一种氟硼二吡咯荧光团在内质网超分辨成像中的应用

1.本发明属于细胞器超分辨成像领域，具体涉及一种可用于示踪活细胞中内质网局部结构和疏水性变化的的氟硼二吡咯荧光探针。


背景技术：

2.内质网(endoplasmic reticulum,er)是细胞内最大的细胞器，是由片层和管状膜结构组成的连续的细胞内网络。鉴于er在钙稳态、脂质和蛋白质合成、细胞间相互作用和天然免疫等方面的重要作用，动态改变er的形状和大小以适应er微环境的波动对细胞内稳态至关重要。自噬是真核细胞中发生的一种高度保守的细胞过程，它通过破坏细胞质中的细胞器、蛋白质和大分子来清除损伤结构(例如,错误折叠的蛋白质)、恢复组分或产生能量。内质网自噬与多种人类疾病相关，如食管鳞状上皮癌、结直肠癌、过敏性鼻炎、血管疾病、病毒感染、癌症以及阿尔茨海默病等(h
ü
bner,c.a.&dikic,i.er-phagy and human diseases.cell death.differ.27,833-842(2020).)。选择性自噬(内质网自噬)可以清除多馀或损伤的er，因此，选择性识别er被自噬体吞噬并转运至溶酶体降解的特定部位，对er的蛋白质质量控制有重要意义。
3.尽管探针已被开发用于可视化内质网，但大都用于传统显微成像，该有限的分辨率限制了对er局部变化的细节观察(zhu,z.,wang,q.,liao,h.,liu,m.,liu,z.,zhang,y.&zhu,w.trapping endoplasmic reticulum with amphiphilic aie-active sensor via specific interaction of atp-sensitive potassium(k
atp
).natl.sci.rev.8,nwaa198(2021)；chen,j.,han,g.,liu,z.,wang,h.,wang,d.,zhao,j.,liu,b.,zhang,r.&zhang,z.recovery mechanism of endoplasmic reticulum revealed by fluorescence lifetime imaging in live cells.anal.chem.94,5173-5180(2022).)。针对这一缺点，研究人员利用结构照明显微镜(sim)克服abbe衍射极限，从而以约100nm的分辨率进行成像。在前期的工作中，人们开发了一系列用于超分辨sim成像的探针，通过检测亚细胞器的形态来观察亚细胞动力学和局部变化(chen,q.,jin,c.,shao,x.,guan,r.,tian,z.,wang,c.,liu,f.,ling,p.,guan,j.,ji,l.,wang,f.,chao,h.&diao,j.super-resolution tracking of mitochondrial dynamics with an iridium(iii)luminophore.small 14,1802166(2018)；fang,h.,yao,s.,chen,q.,liu,c.,cai,y.,geng,s.,bai,y.,tian,z.,zacharias,a.l.,takebe,t.,chen,y.,guo,z.,he,w.&diao,j.de novo-designed near-infrared nanoaggregates for super-resolution monitoring of lysosomes in cells,in whole organoids,and in vivo.acs nano 13,14426-14436(2019).)。此外，人们还开发了一种基于超分辨成像所揭示的细胞器形态特征来表征内质网的方法(fang,h.,geng,s.,hao,m.,chen,q.,liu,m.,liu,c.,tian,z.,wang,c.,takebe,t.,guan,j.,chen,y.,guo,z.,he,w.&diao,j.simultaneous zn
2
tracking in multiple organelles using super-resolution morphology-correlated organelle identification in living cells.nat.commun.12,109(2021).)。但是，由于内质网的动力学性质，仅报道细胞器的大小和形状并不足以定量
检测和分析应激诱导的细微内质网自噬。因此，亟需一个用于监测局部内质网自噬水平变化的探针。


技术实现要素：

4.为了克服仅利用形态学检测内质网自噬的局限性，本发明建立了一种"储备-释放"机制，用于构建环境敏感、光稳定、低毒的sim探针er-bdp。由于疏水性的改变，er-bdp荧光强度的变化可以表明应激引起的内质网损伤。因此，通过将这种损伤的程度和位置与纳米显微镜所揭示的er-bdp荧光强度的分布相关联，本发明可以在亚细胞器水平上对内质网自噬进行局部强度相关检测。
5.本发明具体技术方案如下：
6.氟硼二吡咯化合物在制备内质网成像荧光探针中的应用，所述氟硼二吡咯化合物具有如下结构：
[0007][0008]
其中r1和r2相同或者不同，选自h或c1-c10的烷基，优选h、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
[0009]
所述氟硼二吡咯化合物一个优选的结构为：
[0010][0011]
本发明所述荧光探针为疏水性响应型荧光探针。
[0012]
本发明所述的应用，所述探针用于内质网超分辨成像，在200nm以下分辨率水平成像内质网的局部精细结构。
[0013]
现有技术下，超分辨成像的难点在于需要克服光漂白和荧光背景干扰的影响。本发明提出了一种“保留-释放”机制，探针在正常条件下保持聚集状态，并“保留”其荧光信号。受激后，荧光会通过解聚集过程“释放”。基于上述技术构思，选择易于形成π-π堆积的氟
硼二吡咯(bodipy)作为荧光母核。该分子在水溶液中容易发生聚集猝灭(acq)，而其在疏水环境中的解聚集释放荧光信号。进一步将荧光母核通过苯环连接对甲苯磺酰胺基团，能够与内质网中的k

通道结合，使该结构具有内质网靶向能力。此外，该荧光探针还具有分子内氢键，可以提高探针的聚集能力，从而改善“保留-释放”效应。
[0014]
本发明所述的荧光探针具有低背景噪声和抗聚集淬灭的光漂白能力，靶向内质网后，内质网损伤时，周围的疏水性增强使荧光探针解聚集释放荧光。
[0015]
进一步的，本发明所述的荧光探针可以用于制备研究内质网自噬相关疾病分子机制的显像剂，所述内质网相关疾病为过敏性鼻炎、血管疾病、病毒感染、阿尔兹海默症、癌症等。本发明另一目的在于提供一种内质网自噬荧光定量分析方法，以氟硼二吡咯化合物作为内质网成像荧光探针，将内质网自噬过程中的荧光强度变化以数值的形式体现，数值＝(f-f
low
)/f
low
，f代表荧光探针染色内质网损伤区域荧光强度，f
low
代表荧光探针染色内质网正常区域的荧光强度，并利用该值来量化内质网自噬的程度，对于发现内质网自噬新功能和发展自噬相关的细胞调控新策略具有十分重要的意义。
[0016]
有益效果
[0017]
本发明公开了氟硼二吡咯化合物er-bdp在制备内质网成像荧光探针中的应用，特别是内质网超分辨成像。所述探针能够根据“保留和释放”机制感知内质网膜中疏水性的变化，内质网损伤时，荧光探针的疏水性增强而释放荧光。er-bdp可以在内质网中积累，特异性地对其进行标记，结合sim(structured illumination microscopy，结构光照明显微)技术，具有优于商业内质网染料的纳米成像效果。er-bdp还可以检测不同条件下内质网自噬引起的局部疏水性的变化。考虑到er-bdp的疏水响应，本发明提供了一种实时监测内质网自噬变化的定量分析方法。采用结合超分辨成像的分析方法，可以在纳米尺度上可视化内质网自噬。
附图说明
[0018]
图1.本发明所述荧光探针er-bdp的1h nmr图(cdcl3,400mhz)。
[0019]
图2.本发明所述荧光探针er-bdp的
13
c nmr图(cdcl3,101mhz)。
[0020]
图3.本发明所述荧光探针er-bdp([m]

)的maldi-tof-ms图。
[0021]
图4.为本发明所述荧光探针er-bdp在不同溶剂(a,b)或二氧六环/水二元体系(c,d)中的吸收(a,c)和荧光光谱(b,d)。
[0022]
图5.为本发明所述荧光探针er-bdp在pbs、去折叠蛋白试剂尿素溶液、β-lac或bsa与尿素孵育的溶液中的荧光光谱(a)以及荧光强度对比图(b)。
[0023]
图6.为本发明所述荧光探针er-bdp对脂质模拟物dopc的荧光响应情况。
[0024]
图7.为本发明所述荧光探针er-bdp对生物物种(a)、ph(b)、极性(c)和粘度(d)的荧光响应情况。
[0025]
图8.为本发明所述荧光探针er-bdp在不同浓度时孵育细胞24小时后对不同细胞系的增殖影响情况。
[0026]
图9.为本发明所述荧光探针er-bdp与商用线粒体染料和商用溶酶体染料的共染色情况。
[0027]
图10.为本发明所述荧光探针er-bdp与商用er质粒染料(cell light er-rfp)共
定位情况(a-f)以及超分辨成像与共聚焦成像内质网的分辨率对比(g-l)。
[0028]
图11.为本发明所述荧光探针er-bdp(a-h)与商用er小分子染料(i-p)的抗光漂白性能对比。
[0029]
图12.为本发明所述荧光探针er-bdp超分辨示踪未处理(a)和经衣霉素(tm)(b)处理后的内质网局部结构变化。(c)tm诱导的内质网自噬示意图。
[0030]
图13.为本发明所述荧光探针er-bdp超分辨动态示踪经tm处理不同时间后的内质网自噬情况和荧光变化(a-d),以及内质网自噬量化结果(e和f)。
具体实施方式
[0031]
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实例。
[0032]
实施例1：荧光探针er-bdp的制备：
[0033]
参考文献：aydind.,viswanathan,g.,zehra topal,s.,looi,c.y.,wong,w.f.,min yi tan,g.,zorlu,y.,g
ü
rek,a.g.,lee,h.b.&dumoulin,f.antimicrobial activity of a quaternized bodipy against staphylococcus strains.org.biomol.chem.14,2665-2670(2016).制备得到no
2-bdp。
[0034]
ramkumar,k.,samanta,s.,kyani,a.,yang,s.,tamura,s.,ziemke,e.,stuckey,j.a.,li,s.,chinnaswamy,k.,otake,h.,debnath,b.,yarovenko,v.,sebolt-leopold,j.s.,ljungman,m.&neamati,n.mechanistic evaluation and transcriptional signature of a glutathione s-transferase omega 1inhibitor.nat.commun.7,13084(2016).制备得到nh
2-bdp。
[0035]
在0℃下，将nh
2-bdp(3.3mmol,1.12g)和对甲基苯磺酰氯(3.3mmol,627mg)溶于20ml二氯甲烷中，然后向反应液中滴加三滴吡啶。反应搅拌2h。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂。利用硅胶制备色谱以二氯甲烷/石油醚(2:1,v:v)为流动相，提纯得到橙色固体er-bdp(1.34g,82.3％)。并用1h nmr、
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c nmr和hr-ms对其进行了结构表征，如图1-图3所示。
[0036]
[0037]
实施例2：er-bdp体外光谱表征
[0038]
为了确定er-bdp的光谱特性，本实施例测定了其在不同溶剂体系(图4a和4b)中的吸收光谱和荧光光谱。由吸收光谱可知，er-bdp在有机溶剂中的最大吸收波长为490nm，而在水中的最大吸收波长红移至500nm，并伴随着更宽的峰的形成，表现出明显的聚集行为。同样，er-bdp的荧光强度在水中表现出聚集诱导的猝灭作用，在有机溶剂中也有显著提高，这表明探针在亲脂溶剂中发生了解聚，对疏水性有响应。
[0039]
本实施例还考察了er-bdp在含有水和二氧六环(图4c和4d)的二元溶剂体系中的吸收和荧光光谱。随着二氧六环含量的增加，er-bdp在500nm处的吸光度逐渐降低，在492nm处有吸收峰。相比之下，er-bdp在512nm处的荧光强度随着二氧六环含量的增加而增加(“释放”)，当二氧六环含量达到20％时，荧光强度比基线增加了约160倍。但由于er-bdp完全解聚，随着疏水性超过20％，荧光强度并没有增加。
[0040]
实施例3：er-bdp对未折叠蛋白的荧光响应
[0041]
内质网自噬通常伴随着未折叠蛋白的产生和脂质的积累，两者都导致局部疏水性增加。由于尿素作为变性剂能诱导蛋白质的未折叠，本实施例以牛血清白蛋白(bsa)和β-乳球蛋白(β-lac)为模型蛋白，尿素为展开试剂，考察了展开蛋白对疏水性的影响。用6m尿素处理bsa或β-乳球蛋白时，er-bdp的荧光强度随更多的未折叠蛋白而增强(图5)。为了模拟脂质蓄积和膜环境，我们使用了磷脂-1,2-二醇-辛-丙三基-3-磷酸胆碱(dopc)。随着dopc浓度和孵育时间的增加，探针的荧光也随之增加，从而说明探针能感觉到脂质的积累并分布在膜中(图6a和6b)。
[0042]
为了排除生物物种和细胞微环境的影响，本实施例还研究了er-bdp对不同生物富金属离子、活性氧、生物硫醇以及不同ph、极性和粘度的溶液(图7)的荧光响应。其中，探针除了疏水性外，几乎没有受到这些因素的干扰。所有这些证据都表明探针具有优良的疏水性特异性传感能力。
[0043]
实施例4：er-bdp的细胞相容性
[0044]
在细胞内实验之前，本实施例对探针的细胞毒性进行了测试。用不同浓度er-bdp孵育癌细胞系(hela和hepg2细胞)和非癌细胞系(at3、hmc和l929细胞)24h后，用cck-8检测细胞增殖情况。将探针浓度从0μm增加到30μm对细胞增殖几乎没有影响(图8)。即使浓度达到50μm，细胞存活率仍保持在80％，表明er-bdp对细胞几乎无毒，可用于细胞实验。
[0045]
实施例5：er-bdp对内质网的标记情况
[0046]
为了进一步研究er-bdp的亚细胞定位，本实施例在共定位实验中使用了针对不同亚细胞器的商业染料。用商用溶酶体染料(lysotracker
tm red,ltr,0.1μm)、商用线粒体染料(mitotracker
tm deepred,mtdr,0.5μm)和10μm er-bdp孵育hela细胞后，进行sim成像。er-bdp与溶酶体和线粒体的pearson相关系数(pcc)分别为0.111和0.208，重叠程度较低(图9)。er-bdp与商用er质粒染料cell light er-rfp(每104个细胞1μl)共孵育后，er-bdp与商用er染料表现出较好的重叠性，pcc达到0.798(图10a-10f)。因此，er-bdp主要分布在er膜上，显示出与er良好的共定位。
[0047]
为了说明sim超分辨技术相对于共焦成像的优势，进一步比较了er-bdp孵育后的两种成像技术(图10g-10l)。sim模式下的图像清晰显示er的连续网状形态，而共焦模式下的图像无法显示er的连续网状形态(图10h和10k)。考虑到荧光强度的分布(即在图10h和
10k中的白线)，在sim模式下确定半峰全宽最小为100nm，表明在纳米尺度实现局部成像的可能性。进一步根据放大图像中的荧光强度绘制了热图(图10i和10l)。结果显示，共焦热图中难以区分荧光强度和形貌的变化，但sim热图清晰地显示了荧光强度的er结构和局部分布。
[0048]
实施例6：er-bdp的光稳定性
[0049]
具有极小的光漂白特性的光稳定荧光探针因其能承受长期的激光照射，是超分辨成像的最佳探针，可用于长期的细胞内动态监测。本实施例用本发明所述探针与商用er小分子染料er-tr共染的hela细胞，用488nm和561nm连续激光照射，观察荧光强度随时间的变化。随着曝光时间的延长，er-bdp通道荧光缓慢下降，而er-tr通道荧光急剧下降(图11)。当细胞连续暴露3min时，er-bdp的荧光强度下降了约20％，而er-tr的荧光强度下降了约90％，表明er-bdp相对于商用er小分子染料具有优异的抗光漂白性能。本发明基于“保留-释放”机制构建的荧光探针具有良好的光稳定性。
[0050]
实施例7：er-bdp超分辨示踪内质网自噬
[0051]
衣霉素(tm)通过抑制合成糖基化激活自噬，从而导致蛋白质错误折叠、脂质积累和er断裂。为了维持细胞内稳态，细胞选择性地吞噬多馀的产物并损伤er。为了进一步研究内质网自噬，本实施例使用一种商业化的自噬染料dapred对hela细胞和tm处理后的细胞进行超分辨显微镜联合染色。在未处理的细胞中，er呈现完整的网络结构，dapred通道几乎没有荧光信号，表明细胞未发生自噬(图12a)。在tm处理的细胞中，er呈明亮的片断(图12b,左栏)出现，dapred通道呈强点状荧光(图12b,中栏)。各通道之间有很好的重叠(图12b,右栏,pcc＝0.617)，说明内质网自噬自噬体吞噬疏水的未折叠蛋白和脂质过程中，因此可以用er-bdp超分辨成像观察内质网自噬(图12c)。
[0052]
实施例8：er-bdp用于动态示踪局部内质网自噬变化
[0053]
由于其优异的光稳定性，er-bdp可用于长时间动态跟踪。我们用er-bdp和dapred共染细胞，tm刺激细胞，超分辨成像观察细胞内变化。加入tm前，绿色通道呈现完整的er结构，红色通道几乎没有荧光信号(图13a和13b，0min)。加入tm后，绿色通道er结构开始破坏(图13a，5～30min)，局部荧光信号逐渐释放(图13d，5～30min)。同时，在荧光增强的那些位点处形成红色荧光斑点(图13b和13c，15min)，并逐渐表现为一个甜圈状结构(图13b，30min)，表明自噬体的形成和未折叠蛋白和脂质的积累。结果表明，在内质网自噬中，细胞的疏水性增强。为了定量评估内质网自噬与tm处理时间的关系，根据图13e所示的计算公式，将荧光强度变化以数值的形式体现，并利用该值来量化内质网自噬的程度。首先计算不同时间tm处理细胞er的定量变化，发现其值随tm刺激时间的增加而增加，从而表明内质网自噬的严重程度增加(图13f)。这不仅为研究内质网自噬的新检测方法提供了支持，也为进一步研究er相关病理过程提供了基础。