(cas号：1744-22-5，分子式：c8h5f3n2os，2-氨基-6-三氟甲氧基苯并噻唑)，化学结构式如下所示：利鲁唑是一种已经被批准的能够用于治疗als的药物。
28.本发明所提供的药物或试剂盒中，利鲁唑可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，共同地用于治疗wfs1基因异常相关疾病和/或wolfram综合征。
29.本发明所提供的药物或试剂盒中，wfs1基因异常通常表现为wfs1低表达。wfs1低表达可以是指wfs1表达的缺失、或wfs1的表达水平低于一定的标准，这一表达可以是分子水平上的，也可以是蛋白水平上的。例如，wfs1低表达可以是神经前体细胞、神经元、或星型
series methods in enzymology，academic press，san diego；wolffe，chromatin structure and function，third edition，academic press，san diego，1998；methods in enzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarman and a.p.wolffe，eds.)，academic press，san diego，1999；和methods in molecular biology，vol.119，chromatin protocols(p.b.becker，ed.)humana press，totowa，1999等。
40.实施例1
41.构建wfs1基因敲除的人胚胎干细胞系
42.1、质粒构建
43.a、质粒设计及sgrna筛选
44.利用工具网站(http://crispr.mit.edu/)针对人wfs1基因靠近5’端第一个编码外显子设计2条sgrna，并将其通过pcr与酶切连接的方式插入携带cas9蛋白基因与嘌呤霉素抗性基因的载体中(p2u6)。根据sgrna打靶位置与脱靶率评分高低，筛选出如下sgrna：
45.sgrna1：attgagtcgggaacgcgcc(seq id no.1)
46.sgrna2：gcggagcagtgttggagtc(seq id no.2)
47.质粒序列如下：
48.aattgaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgattgagtcgggaacgcgccgtttttctagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgtttaaacacacggttcctagtatcggtccgaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggactccaacactgctccgcgtgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcg
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49.b、质粒转化及测序
50.提前将克隆用的化学感受态细胞dh5α置于冰上解冻，取连接产物10μl加到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀，于冰上静置25min。42℃水浴热激45s后，放置到冰上冷却2min。加入900μl不含抗生素的lb液体培养基(超净台中操作)，在37℃下摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应抗性的lb固体培养基平板在37℃培养箱中预热，5000rpm离心1min，弃掉900μl上清，用100μl左右重悬细胞后加到平板上，用涂布珠涂平板，于37℃培养箱中倒置培养12至16h。之后挑取单克隆送测序公司进行测序，挑选连接成功的质粒，开展大规模的质粒抽提。
51.2、胚胎干细胞培养条件：
52.a、将1:80稀释的基质胶(corning,#354230)铺在细胞培养皿上，37℃孵育1h以使胶凝固；用dmem/f12(invitrogen，#11330-082)培养基洗两遍。
53.b、将人类胚胎干细胞(hues8)接种，使用商品化的mtesr培养基(stem cell,#85850)进行培养，并在培养第一天加入1000x稀释的y27632(stem cell,#72304)。
54.c、将细胞置于37℃，含5％的co2培养箱中进行细胞培养，在第二天全部换液，撤去培养基中的y27632。之后细胞每3-4天进行传代。
55.3、质粒电转与细胞系筛选
56.a、将胚胎干细胞培养至80％左右的密度后tryple进行消化，并用40μm的细胞滤网对细胞进行过滤，使其分散成为单个细胞；
57.b、取总量约为0.5m左右的细胞通过电转染的方式使携带sgrna及cas9蛋白基因的质粒进入细胞当中(参见seq id no.3)；
58.c、在电转之后，将胚胎干细胞在mtesr培养基中重新悬浮后接种到3.5cm的细胞培养皿中培养两天，之后加入500ng/ml的嘌呤霉素进行细胞筛选。培养48-60h后，移除嘌呤霉素，每天更换培养基直至克隆长至30-50μm大小；
59.d、挑取单克隆细胞，将其转移到96孔板中进行扩大培养，取部分细胞用ripa裂解液裂解后进行细胞基因组提取，通过测序来验证wfs1基因是否被敲除。测序结果表明，wfs1的第一个编码外显子有49bp(19-67del)被敲除，导致终止密码子提前，基因终止表达。
60.4、将胚胎干细胞体外诱导分化为神经前体细胞(npcs)、神经元(neurons)和星型胶质细胞(astrocytes)
61.在人胚胎干细胞系中敲除wfs1基因后，通过胚样小体(eb)的诱导方法，手工挑取含有玫瑰花样结构的富含npcs的区域进行扩增培养，通过对npcs的阶段特异性标记物sox2、nestin和musashi进行免疫荧光染色来鉴定npcs的特性，建立相应的npcs用于后续实验。进一步将bfgf从n2/b27培养基中撤出，可使npcs向neurons分化。基于星型胶质细胞在体的分化与成熟的自然过程，先诱导npcs产生神经球(neurospheres)，随着分化时间的延长，神经球可迁移、生长产生gfap阳性的星型胶质细胞。实验结果表明，由上述公开的实验方法可获取wfs1敲除的神经前体细胞、神经元和星型胶质细胞。
62.实施例2
63.wfs1敲除对星型胶质细胞的影响以及其对神经元的影响
64.为了研究wfs1敲除星型胶质细胞对神经元的影响，利用神经元和星型胶质细胞共培养体系(neurons-astrocytes co-culture)来进行实验验证。具体方案如下：首先npcs通过感染慢病毒表达神经元特异性启动子(synapsin1)启动的gfp，然后将慢病毒感染的npcs向神经元分化3周，获得syn::gfp标记阳性的神经元。同时根据之前已建立好的分化体系，将wfs1敲除组和对照组的npcs向星型胶质细胞进行分化。接着将诱导分化形成的wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞(细胞数为3*105)与分化3周的syn::gfp标记阳性的神经元(细胞数为2*105)进行共培养3天，在第三天用4％pfa将细胞进行固定，准备进行后续的实验。通过对固定的细胞进行神经元标记物map2、突触前标记物syn1免疫荧光染色，然后对syn::gfp和map2阳性的神经元的树突分支数量和长度进行统计，同时对syn1在syn::gfp和map2阳性的神经元的树突上的密度进行统计，对比神经元分别与wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞共培养之后的树突生长和突触形成差异。同时，我们对syn::gfp和map2阳性的神经元
数量进行了统计，对比与wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞共培养之后神经元的存活率。
65.实验结果表明，与对照组相比，神经元与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养之后，神经元的树突长度和分支数量显著减少，每个神经元的树突棘数量显著增加，说明神经元的树突生长和突触形成受到了影响。同时，与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养之后，syn::gfp和map2阳性的神经元数量显著降低，说明神经元的存活率也受到了影响。
66.进一步为了研究wfs1敲除星型胶质细胞是如何对神经元产生影响的，对wfs1敲除星型胶质细胞进行了一系列的实验。首先我们将诱导分化形成的wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞种植相同的细胞数(3*105)，培养两天后，换新鲜的培养基并分别在48小时和96小时收集100μl培养基，随后对谷氨酸水平进行检测。同时，我们收取了wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞的细胞样品，通过提取rna，分析了与星型胶质细胞谷氨酸摄取相关的转运体的mrna水平的表达。实验结果表明，与对照组相比，wfs1敲除组的星型胶质细胞中谷氨酸水平显著升高，说明谷氨酸代谢出现异常，同时发现谷氨酸转运体glt-1的mrna水平在wfs1敲除组的星型胶质细胞中显著降低，说明谷氨酸的摄取出现了问题。
67.综上所述，wfs1敲除星型胶质细胞对神经元的树突生长、突触形成和存活率会产生影响，其作用机制可能是由于wfs1敲除星型胶质细胞中谷氨酸转运体glt-1的表达水平降低而引起的谷氨酸代谢异常。
68.实施例3
69.利鲁唑对wfs1敲除星型胶质细胞对神经元影响的治疗作用
70.为了研究利鲁唑对wfs1敲除星型胶质细胞对神经元影响的治疗效果，首先，在诱导分化形成的wfs1敲除组和对照组星型胶质细胞(细胞数为3*105)与分化3周的syn::gfp标记阳性的神经元(细胞数为2*105)共培养的体系中，加入5-100μm的利鲁唑48h进行药物梯度实验，发现细胞在10μm以上的药物浓度，会出现严重细胞凋亡的情况，随后把浓度降到了5μm和10μm。在对比了5μm和10μm两个浓度后，发现5μm的细胞状态良好，治疗的实验指标更好，因此后续实验的药物浓度都为5μm，培养时间为48h。通过对细胞进行map2和syn1免疫荧光染色，对syn::gfp和map2阳性的神经元的树突分支数量和长度、syn1在syn::gfp和map2阳性的神经元树突上的密度进行统计，对比在加入利鲁唑后与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养的神经元的树突生长和突触形成是否有差异。
71.同时，对syn::gfp和map2阳性的神经元数量进行了统计，对比在加入利鲁唑后与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养的神经元的存活率。
72.如图1和图2所示，实验结果表明，在加入利鲁唑后，与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养的神经元的树突长度和分支数量显著增加，每个神经元的树突棘数量显著降低，并且恢复到了与对照组星型胶质细胞共培养的神经元的形态结构，说明利鲁唑对wfs1敲除星型胶质细胞引起的神经元形态结构的缺陷有显著的治疗作用。
73.同时，如图3所示，在加入利鲁唑后，与wfs1敲除组星型胶质细胞共培养的神经元数量也显著提升，说明利鲁唑对wfs1敲除星型胶质细胞引起的神经元凋亡有显著的抑制作用。
74.综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
75.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。