血栓制备方法及其应用

1.本发明属于医药技术领域，具体地，本发明提供了一种血栓制备方法及其应用。


背景技术：

2.血栓形成或栓塞是导致心脑和外周血管事件的最后关键环节,是致死和致残的直接原因,没有血栓就没有事件。动脉血栓形成常见于冠状动脉硬化性心脏病、脑动脉缺血性疾病、周围动脉闭塞性疾病（肠系膜动脉血栓形成及四肢动脉血栓形成）。血栓形成疾病已经成为危害国人生命健康，特别是老年人健康的重要疾病。
3.脑卒中是当今世界严重危害人类健康和生命安全的难治性疾病。脑血管病已经成为全球关注的重大挑战，引起国际社会的高度关注。我国第三次人口普查数据显示，脑血管病在国民死因调查中居于第一位，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率、并发症多的特点，特别是目前呈现年轻化趋势。每年新增卒中病例约250万，造成的直接经济损失约400亿元人民币。随着人口老龄化进程，我国已经成为脑卒中高发国家，并呈现出发病率高、复发率高、致残率高、死亡率高的“四高”特点。目前脑卒中已经成为我国人口死亡和致残的第一位原因。急性缺血性卒中（acute ischemic stroke, ais）约占全部卒中的80%，它主要是由于血管突然闭塞，脑组织缺血缺氧引起的脑坏死，其治疗的关键是在于发作后尽快给予积极的溶栓或血管内治疗把闭塞的血管打通，恢复血流，挽救缺血半暗带。而且再通治疗开始的时间越早，获益越多，风险越小；超过治疗的时间窗，脑细胞已经坏死，再通治疗效果较差而且风险增加。然而，血栓栓塞疾病模型对探讨缺血性脑卒中发病机制、病理生理学过程和治疗策略具有重要价值。
4.疾病模型能用来模拟人类缺血性脑卒中血栓形成以及可能的血管再通过程（静脉溶栓或动脉取栓）。通过研究动物疾病模型，以便于对缺血性脑卒中发病和治疗过程进行深入的研究和探讨，从而有利于研发新的治疗靶点，促进疾病良好转归，所以血栓栓塞疾病模型的科研价值是巨大的，其中最重要的就是制备高质量的血栓。
5.目前的常用的实验用血栓包括未处理血栓、物理变性血栓、添加凝血酶诱导的方法。但是，上述血栓使用过程中未处理血栓非常容易破碎，很难配合注射过程，到达特定部位；物理变性血栓脆性仍然较大，压力过大仍然可以破碎，特别是这种血栓中存在大量红细胞成分，血栓不能实现标准化大小；凝血酶诱导方法制备的血栓，如果未经处理，脆性也较大，不能用于注射操作。


技术实现要素：

6.为解决以上问题，本技术提供了一种血栓制备的方法，所述方法包括以下步骤：（1）采集血液；（2）血栓塑性（3）物理变性；（4）静置冷藏；
（5）洗脱红细胞。
7.进一步地，（3）物理变性的条件为：将存放血液的采血针，至于33-38摄氏度水浴中，放置1-4小时，优选于37摄氏度水浴中，放置2小时，放置后完成血液凝固病理过程。
8.进一步地，（4）静置冷藏的条件为：将物理变性后的采血针至于4摄氏度冰箱中，放置12-48 小时，优选24小时。
9.进一步地，（5）洗脱红细胞包括：将血栓推送到有低温生理盐水平皿中，采用2.5 ml注射器连接pe 50管上，用pe50管的另一端吸引血栓，通过2.5 ml注射器的反复抽吸，使平皿中血栓反复通过pe50管10-15次，直至洗脱后的血栓能够顺利通过pe50管。
10.进一步地，（1）采集血液包括用5 ml普通注射器，从股动脉取2-4 ml，优选3ml动脉血液；（2）血栓塑性包括将新鲜血液平稳、匀速打入采血针中塑型，其间不能有空气隔断，然后室温静置8-20分钟，优选10分钟。
11.进一步地，（1）采集血液为从猴，优选恒河猴采集血液。
12.进一步地，所述方法还包括（6）确认红细胞洗脱干净：更换平皿中生理盐水后，抽吸血栓后，打出血栓时无红色液体从pe50管流出。
13.进一步地，所述方法还包括（7）将血栓存放在pe 50管中，置于50 ml psb 溶液中，4摄氏度保存在冰箱中，建议在48小时内使用。
14.另一方面，本技术提供了上述方法在制备血栓栓塞疾病模型中的应用。
15.进一步地，所述应用中通过推送针和微导管将血栓注射到所需部位。
16.另一方面，本技术提供了上述方法制备的血栓产品。
17.本技术制备血栓用的材料和制备模型动物可以为猴，本领域技术人员进行适当的调整后，也可用于犬、羊、猪、兔等动物。
18.本技术中的试剂和器械材料不限于实施例中描述的种类，其他功能类似的试剂和器械材料经过本领域技术人员进行适当的调整后，也可用于本发明。
19.有益效果：本发明通过注射血栓，构建局部脑缺血大动物疾病模型，可用于脑缺血病理生理机制的研究和治疗策略的研究及评估，从而可能更有利于脑缺血患者的治疗和促进良好的预后、探寻新靶点和研发新型药物，以降低脑卒中导致的死亡，改善脑卒中患者的功能预后。本发明中血栓的构建方法操作简单。疾病模型稳定性好，可以改进后诱导出多种大动物的脑缺血，能很好的模拟人类缺血性脑卒中的发病过程，为下一步溶栓/取栓等血管再通治疗奠定基础。
附图说明
20.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为组织病理学证实，血栓闭塞后存在特征性的脑缺血组织病理学表现实物图；图2为血栓制备和应用的流程图。
具体实施方式
23.实施例1 血栓制备的基本方法（1）以非人灵长类动物（恒河猴）为模型构建对象，以常用麻醉方法（舒泰，0.3 mg/10 kg）麻醉后，用5 ml普通注射器，从股动脉取3 ml的动脉血液。血液于注射器的针筒中，抽血时速度要稳，使血液平稳进入注射器。针筒要干净且不能夹杂任何抗凝剂。
24.（2）将新鲜血液平稳、匀速打入采血针中塑型，其间不能有空气隔断，然后室温静置10分钟。
25.（3）物理变性：将存放血液的采血针，至于37摄氏度水浴中，放置2小时后，完成物理变性，迅速取出后冷藏静置。
26.（4） 冷藏静置：将物理变性后的采血针至于冰箱（4摄氏度）中，放置24小时。
27.（5）在平皿中洗脱红细胞：首先，将血栓推送到平皿中，其中存在低温生理盐水（4摄氏度）；采用2.5 ml注射器，连接pe 50管上，用pe50管的另一端吸引血栓，通过2.5 ml注射器的反复抽吸，使平皿中血栓反复通过pe50管，10-15次，以此方法洗脱掉血栓外围松散红细胞。直至洗脱后的血栓能够顺利通过pe50管。
28.（6）确认红细胞洗脱干净：更换平皿中生理盐水后，抽吸血栓后，打出血栓时无红色液体从pe50管流出。
29.可以使用介入用推送针注射洗脱后血栓。体外实验确认，血栓能够配合介入手术操作。
30.表1不同采血针和pe管尺寸实施例2 血栓的使用效果洗脱后血栓可以存放在pe 50管中，置于50 ml psb 溶液中，4摄氏度保存在冰箱中。建议在48小时内使用。
31.使用时，采用介入手术方法，通过微导管，可以将血栓注射到恒河猴大脑中动脉。数字剪影图像（dsa）显示，血栓可以闭塞恒河猴大脑中动脉。表明血栓稳定，未破碎，达到闭塞血管目的。
32.注射血栓后核磁共振成像显示，相应部位的脑卒中呈现特征性的脑缺血改变。
33.组织病理学证实，脑组织存在局部脑缺血后的特征性病理改变（图1）。
34.血栓制备和应用的流程图如图2所示。
[0035] 实施例3 与常规血栓制备方法的比较将使用实施例1的方法制备的血栓与未处理血栓（仅静置于采血针中自然凝固，与凝血酶处理制备的血栓性质类似）和物理变性（仅经过37摄氏度物理变性处理）血栓进行比较，分别留取5 cm和10 cm血栓（分别5条），用注射器体外推送血栓通过介入手术用微导管
（prolwer 10），比较血栓通过后的形态，结果如表2和表3所示。
[0036]
表2. 5 cm各种血栓通过介入手术用微导管的情况 数量（总数）表3. 10 cm各种血栓通过介入手术用微导管的情况 数量（总数）显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。