一种瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法和应用与流程

1.本发明属于对鱼类受精卵进行脱粘技术领域，更具体的说是涉及一种瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法和应用。


背景技术：

2.产粘性卵的鱼类在自然界中非常普遍，常见于鲤形目和鲟形目的鱼类。随着我国水产养殖业的不断发展，养殖品种也逐步扩大，脱粘孵化技术的重要性日益凸显。瓦氏雅罗鱼，俗称“滑子鱼”，属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科。在北京地区由于野生种群数量逐渐下降，瓦氏雅罗鱼已被列为地方重点保护鱼类。为了提高北京地区瓦氏雅罗鱼野外种群数量，北京市水生野生动植物救护中心于2017年获得人工繁育的瓦氏雅罗鱼子代个体，但在试验中，由于受精卵孵化过程中脱粘效果不佳，受精卵成活率低，严重影响了后期开展物种恢复工作的效果。当年的个体在到达4 龄后重新进行雌雄筛选、人工繁育及受精卵脱粘试验。
3.现有技术瓦氏雅罗鱼受精卵脱粘效果不佳，且极易产生粘连和水霉的情况。目前，国内学者对于瓦氏雅罗鱼受精卵的脱粘通常采用泥浆水脱粘，虽然取材方便，价格低廉，但其缺点在于操作时间较长，且脱粘后的受精卵较混浊，附着物较多，从而增加卵粒重，易粘连沉底而造成缺氧，也易患水霉病，最终导致孵化出苗率低。
4.本发明采用二次脱粘方法，即将滑石粉和单宁酸作为脱粘试剂结合使用。该方法脱粘效果好、成本低、操作时间短，第一次用滑石粉进行脱粘后的卵不像泥浆脱粘那样浑浊，而是卵膜透明，滑石粉颗粒微小，表面光滑，鱼卵的密度增加较小，也不损伤孵出的鱼苗。二次脱粘用单宁酸溶液快速、反复冲洗，避免受精卵在一段时间后仍有弱粘性的情况。
5.因此，如何研发一种针对瓦氏雅罗鱼受精卵脱粘效果好、成本低、操作时间短，脱粘后的受精卵卵膜透明，鱼卵的密度增加较小，不损伤孵出的鱼苗的脱粘方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法和应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法，包括以下步骤：
9.(1)将水、滑石粉和氯化钠混合均匀，得到混合物，将混合物倒入受精卵中，搅拌，完成第一次脱粘，用水将受精卵上的混合物冲洗干净；
10.(2)将单宁酸水溶液倒入完成第一次脱粘的受精卵中，浸泡，用水将受精卵上的单宁酸水溶液冲洗干净，然后重复操作浸泡和冲洗，完成第二次脱粘。
11.本发明的有益效果是：本发明提供的瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法不仅避免了用传统方法脱粘后受精卵附着物较多，从而增加卵粒重，导致沉底缺氧的情况，本发明的脱粘试剂对鱼卵的密度增加较小，也不损伤孵出的鱼苗，且受精卵透明，容易观察后期胚胎发育情况。而且针对传统方法在脱粘一段时间后受精卵仍有弱粘性的情况，本发明采用二
次脱粘方法，利用单宁酸沉淀蛋白质的作用，消除脱粘后的受精卵再次出现弱粘性的可能，并在一定程度上预防水霉感染。本发明不仅可以大幅度降低受精卵粘连率，降低受精卵感染水霉比例，还显著提高了受精卵的破膜率。而且操作简单，成本低廉，耗时较少，具有较好的推广示范作用。
12.进一步，上述步骤(1)每10l水加入175g滑石粉和25g氯化钠。
13.进一步，上述步骤(1)搅拌转速为90转/分钟，搅拌时间为5min。
14.采用上述进一步技术方案的技术效果：有利于滑石粉和氯化钠充分溶解，完成受精卵的脱粘。
15.进一步，上述步骤(2)单宁酸水溶液的浓度为0.06wt％。
16.进一步，上述步骤(2)每次浸泡时间为30s。
17.采用上述进一步技术方案的技术效果：通过试验发现小于30s的脱粘效果较差，长于30s对受精卵孵化会造成一定影响。
18.进一步，上述步骤(2)重复操作浸泡和冲洗1次。
19.采用上述进一步技术方案的技术效果：一是对抑制水霉的发生有较好的作用，二是对受精卵反复出现弱粘性有预防作用。
20.进一步，上述步骤(1)瓦氏雅罗鱼受精卵的制备方法为：将雌鱼人工采卵倒入洁净、干燥的容器内，将雄鱼的精液倒入等渗液中，然后倒入雌鱼卵中，将雌鱼的卵和雄鱼的精液搅拌均匀，加水，静置15-20s后清洗杂质。
21.采用上述进一步技术方案的技术效果：将精液倒入等渗液中可以延长精子快速运动时间，增加了精卵相遇的机会，有利于受精率的提高。
22.进一步，上述雌鱼和雄鱼的数量比为1:3。
23.采用上述进一步技术方案的技术效果：提高瓦氏雅罗鱼雄性亲鱼数量可以保证精液数量，使卵子充分受精，从而提高受精率。
24.进一步，上述加水，控制水温为10-12℃。
25.采用上述进一步技术方案的技术效果：与亲鱼饲养水温保持一致。
26.进一步，上述等渗液由下述质量百分比的原料组成：nacl0.75％， kcl0.02％，cacl20.02％，nahco30.002％，水余量。
27.采用上述进一步技术方案的技术效果：等渗液的使用可以有效延长精子活动时间。
28.进一步，上述精液和等渗液的体积比为1:10。
29.采用上述进一步技术方案的技术效果：通过试验发现，该参数在提高精子密度的同时有利于延长精子激烈运动时间。
30.进一步，上述搅拌转速为30转/分钟，搅拌时间为3分钟。
31.采用上述进一步技术方案的技术效果：通过搅拌使精卵充分混合，提高受精率。
32.进一步，上述加水量为盛卵容器体积的二分之一。
33.采用上述进一步技术方案的技术效果：充分清洗卵子中破卵所流出的卵黄物质，这些卵质在授精过程中能够降低精子与卵结合的机会，降低受精率。同时，添加清水后降低了外界环境渗透压，延长了精子激烈运动时间。
34.本发明还提供一种上述瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法在孵化瓦氏雅罗鱼中
的应用。
35.进一步，上述瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法在孵化瓦氏雅罗鱼中的应用包括以下步骤：将二次脱粘后的受精卵在装有水的孵化容器中孵化，孵化温度为10-12℃，孵化时间为18-20天，水的溶解氧》8mg/l，ph值为7.5-8.0。
36.采用上述进一步技术方案的技术效果：满足上述指标的孵化水体可以使破膜率达到85.87％。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1
39.瓦氏雅罗鱼受精卵二次脱粘的方法，包括以下步骤：
40.(1)将雌鱼人工采卵倒入洁净、干燥的容器内，配制等渗液，等渗液由下述质量百分比的原料组成：nacl0.75％，kcl0.02％，cacl20.02％， nahco30.002％，水余量，将雄鱼的精液倒入等渗液中，精液和等渗液的体积比为1:10，然后倒入雌鱼卵中，将雌鱼的卵和雄鱼的精液搅拌均匀，搅拌转速为30转/分钟，搅拌时间为3分钟，加水，控制水温为11℃，加水量为盛卵容器体积的二分之一，静置17s后清洗杂质，雌鱼和雄鱼的数量比为1:3。
41.(2)将10l水、175g滑石粉和25g氯化钠混合均匀，得到混合物，将混合物倒入受精卵中，搅拌，搅拌转速为90转/分钟，搅拌时间为5min，完成第一次脱粘，用水将受精卵上的混合物冲洗干净。
42.(3)将单宁酸水溶液倒入完成第一次脱粘的受精卵中，单宁酸水溶液的浓度为0.06wt％，浸泡30s，用水将受精卵上的单宁酸水溶液冲洗干净，然后重复操作浸泡和冲洗1次，完成第二次脱粘。
43.(4)将二次脱粘后的受精卵在装有水的孵化容器中孵化，孵化温度为 11℃，孵化时间为19天，水的溶解氧10mg/l，ph值为7.8。
44.本实施例方法脱粘后的受精卵在破膜前出现水霉的比例为0.8％。
45.实施例2
46.(1)将雌鱼人工采卵倒入洁净、干燥的容器内，配制等渗液，等渗液由下述质量百分比的原料组成：nacl0.75％，kcl0.02％，cacl20.02％， nahco30.002％，水余量，将雄鱼的精液倒入等渗液中，精液和等渗液的体积比为1:10，然后倒入雌鱼卵中，将雌鱼的卵和雄鱼的精液搅拌均匀，搅拌转速为30转/分钟，搅拌时间为3分钟，加水，控制水温为10℃，加水量为盛卵容器体积的二分之一，静置15s后清洗杂质，雌鱼和雄鱼的数量比为1:3。
47.(2)将10l水、175g滑石粉和25g氯化钠混合均匀，得到混合物，将混合物倒入受精卵中，搅拌，搅拌转速为90转/分钟，搅拌时间为5min，完成第一次脱粘，用水将受精卵上的混合物冲洗干净。
48.(3)将单宁酸水溶液倒入完成第一次脱粘的受精卵中，单宁酸水溶液的浓度为0.06wt％，浸泡30s，用水将受精卵上的单宁酸水溶液冲洗干净，然后重复操作浸泡和冲洗1
次，完成第二次脱粘。
49.(4)将二次脱粘后的受精卵在装有水的孵化容器中孵化，孵化温度为 10℃，孵化时间为18天，水的溶解氧9mg/l，ph值为7.5。
50.实施例3
51.(1)将雌鱼人工采卵倒入洁净、干燥的容器内，配制等渗液，等渗液由下述质量百分比的原料组成：nacl0.75％，kcl0.02％，cacl20.02％， nahco30.002％，水余量，将雄鱼的精液倒入等渗液中，精液和等渗液的体积比为1:10，然后倒入雌鱼卵中，将雌鱼的卵和雄鱼的精液搅拌均匀，搅拌转速为30转/分钟，搅拌时间为3分钟，加水，控制水温为12℃，加水量为盛卵容器体积的二分之一，静置20s后清洗杂质，雌鱼和雄鱼的数量比为1:3。
52.(2)将10l水、175g滑石粉和25g氯化钠混合均匀，得到混合物，将混合物倒入受精卵中，搅拌，搅拌转速为90转/分钟，搅拌时间为5min，完成第一次脱粘，用水将受精卵上的混合物冲洗干净；
53.(3)将单宁酸水溶液倒入完成第一次脱粘的受精卵中，单宁酸水溶液的浓度为0.06wt％，浸泡30s，用水将受精卵上的单宁酸水溶液冲洗干净，然后重复操作浸泡和冲洗1次，完成第二次脱粘。
54.(4)将二次脱粘后的受精卵在装有水的孵化容器中孵化，孵化温度为 12℃，孵化时间为20天，水的溶解氧11mg/l，ph值为8.0。
55.对比实验
56.设置对比例1，与实施例1相比，除了没有进行脱粘环节，其他步骤和参数与实施例1完全相同；
57.设置对比例2，与实施例1相比，除了没有进行脱粘环节，其他步骤和参数与实施例1完全相同；
58.设置对比例3，与实施例1相比，除了没有进行脱粘环节，其他步骤和参数与实施例1完全相同；
59.表1实施例1和对比例1受精卵粘连率表
[0060][0061]
表1结论：没有进行脱粘的对比例1粘连率显著高于二次脱粘的实施例1。
[0062]
表2实施例1和对比例2受精卵感染水霉比例表
[0063]
孵化时间d实施例1感染水霉比例对比例2感染水霉比例0d002d004d01.26d028d04.610d06.212d08.914d0.310.516d0.512.718d0.814.6
[0064] 表2结论：没有进行脱粘的对比例2感染水霉比例显著高于二次脱粘的实施例1。
[0065]
表3实施例1和对比例3破膜率
[0066]
编号样本数(粒)破膜数(尾)破膜率实施例1破膜率395203393685.87％对比例3破膜率389212459063.18％
[0067]
表3结论：没有进行脱粘的对比例3破膜率显著低于二次脱粘的实施例1。
[0068]
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。