一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵饲料技术领域，具体为一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法。


背景技术：

2.秸秆由于资源储量较大，常被用作畜牧养殖的动物口粮，并且投资少，能够更好的保护生态，做到资源的合理利用，但在很多地区，秸秆的利用质量和效率却相对较低，目前的最常见的秸秆饲料常作为青贮饲料使用，经过简单的铡短、装填、压实和封埋发酵而成，但是一方面青贮饲料的酸性较大，喂食量需要准确控制，另一方面青贮饲料也并不能够提供动物所需的其他营养，无法做到秸秆的有效利用。
3.中国专利cn201810914381.2(以下称对比文件)就公开了一种微生物处理爆破农作物秸秆生产的发酵饲料及其生产方法和应用，其在生产方法部分公开了包括蒸汽爆破、将爆破秸秆与水混合、相混合料中加入凝结芽孢杆菌和米曲霉菌的发酵菌液，最终在特定条件下得到发酵饲料，其蒸汽爆破主要是破坏秸秆中纤维素结构，辅助进行微生物降解，而且对比文件采用凝结芽孢杆菌和米曲霉进行同步发酵，并控制凝结芽孢杆菌与米曲霉的体积比使两者产生协同作用，提高粗纤维的降解效果，通过上述方法生产出来的发酵饲料，其粗纤维降解率高，有利于提高单胃动物对饲料的消化利用率。
4.但是通过对比文件所述的方法得到的发酵饲料，其仅是为了提高粗纤维的降解率，导致凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数都较低，同时凝结芽孢杆菌由于在肠道上皮细胞的粘附性较弱，导致其在自然条件下很难在肠道中存在，这就使得利用对比文件所述的方法生产出来的发酵饲料并不能为动物提供充足的凝结芽孢杆菌，来对动物的肠道环境进行调节，而且，对比文件中的发酵方式为液态发酵，操作起来更加复杂，能耗较高，发酵所得饲料含水量较大导致后续处理过程复杂，且液态发酵的芽孢率较低，使其仍不能做到秸秆的有效利用。


技术实现要素：

5.为解决上述背景技术中存在的技术问题，提高秸秆利用率，本发明提供了一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法。
6.本发明技术方案如下：
7.一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，该方法包括如下步骤：
8.(1)、菌种活化：将长期冰箱保藏的凝结芽孢杆菌进行活化处理；
9.(2)、液态种子培养基制备：为保证菌种的活化率及培养效率，所述液态种子培养基包括葡萄糖6％～10％，乳清粉5％～8％，蛋白胨6％～10％，酵母粉6％～10％，碳酸钙1％～3％，硫酸镁0.2％～0.5％，硫酸锰0.01％～0.1％，硫酸氢二钾2％～4％；
10.(3)、扩培接种：先将步骤(1)活化后的斜面菌种(即一级种子)接种至盛有步骤(2)所述液态种子培养基的三角瓶中进行培养，再将三角瓶培养后的菌种转接至100l液体发酵
罐进行扩培，斜面菌种从三角瓶到发酵罐进行逐步的放大扩培；
11.(4)、固态发酵基制备：所述固态发酵基包括水、麦秆、麸皮和豆粕，其中相比于其他秸秆，麦秆的保水性和透气性良好，有利于菌种发酵，所述麸皮和豆粕为发酵提供主要的碳源和氮源，将固态发酵剂进行灭菌处理；
12.(5)、发酵接种：将步骤(3)中扩培后的菌种接种至步骤(4)中的固态发酵基中发酵至芽孢形成，制得发酵料，这种仅在发酵料中接种凝结芽孢杆菌的方式，使得最终所得发酵饲料凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数都更高，为动物提供充足的凝结芽班杆菌，以改善肠道环境，提高肠道菌群的活性；
13.(6)、预处理：将步骤(5)制得的发酵料进行烘干处理；
14.(7)、饲料制备：将烘干后的发酵料进行粉碎工作，制得饲料。
15.如上所述的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，所述步骤(4)中，为保证发酵料中凝结芽孢杆菌的芽孢率，所述麦秆、麸皮和豆粕的比例为1:1:1。
16.进一步的，所述步骤(4)中，将麦秆、麸皮和豆粕按1:1:1的比例混合后，加入乳清粉、磷酸二氢钾，然后与水混合制得混合料，其中乳清粉能够提供发酵初期的碳源让菌体快速生长，磷酸二氢钾主要对发酵ph起缓冲作用，将混合料115-125℃蒸煮20-30min后放凉，以达到彻底灭菌的效果。
17.进一步的，所述步骤(4)中混合料的料水比例为5:4，当水量过多时，最终制得的发酵料含水量较高，不利于后续的处理，而当水量过少使，一方面不利于菌种的发酵，另一方面则会影响固体发酵基的灭菌效果。
18.进一步的，所述步骤(4)中料水混合制得混合料后，控制湿度在45-55％，温度为121℃，蒸煮20-30min进行灭菌，由于灭菌过程中的温度较高，固态发酵基会失水，导致水量减少，而失水后的固态发酵基不利于菌体产芽孢，故需控制湿度。
19.如上所述的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，所述步骤(2)中液态种子培养基的ph值为7.0-7.5。
20.如上所述的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，所述步骤(3)的扩培接种方法为：
21.将步骤(1)活化后的菌种接种至盛有步骤(2)所述液态种子培养基的三角瓶中，于40℃的环境中200r/min培养16h；
22.将三角瓶培养后的菌种转接至液体发酵罐中，扩培条件为40℃、200r/min、通气比为1:0.5，发酵16-20h。
23.如上所述的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，所述步骤(5)中接种完成后43℃好氧发酵40-48h，保证凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数。
24.如上所述的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，还包括步骤(8)：
25.将饲料进行倾注平板计数，测量芽孢率，并以芽孢率来衡量发酵效果的指标，使得发酵效果在进行检测时，能够更加很直观的体现。
26.本发明的有益效果在于：
27.本发明提供了一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，发酵过程采用固态发酵，操作起来更加简单，而且能耗较低，发酵所得的饲料含水量较小，后续仅需简
单的干燥和破碎后既能够投入使用；
28.本发明中采用麦秆进行发酵工作，由于麦秆的透气性强、纤维含量高，使其能够适于凝结芽孢杆菌的生长，保证了固态发酵饲料中凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数；
29.本发明采用固态发酵的方式，保证了凝结芽班杆菌的芽孢率，同时，该发酵饲料中仅添加一种凝结芽孢杆菌，所得发酵饲料中凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数均较高，一方面做到了麦秆的有效利用，另一方面在使用该发酵饲料使能够为动物提供充足的凝结芽孢杆菌，来对动物的肠道环境进行调节，切实做到了秸秆的有效利用；
30.本发明利用麦秆、麸皮和豆粕作为固态发酵基的主要原料，其中麸皮和豆粕的加入一方面能够为动物生长提供较好的营养，同时也为凝结芽孢杆菌的发酵提供充足的碳源和氮源，而若是将水、麸皮和豆粕三者混合的话，混合料的密度是非常大的，这不利于凝结芽孢杆菌的发酵作用，因此，本技术专门加入了透气性较强的麦秆，通过向混合料中添加麦秆，保证了混合料具有较好的透气性，同时麦秆的纤维含量也是较高的，这也为凝结芽孢杆菌的生长提供了更加有利的环境，保证了固态发酵饲料中凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数；而且，申请人专门将麦秆、麸皮、豆粕的比例设计为1:1:1，只有在此比例下，添加的麦秆才能为同样1:1配置的麸皮和豆粕提供适当的透气环境，有利于麸皮和豆粕中的碳源和氮源充分与凝结芽孢杆菌产生作用，通过申请人多次实验发现，当麦秆与麸皮、豆粕的比例设计为1:1:1时，固态发酵饲料中凝结芽孢杆菌的芽孢率和细胞数也是最高的，这是因为三者的配比既保证了混合料具有麦秆的透气性，又保证了固态发酵基能够为凝结芽芽孢杆菌的发酵工作提供丰富的碳源和氮源，同时配合纤维含量高的麦秆，使凝结芽孢杆菌能够更好地完成发酵工作，进而显著提升了发酵料中凝结芽孢杆菌的芽孢率，保证了发酵料的发酵质量。
附图说明
31.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，本技术的方案和优点对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。
32.在附图中：
33.图1为实施例中饲料的制备过程示意图；
34.图2为试验例1中各试验组的试验结果对照图；
35.图3为试验例2中各试验组的试验结果对照图。
具体实施方式
36.下面将结合附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。
37.实施例1
38.本实施例提供了一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，包括如下步骤：
39.(1)、菌种活化：将长期冰箱保藏的凝结芽孢杆菌斜面试管，转接至新鲜斜面培养基中，40℃，静置培养三天，得一级种子；
40.(2)、液态种子培养基制备：为保证菌种的活化率及培养效率，所述液态种子培养
基包括葡萄糖6％～10％，乳清粉5％～8％，蛋白胨6％～10％，酵母粉6％～10％，碳酸钙1％～3％，硫酸镁0.2％～0.5％，硫酸锰0.01％～0.1％，硫酸氢二钾2％～4％，液态种子培养基ph值为7.0-7.5(上述斜面培养基成分与所述液态种子培养基成分相同)；
41.(3)、扩培接种：从步骤(1)斜面培养基的斜面上挑取菌苔(即上述的一级种子)转接至盛有液态种子培养基的三角瓶中，于40℃的环境中200r/min培养16h，再将三角瓶培养后的菌种转接至100l液体发酵罐进行扩培，扩培条件为40℃、200r/min、通气比为1:0.5，发酵16-20h；
42.(4)、固态发酵基制备：采用麦秆20份、麸皮40份、豆粕40份，乳清粉3份、磷酸二氢钾1份、碳酸钙1份，一方面碳酸钙能够中和发酵产酸，另一方面能够诱导芽孢形成，按照料水比为5:4的比例加入清水，控制湿度为50％左右，温度为121℃，蒸煮灭菌20-30min后降温放凉；
43.(5)、发酵接种：将步骤(3)中扩培后的种子液按15％的接种量接种至的固态发酵基中，43℃好氧发酵40-48h，至芽孢形成，制得发酵料；
44.(6)、预处理：将步骤(5)制得的发酵料进行烘干处理；
45.(7)、饲料制备：将烘干后的发酵料进行粉碎工作，制得饲料a(饲料a即为最终产品)；
46.(8)、将饲料进行倾注平板计数，结果为8.9*109cfu/g，经80℃水浴20min后计数结果为7.6*109cfu/g，芽孢率为85.4％。
47.实施例2
48.本实施例提供了一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，包括如下步骤：
49.(1)、菌种活化：将长期冰箱保藏的凝结芽孢杆菌斜面试管，转接至新鲜斜面培养基中，40℃，静置培养三天，得一级种子；
50.(2)、液态种子培养基制备：为保证菌种的活化率及培养效率，所述液态种子培养基包括葡萄糖6％～10％，乳清粉5％～8％，蛋白胨6％～10％，酵母粉6％～10％，碳酸钙1％～3％，硫酸镁0.2％～0.5％，硫酸锰0.01％～0.1％，硫酸氢二钾2％～4％，液态种子培养基ph值为7.0-7.5(上述斜面培养基成分与所述液态种子培养基成分相同)；
51.(3)、扩培接种：从步骤(1)斜面培养基的斜面上挑取菌苔(即上述的一级种子)转接至盛有液态种子培养基的三角瓶中，于40℃的环境中200r/min培养16h，再将三角瓶培养后的菌种转接至100l液体发酵罐进行扩培，扩培条件为40℃、200r/min、通气比为1:0.5，发酵16-20h；
52.(4)、固态发酵基制备：采用麦秆30份、麸皮30份、豆粕30份，乳清粉3份、磷酸二氢钾1份、碳酸钙1份，一方面碳酸钙能够中和发酵产酸，另一方面能够诱导芽孢形成，按照料水比为5:4的比例加入清水，控制湿度为50％左右，温度为121℃，蒸煮灭菌20-30min后降温放凉；
53.(5)、发酵接种：将步骤(3)中扩培后的种子液按15％的接种量接种至的固态发酵基中，43℃好氧发酵40-48h，至芽孢形成，制得发酵料；
54.(6)、预处理：将步骤(5)制得的发酵料进行烘干处理；
55.(7)、饲料制备：将烘干后的发酵料进行粉碎工作，制得饲料b(饲料b即为最终产
品)；
56.(8)、将饲料进行倾注平板计数，结果为9.5*109cfu/g，经80℃水浴20min后计数结果为8.5*109cfu/g，芽孢率为89.5％。
57.对照例1
58.本对照例提供了一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，包括如下步骤：
59.(1)、菌种活化：将长期冰箱保藏的凝结芽孢杆菌斜面试管，转接至新鲜斜面培养基中，40℃，静置培养三天，得一级种子；
60.(2)、液态种子培养基制备：为保证菌种的活化率及培养效率，所述液态种子培养基包括葡萄糖6％～10％，乳清粉5％～8％，蛋白胨6％～10％，酵母粉6％～10％，碳酸钙1％～3％，硫酸镁0.2％～0.5％，硫酸锰0.01％～0.1％，硫酸氢二钾2％～4％，液态种子培养基ph值为7.0-7.5(上述斜面培养基成分与所述液态种子培养基成分相同)；
61.(3)、扩培接种：从步骤(1)斜面培养基的斜面上挑取菌苔(即上述的一级种子)转接至盛有液态种子培养基的三角瓶中，于40℃的环境中200r/min培养16h；
62.再将三角瓶培养后的菌种转接至100l液体发酵罐进行扩培，扩培条件为40℃、200r/min、通气比为1:0.5，发酵16-20h；
63.(4)、固态发酵基制备：采用稻壳20份、麸皮40份、豆粕40份，乳清粉3份、磷酸二氢钾1份、碳酸钙1份，一方面碳酸钙能够中和发酵产酸，另一方面能够诱导芽孢形成，按照料水比为5:4的比例加入清水，控制湿度为50％左右，温度为121℃，蒸煮灭菌20-30min后降温放凉；
64.(5)、发酵接种：将步骤(3)中扩培后的种子液按15％的接种量接种至的固态发酵基中，43℃好氧发酵40-48h，至芽孢形成，制得发酵料；
65.(6)、预处理：将步骤(5)制得的发酵料进行烘干处理；
66.(7)、饲料制备：将烘干后的发酵料进行粉碎工作，制得饲料c(饲料c即为最终产品)；
67.(8)、将饲料进行倾注平板计数，结果为9.6*109cfu/g，经80℃水浴20min后计数结果为5.8*109cfu/g，芽孢率为60.4％。
68.试验例1
69.(1)、将240只初始体重基本一致的肉鸡仔鸡随机分成四组，每组60只，分别为第一实施组、第二实施组、第一对照组和第二对照组。
70.(2)、上述四组肉鸡仔鸡喂食由玉米55％、豆粕35％、植物油1％、石粉0.5％、复合预混料2％组成的基础日粮；
71.(3)、第一实施组在基础日粮中添加10％的饲料a，第二实施组在基础日粮中添加10％的饲料b，第一对照组在基础日粮中添加10％的饲料c；
72.(4)、肉鸡仔鸡自由采食、自由饮水，日常清洁、消毒和防疫方式按常规管理。
73.(5)、四组肉鸡仔鸡每天以重量为单位记录采食量，分别在0d、21d和42d空腹称重，计算平均日增重、平均日采食量及料重比；
74.(6)、步骤(5)完成后，每组随机选择一只试验用肉鸡，取0.5g肠道内容物溶于4.5ml生理盐水中进10倍倍比稀释，选择合适的稀释梯度进行菌群数量测定，使用平板计数
法测定四组肉鸡肠道内容物中乳酸菌数量和大肠杆菌数量。
75.试验例2
76.(1)、选用120只与试验例1中初始体重基本一致的肉鸡仔鸡,随机分成两组，每组60只，分别为第三对照组和第四对照组；
77.(2)、上述两组肉鸡仔鸡喂食由玉米55％、豆粕35％、植物油1％、石粉0.5％、复合预混料2％组成的基础日粮；
78.(3)、第三对照组在基础日粮中添加10％的饲b，第四对照组在基础日粮中添加10％的饲料b，且第四对照组的肉鸡仔鸡在第21d后停止喂养含有10％饲料b的基础日粮，仅喂养步骤(2)中普通的基础日粮；
79.(4)、肉鸡仔鸡自由采食、自由饮水，日常清洁、消毒和防疫方式按常规管理；
80.(5)、两组肉鸡仔鸡每天以重量为单位记录采食量，分别在第0d、21d和42d时，每组随机选择一只试验用肉鸡，取0.5g肠道内容物溶于4.5ml生理盐水中进10倍倍比稀释，选择合适的稀释梯度进行菌群数量测定，使用平板计数法测定不同天数时，两组肉鸡肠道内容物中乳酸菌数量和大肠杆菌数量。
81.本技术的一种利用小麦秸秆发酵凝结芽孢杆菌饲料的制备方法，通过图2和图3可以看出，采用本技术生产方法生产出来的发酵饲料，其在抑制大肠杆菌数量，增加肠道乳酸菌数，改善肠道环境方面具有显著效果，同时，采用本技术生产方法生产出来的发酵饲料，凝结芽孢杆菌的芽孢率能达到60％以上，尤其是采用麦秆发酵且麦秆：麸皮：豆粕为1:1:1时，芽孢率更是能达到85％以上，而食用本技术发酵饲料的肉鸡仔鸡，明显降低了肠道内大肠杆菌的数量，提高了乳酸菌数量，且在保证肉鸡采食量的同时，改善了料重比，显著提高了饲料利用效率。