用于处理皮肤松垂的化妆品组合物和处理的制作方法

1.本发明涉及用于处理皮肤松垂的化妆品组合物和处理。其目的尤其针对于化妆品、皮肤病学以及卫生和个人护理产品工业。


背景技术：

2.时间性衰老或固有衰老从一个个体到另一个个体是有变化的，因为衰老与个体的遗传继承物非常强烈地相关，所述遗传继承物(例如，产生保护性色素的条件)管理抗氧化剂和免疫防御或甚至决定绝经期的时间。另一类型的衰老覆盖第一种。它由频繁的日晒、环境污染物、我们的饮食含有太多糖类和/或脂肪以及我们的生活方式(压力、较少的休息时间、显著的和/或太快的减肥、妊娠、母乳喂养等)诱导。它也是从一个个体到另一个个体高度变化的。
3.在皮肤衰老期间，面部和身体变化并且丧失其协调性。皮肤变薄并且逐渐变得扩张(皮肤松垂或松弛)。皮肤弹性较小，不太紧致和不太光滑(幼纹效应)。当被拉伸时皮肤不太容易恢复其形状，因为它丧失了回弹性。皮肤将在其自身重量影响下松垂(上睑下垂症)。在面部，这导致面部的卵圆形或轮廓不太清晰明确，下颌上出现垂肉和/或出现眼睑下垂，并且形成不雅观的皱纹诸如例如眼睑上的皱纹(参见图1)或嘴两侧上的皱纹(也称作口周“木偶纹”，参见图2)。身体的其他部分也受累，诸如下颚下的颈部、腋下、下腹部或两乳之间。
4.在皮肤成分水平，在衰老期间因产生的弹性蛋白质量下降并且还因为弹性纤维网络的破坏而使弹性改变。
5.在细胞外基质中，弹性纤维由弹性蛋白和微管构成。它们在年轻人中看上去为致密和紧密联系的网络的形式。因此它们为皮肤提供了回弹性和弹性。弹性蛋白是弹性纤维的优势组分(90％)，它以称作弹性蛋白原的未成熟形式产生。弹性蛋白原在肌原纤蛋白构成的微纤维的预先建立的支架上自组装，其在蛋白mfap4(微原纤蛋白相关蛋白4)的辅助下组装和保持。该蛋白在衰老的皮肤中减少，因此是至关重要的。另一蛋白，纤蛋白-5，也参与此支架的构建。
6.真皮-表皮连接(dej)是皮肤的关键部分，因为它确保了表皮结构以及真皮和表皮之间的粘着。在衰老期间，其组分(尤其是胶原蛋白iv、vii和层粘连蛋白v)的合成减少和dej的变平，在绝经期皮肤中非常清晰地观察到。通过蛋白酶对将表皮的角质形成细胞连接到dej的蛋白(胶原蛋白iv、vii和层粘连蛋白v)的半桥粒的不利作用发生此弱化作用。dej的衰老因此也对皮肤的回弹性和其活力的丧失有显著的影响。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供对与弹性蛋白和弹性纤维的缺陷(在性质上和/或在数量上)相关的皮肤松垂的解决方案。
8.为此目的，本发明提供了黄杞属(engelhardtia)的植物提取物用于对皮肤松垂的
非治疗性美容处理的用途。特别地，面部特征或线条因根据本发明的处理的帮助而重新协调。
9.黄杞属尤其包括下列的种属：正黄杞(engelhardtia chrysolepsis hance)(同义词:engelhardtia roxburghiana lindl)，engelhardtia apoensis elmer ex nagel，engelhardtia hainanensis p.y.chen，engelhardtia mendalomensis e.j.f.campb.，engelhardtia mersingensis e.j.f.campb.，engelhardtia rigida blume，engelhardtia mollis hu，engelhardtia serrata blume，engelhardtia spicata lechen ex blume，engelhardtia spicata var.integra(kurz)w.e.manning ex steenis和engelhardtia unijuga(chun)chun ex p.y.chen。
10.优选地，本发明针对正黄杞种的提取物的用途。
11.正黄杞是在亚洲已知晓了几个世纪且可能上千年的亚热带植物。它的叶子自由销售并且在中国(huang qui)和日本用作草药茶(herbal tea)，有一点甜味，在日本的名称为kohki茶。
12.此饮料因其舒缓、解毒和医药有益效应而受到喜爱，特别是用于治疗糖尿病和高脂血症，以及用于降低发热。
13.根据本发明的其他优选特征：
[0014]-所述提取物利用叶实现；和/或
[0015]-所述提取物利用醇溶剂，优选乙醇实现；和/或
[0016]-所述提取物与生理上可接受的介质混合，所述提取物优选是干的，并且稀释在所述生理上可接受的介质中。
[0017]
在说明书的下文中给出了体外测试结果。它们显示了根据本发明的美容处理的效力，所述效力尤其来自于：
[0018]-刺激成纤维细胞产生弹性蛋白；
[0019]-提高由成纤维细胞产生的弹性纤维的数量和网络质量；
[0020]-提高成纤维细胞的可收缩能力；以及
[0021]-强化角质形成细胞和皮肤外植体中的dej。
[0022]
因此，根据本发明的处理适于增加细胞外基质的弹性蛋白合成，提高弹性纤维数量和网络质量。
[0023]
除此之外，对一组志愿者(他们的面部皮肤质量受衰老影响)实现的体内测试显示了根据本发明的美容处理改善皮肤松垂的有效性：
[0024]-改善面部皮肤的弹性特性；
[0025]-改善面部特征(轮廓，垂肉)；
[0026]-减小眼睑皱纹的深度和体积；
[0027]-减少嘴轮廓的木偶纹；以及
[0028]-减少粗糙度和凹陷深度(凹陷平复)。
[0029]
根据本发明的处理有利地是修复处理，减少垂肉和眼睑下垂，以及相应的皮肤皱纹。
[0030]
根据本发明的提取物特别有意义地用于绝经前或绝经女性，她们经受了加速皮肤衰老的雌激素下降。
[0031]
本发明还提供了化妆品组合物，所述化妆品组合物包含在生理上可接受的介质中的来自黄杞属(优选正黄杞)的叶的醇提取物。根据本发明的组合物可以或多或少地浓缩黄杞提取物，由此形成化妆品成分或可以由该化妆品成分制备的旨在用于消费者的最终化妆品制剂。根据本发明的组合物涵盖相对于所述组合物的总重量的约0.0001％-10％的干提取物含量。
[0032]
优选地，此醇提取物是乙醇提取物，且优选，此提取物是干提取物，不含任何痕量的用来获得它的溶剂，例如，且优选地通过对此溶剂的真空蒸发。还可以通过共沸蒸馏、雾化、冻干或沸石干燥(zeodratation)来完成。
[0033]
根据本发明，术语“生理学上可接受的介质”不受限制地意指水性或水-醇溶液、醇、二醇或水二醇、油包水型乳液、水包油型乳液、微乳液、水凝胶、无水凝胶、血清、囊泡分散体或粉末。
[0034]“生理学上可接受的”意指所述介质适用于局部或经皮使用，接触粘膜、指甲、头皮、毛发、哺乳动物(更特别是人)的毛发和皮肤，所述组合物能够被摄入或注入皮肤中，没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等风险。这种“生理学上可接受的介质”形成通常称为组合物的赋形剂。
[0035]
本发明的组合物可以以本领域技术人员已知的任何合适的形式或媒介物应用于面部、身体、颈部、头皮、毛发、睫毛、体毛、指甲、唇上。
[0036]
根据本发明的组合物可以以载体化的形式，以结合的形式，掺入或吸收至大颗粒、微粒和纳米颗粒上/到大颗粒、微粒或纳米颗粒的形式，作为胶囊、球体、脂质体、油质体、乳糜微滴、海绵、微乳液或纳米乳液的形式，或例如吸收在粉末状有机聚合物、滑石、膨润土、孢子或外壁以及其他矿物或有机支持物上使用。
[0037]
根据本发明的组合物可以以任何盖伦形式提供，也可以通过由天然或合成纤维、羊毛、或适合接触皮肤的任何材料制成的织物支持物传送，或可以在衣服中使用，诸如日夜内衣、手帕或纸巾，以便允许通过此皮肤/织物接触形成化妆或皮肤病学效应，并允许局部递送。
[0038]
特别地和有利地，根据本发明，所述组合物可以包括适于强化所述活性和/或以补充的方式作用于一种或多种其他活性的一种或多种额外的活性物质。这些额外的活性剂可以在意欲用于配制者的成分的阶段或在形成意欲用于消费者的化妆产品的组合物的最终阶段掺入。
[0039]
在化妆品方面，尤其可以在用于面部、身体、毛发和体毛的皮肤护理线以及在彩妆-护理范围可以提供应用。这些额外的活性物质可以是根据它们的功能、应用部位(身体、面部、颈部、胸部、手、毛发、睫毛、眉毛、指甲、唇等)、寻求的最终效应和消费者靶标的任何类别，例如，抗氧化剂，紧致，保湿，滋润，保护，舒缓，重塑，盈容(脂肪植入)，用于肤色焕发，祛斑，遮瑕，抗糖化，抗衰老，抗皱，减肥，镇静，肌肉松弛，抗红血丝，减少妊娠纹，防晒等。
[0040]
优选地，根据本发明的黄杞提取物与促进对真皮细胞外基质分子的刺激的活性物质混合，所述细胞外基质诸如胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸。
[0041]
这样，特别感兴趣的是将根据本发明的黄杞提取物与选自序列kttks(seq id no 1)、ghk、gqpr(seq id no 2)和/或ktfk(seq id no3)的肽的一种或多种肽组合，或与通过高山火绒草(leontopodium alpinum)或长叶车前(plantago lanceolata)的植物细胞培养
lupulus)，小果咖啡(coffea arabica)，巴拉圭茶(ilex paraguariensis)，或心叶球花(globularia cordifolia)，铃兰树(oxydendron arboretum)，合欢树(albizzia julibrissin)，红球姜(zingimber zerumbet smith)，膜荚黄芪(astragalus membranaceus)，白术(atractylodes macrocephalae)，长叶车前(plantago lanceolata)，高山火绒草(leontopodium alpinum)(或薄雪火绒草(edelweiss))，紫茉莉(mirabilis jalapa)，芹菜(apium graveolens)，欧夏至草(marrubium vulgare)，大叶醉鱼草(buddleja davidii franch)，欧丁香(syringa vulgaris)或兰花。
[0052]
本发明的组合物可以包括上面提到的优选肽以外的其他肽，包括，不限于，二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其衍生物。根据特定的实施方案，该组合物中附加肽的浓度范围为1
×
10-7
％至20％，优选1
×
10-6
％至10％，优选1
×
10-5
％至5％重量。在本文中术语“肽”是指含有10个氨基酸或更少氨基酸的肽，其衍生物、异构体以及与其他物质的复合物，所述其他物质诸如金属离子(例如，铜、锌、锰、镁等)。术语“肽”是指天然肽和(生物)合成肽两者。还指含有肽的组合物并且其是在自然界中发现的，和/或商业上可购得的。
[0053]
用于本文中的合适的二肽包括但不限于肌肽(βah)、yr、vw、nf、df、kt、kc、ck、kp、kk、tt、pa、pm或pp。
[0054]
用于本文中的合适的三肽包括，但不限于：rkr，hgg，gkh，ghk，ggh，ghg，kgh，khg，kfk，kavak，kβak，kabuk，kacak，kpk，kmok，kmo2k(mo2是二氧化亚砜甲硫氨酸)、kvk，ppl，ppr，spr，qpa，lpa，spa，k(ac)hg或k(ac)gh(k(ac)是被乙酰化的侧链具有胺官能团的赖氨酸，公开于wo2017/216177)，k(p)hg或k(p)gh(k(p)是其侧链接枝了脯氨酸的赖氨酸)，k(pyr)hg或k(pyr)gh(k(pyr)是其侧链接枝了焦谷氨酸的赖氨酸)，k(hyp)hg或k(hyp)gh(k(hyp)是其侧链接枝了羟脯氨酸的赖氨酸，公开于wo2016/097965)。
[0055]
用作本文中的附加肽的合适的四肽包括但不限于rsrk(seq id no9)，ktfk(seq id no 3)，ktak(seq id no 10)，kayk(seq id no 11)或kfyk(seq id no 12)。
[0056]
五肽的非限制性的合适实例为kttks(seq id no1)，六肽的合适实例为gkttks(seq id no13)和vgvapg(seq id no 7)。
[0057]
根据本发明使用的其他合适的肽可以选自下列的列表，但不限于此：肽的亲脂性衍生物，优选棕榈酰(pal)或肉豆蔻酰(myr)衍生物，以及上述金属络合物(例如，三肽hgg或ghk的铜络合物)。优选的二肽包括例如n-棕榈酰-β-ala-his、n-乙酰基-tyr-arg-十六烷基酯(来自sederma的calmosensine
tm
，idealift
tm
)，pal-rt或pal-kt(来自sederma)。优选的三肽衍生物包括例如pal-gkh和pal-ghk(来自sederma)，hgg的铜衍生物(来自sigma的lamin
tm
)，lipospondin(n-elaidoyl-kfk)及其保守置换的类似物，n-乙酰基-rkr-nh2(肽ck )，n-biot-ghk(来自sederma)，pal-kavak，pal-kβalak，pal-kabuk，pal-kacak，或pal-kmo2k(来自sederma的)，pal-kvk(dsm的syn-coll
tm
)，及其衍生物。
[0058]
本文还可以提及wo2015181688申请中所述的通式x-pro*-pro*-xaa-y的抗衰老三肽，其中xaa选自leu、arg、lys、ala、ser和asp，在n末端，x选自h、-co-r1和-so
2-r1，并且在c末端，y选自oh、or1、nh2、nhr1或nr1r2，r1和r2彼此独立地选自烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、烷氧基和芳氧基基团，其可以是直链、支链、环状、多环、不饱和、羟基化、羰基化、磷酸化和/或硫化的，所述基团在其骨架中可能具有杂原子，特别是o、s和/或n，并且pro*对应于脯氨酸、其类似物或衍生物；包括，例如，myr-ppl-oh和myr-ppr-oh。
[0059]
本文还可以进一步引用wo2014/080376中所述的通式x-(xaa1)n-pro*-xaa
2-y的促色素形成和/或pro-mec二肽和三肽，其中n＝0、1或2，xaa1是选自ala、val、met、leu、iso、phe、pro及其类似物和衍生物的疏水性氨基酸；或选自ser、thr、tyr、asp、glu及其类似物和衍生物的极性氨基酸；且n＝2时，两个氨基酸xaa1可以相同或不同；xaa2是选自ala、val、met、leu、iso、phe及其类似物和衍生物的疏水性氨基酸；选自arg、lys、his及其类似物和衍生物的碱性氨基酸；在n末端，x选自h、-co-r1和-so
2-r1；在c末端，y选自oh、or1、nh2、nhr1或nr1r2；r1和r2彼此独立地选自烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、烷氧基和芳氧基基团，其可以是直链、支链、环状、多环、饱和、不饱和、羟基化、羰基化、磷酸化和/或硫化的，所述基团在其骨架中具有或不具有o、s和/或n杂原子，并且pro*对应于脯氨酸、其类似物或衍生物；其包括例如下列肽：pal-spr-oh，pal-ppr-oh，pal-qpa-oh，pal-lpaoh，myr-spa-oh，pal-pm-oh，pal-pa-oh和pal-pp-oh。
[0060]
用作根据本发明的附加肽的合适的四肽衍生物包括，但不限于：pal-ktfk(seq id no 6)或ela-ktfk(seq id no 14)，ela-ktak(seq id no 15)，ela-kayk(seq id no 16)或ela-kfyk(seq id no 17)。用作本文所述的附加肽的合适的五肽衍生物包括，但不限于：pal-kttks(seq id no 4)(可获自来自sederma的)，pal-yggfxaa(seq id no 18)，其中xaa为leu或pro，或其混合物。
[0061]
用于本文的合适的六肽衍生物包括，但不限于：pal-vgvapg(seq id no 8)，pal-gkttks(seq id no 19)，pal-hldiixaa(其中xaa为trp、phe、tyr、tic、7-羟基-tic或tpi)(seq id no 20)及其衍生物。还可以提到pal-ghk和pal-gqpr(seq id no 5)(3000，sederma)的混合物。
[0062]
还可以提及下列的市售肽作为附加的活性成分：
[0063]-由pentapharm销售的vialox
tm
(inci名称＝五肽-3(包含丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸的合成肽))、syn-ake
tm
(β-ala-pro-dab-nh-bzl)或syn-coll
tm
(pal-lys-val-lys-oh)；
[0064]-由lipotec销售的argireline
tm
(ac-glu-glu-met-gln-arg-arg-nh2(inci名称＝乙酰基六肽-3)(seq id no 21)、leuphasyl
tm
(tyr-d-ala-gly-phe-leu)(seq id no 22)、aldenine
tm
(gly-his-lys)、trylagen
tm
(inci名称＝假交替单胞菌(pseudoalteromonas)发酵提取物、水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽-10瓜氨酸(瓜氨酸和三肽-10(天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物))，三肽-1)、eyeseryl
tm
(ac-β-ala-his-ser-his)(seq id no 23)、serilesine
tm
(ser-ile-lys-val-ala-val)(seq id no 24)或decorinyl
tm
(inci名称：三肽-10瓜氨酸＝瓜氨酸和三肽-10(天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物)；
[0065]-由vincience销售的collaxyl
tm
(gly-pro-gln-gly-pro-gln(seq id no 25))或quintescine
tm
(cys-gly)；
[0066]-由les laboratoires serobiologiques/cognis销售的cytokinol
tm
ls(酪蛋白水解产物)；
[0067]-由l’lnstitut europ
é
en de biologie cellulaire销售的kollaren
tm
(gly-his-lys)、ip2000
tm
(pal-val-tyr-val)或meliprene
tm
(inci名称＝单氟六肽-1：乙酸与包含精
氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、正亮氨酸、对-氟苯丙氨酸和色氨酸的合成肽的反应产物)；
[0068]-由innovations销售的neutrazen
tm
(pal-his-d-phe-arg-nh2)；或
[0069]-由lnfinitecactivos销售的bont-l-peptide
tm
(inci名称＝棕榈酰六肽-19：棕榈酸和六肽-19(由天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸组成的合成肽)的反应产物)、timp-peptide
tm
(inci名称＝乙酰基六肽-20：通过六肽-20(由丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸和脯氨酸组成的合成肽)的乙酰基化获得的反应产物)或ecm moduline
tm
(inci名称＝棕榈酰三肽-28：棕榈酸和三肽-28(由精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸组成的合成肽)的反应产物)。
[0070]
还有可能想到将根据本发明的植物细胞与一种或多种环肽组合，尤其是本技术人的专利申请fr1850845中描述的从亚麻籽油提取的那些。
[0071]
根据本发明，还提供了改善皮肤及其附属器官的美学外观的方法，包括向皮肤局部应用有效量的根据本发明的美容或皮肤病学组合物，诸如上面描述的那些。
[0072]“局部处理”或“局部使用”意指根据本发明，意图在其应用的部位发挥作用的应用，所述应用的部位为：皮肤、粘膜和/或附属器官。
[0073]
根据本发明的组合物可以局部应用到被靶向区域。
[0074]“有效”量取决于各种因素，诸如人的年龄、皮肤和附属器官的状况、一种或多种病症或病理学的严重性、施用方式等。有效量意指足以更显著或不太显著地实现期望效应的无毒量。
[0075]
本文中使用的所有百分比和比率是基于总组合物的重量，并且所有测量是在25℃下进行的，除非另外指出。
[0076]
例如，对于面部的美容处理，欧洲化妆品指南设定了施用霜剂的标准量为2.72mg/cm2/天/人，身体乳液的标准量为0.5mg/cm2/天/人。
[0077]
根据其他具体特征，根据本发明的美容处理方法可以与一种或多种靶向皮肤的其他处理方法组合，所述其他处理方法诸如鲁米诺疗法(lumino-therapy)、热、震动、电穿孔、微针贴片或芳香疗法处理。
[0078]
根据本发明，可以推荐具有几个小室的装置或试剂盒，以应用上述方法，其可以包括(例如但非限制性的)：第一小室含有包含本发明的活性成分的组合物，以及在第二小室中，含有赋形剂和/或另一种活性成分和/，在这种情况下，认为所述第一和第二小室中所含的组合物是用于时间上同时、分开或逐步使用的组合组合物，尤其是在上面提及的一个处理方法中。
[0079]
根据本发明的组合物还适合用于以合适剂量对皮肤的治疗性处理。
附图说明
[0080]
根据下面对实施方案以及体外和体内测试的详述将更好地理解本发明。
[0081]
此详述参照附图进行描述，在附图中：
[0082]
图1图示了在根据本发明的美容处理之前(图的左部)和处理之后(图的右部)在同一人的照片上眼睑皱纹上的皮肤松垂的改善；
[0083]
图2显示了在口角处的木偶纹定位；
[0084]
图3图示了在根据本发明的美容处理前在显微镜下(在免疫组织化学标记弹性蛋
白后)同一人的照片上的弹性纤维网络的改善；
[0085]
图4与图3相似，显示了处理5天后的结果；
[0086]
图5也图示了在根据本发明的处理前通过对同一人的条纹投影捕获的图像上眼睑皱纹水平上的皮肤松垂的改善；以及
[0087]
图6与图5相似，显示了处理后的结果。
[0088]
a/根据本发明的优选化妆制剂的实例，形成旨在用于制造盖伦制剂的浓缩成分(参见下面的段落c/)
[0089]
根据本发明的黄杞叶提取物的制备实施例：经粉碎的正黄杞叶在15％乙醇回流中提取(15g叶在100ml中)。冷却后，通过粗过滤去除叶。冷却后，过滤提取物，然后通过真空蒸发乙醇进行浓缩。然后将构成干提取物的干残渣在基质中配制，所述基质例如甘油/水(大约80/20)。
[0090]
在化妆品工业中使用的活性成分通常包含相对于所述成分的总重量的0.1％-20％重量的干提取物，优选1％-5％。
[0091]
此成分通常在可在皮肤上应用的化妆品制剂中以相对于所述化妆品制剂的总重量的0.1％-20％，优选1％-10％，更优选2％-5％重量的所述成分配制。
[0092]
b/体外功效测试
[0093]
对等份的根据本发明的提取物，在0.5；1；2或3％的此提取物的情况下以1.11％重量的干提取物(下文称为“根据本发明的提取物”)进行测试。这些剂量对应于根据本发明的提取物被推荐用于根据本发明的美容处理时的剂量。这些等份由在测试赋形剂(例如培养基)中稀释的干提取物制成。
[0094]
1/成纤维细胞产生弹性蛋白
[0095]
原则
[0096]
使用来自多个接近绝经期的老年女性的真皮的人成纤维细胞。
[0097]
实验方案
[0098]
当细胞达到汇合时，使细胞与根据本发明的提取物在培养基中接触或不接触(对于对照例)，然后在37℃和5％co2温育5天。在此接触后，将细胞层冲洗，固定，并用抗弹性蛋白抗体染色。使用荧光二抗显影标记，在显微镜下拍摄照片。对这些照片进行图像分析能够定量弹性蛋白的产生。使用标记dna的荧光染料hoescht 33258对核进行复染，以评价细胞群体，因此对获得的荧光数据进行加权处理。
[0099]
结果
[0100]
接近绝经期的供体的成纤维细胞的弹性蛋白产生的变化。0.5％的根据本发明的提取物与对照相比的效应(n＝3):
[0101]
表1
[0102]
供体的年龄44岁47岁48岁根据本发明的提取物与对照相比 63％ 53％ 94％显著性p《0.01p《0.01p《0.01
[0103]
这些结果显示根据本发明的提取物刺激成纤维细胞产生弹性蛋白。
[0104]
2/成纤维细胞产生的弹性纤维的质量
[0105]
实验方案
[0106]
在如上的同一培养物上，在对照片二值化后，可以利用图像分析系统评价纤维质量，评价三个参数：培养中产生的纤维的长度，产生的纤维数目和形成的网络的复杂性，每个参数减去使用hoescht 33258法复染的细胞数，从而对信息进行加权处理。
[0107]
结果
[0108]
44岁供体的成纤维细胞产生的弹性纤维质量的变化：纤维长度，纤维数目和网络的复杂性。0.5％的根据本发明的提取物与对照相比的效应(n＝3):
[0109]
表2
[0110] 纤维长度纤维数目网络复杂性根据本发明的提取物与对照相比x 12.5x 14.5x 16.7显著性p《0.01p《0.01p《0.01
[0111]
使用的图像分析系统显示得益于根据本发明的处理，与对照例相比纤维更长(x 12.5)，更茂密(x 14.5)且更多的连接(x 16.7)。这在图3和4的图像上清楚地看到。
[0112]
3/成纤维细胞产生弹性蛋白mfap4和纤蛋白5(它们是标记弹性纤维的蛋白)
[0113]
原则
[0114]
本测试是对前面测试的补充，提供了关于产生构造弹性纤维的三个关键蛋白的定量数据。该测试通过lc-ms/ms(液相色谱质谱联用法)实现。
[0115]
实验方案
[0116]
0.5％的根据本发明的提取物与正常人成纤维细胞(nhf)接触或不接触(对照例)7天。此接触后，用适宜的缓冲液冲洗细胞层，并按量加入蛋白。回收等分试样的这些冲洗过的细胞，它们都含有相同量的蛋白，并使用蛋白酶特异性切割，形成大小不一的肽片段。首先，肽通过液相色谱根据它们的疏水性来分离，然后电离，然后在检测器中根据它们的质量和它们的电荷(m/z)将它们分类来分离。使用软件(mascot
tm
)来分析每个元素的质量和电荷并推算预先存在的蛋白的存在和量。然后，通过生物信息学/生物统计学分析处理这些数据来鉴定由根据本发明的提取物调控的生物学过程和代谢通路。结果表示为经处理的实例和对照例之间的表达比率。大于1.5的比率被认为是靶蛋白产生增加(相对于对照 50％)。进行方差研究和student t检验来判断结果的显著性。
[0117]
结果
[0118]
弹性纤维形成中三个关键蛋白的变化。通过lc-ms/ms定量。0.5％的根据本发明的提取物与对照相比的效应(n＝3)：
[0119]
表3
[0120] 弹性蛋白mfap4纤蛋白5根据本发明的提取物与对照相比x 12.6x 3.24x 1.6显著性p《0.01p《0.01p《0.01
[0121]
这些蛋白组学数据证实根据本发明的提取物确实能够刺激弹性蛋白和成熟弹性纤维的两个基本元件的产生。
[0122]
4/皮肤外植体上的表皮连接(dej)和角质形成细胞的保留
[0123]
实验方案
[0124]
为了证实根据本发明的提取物对两个dje成分(胶原蛋白iv和层粘连蛋白5)的效应，将含有3％该提取物的凝胶或安慰剂凝胶在接近绝经期的女性的皮肤外植体的表面上
每天涂擦一次。然后，选择皮肤，并通过免疫组织化学显现胶原蛋白iv和层粘连蛋白5合成(利用对待测定蛋白特异的一抗标记切片，通过对一抗特异的荧光二抗对此标记显影)。然后，通过对拍摄的照片的图像分析来定量此标记的强度。
[0125]
此外，0.5％的根据本发明的提取物或其安慰剂(对照)应用于培养的人角质形成细胞上，并在冲洗后通过elisa对细胞提取物测量胶原蛋白vii合成。结果减去通过使用标记dna的荧光染料hoescht 33258对细胞核进行复染标记评价的细胞数量。
[0126]
结果
[0127]
在皮肤外植体上刺激胶原蛋白iv和层粘连蛋白v合成。3％的根据本发明的提取物的效应(n＝5)：
[0128]
表4
[0129] 胶原蛋白iv变化(％)层粘连蛋白v变化(％)安慰剂参照参照3％的根据本发明的提取物 27％；p《0.01 17％；p《0.01
[0130]
通过elisa法对培养的人角质形成细胞测量的胶原蛋白vii合成变化。根据本发明的提取物的效应(n＝3):
[0131]
表5
[0132] 胶原蛋白vii变化(％)对照参照0.5％的根据本发明的提取物 36％；p《0.013％的根据本发明的提取物 148％；p《0.01
[0133]
所有这些结果显示根据本发明的提取物通过刺激此jde的三种基本组分的合成对dje有直接加强作用：胶原蛋白vii( 148％；p《0.01)，在角质形成细胞上显示；胶原蛋白iv( 27％；p《0.01)和层粘连蛋白v( 17％；p《0.01)，在皮肤外植体上显示。
[0134]
就dje紊乱而言，根据本发明的提取物因此可以通过对抗柔韧性和弹性的损失来改善皮肤的衰老。
[0135]
5/收缩性和细胞回弹性
[0136]
原则
[0137]
成纤维细胞的收缩功能对于确保皮肤的良好弹性是很重要的。在成纤维细胞上应用糖化物质(mgo:甲基乙二醛)能够模拟加速衰老期间发生的成纤维细胞的收缩性丧失。
[0138]
实验方案
[0139]
使成纤维细胞与无毒量的mgo接触2天，在存在或不存在根据本发明的提取物的情况下进行。在此接触后，将所述细胞包含在胶原蛋白凝胶中以形成称为晶格的真皮等价物。成纤维细胞将它们自身锚定到胶原蛋白并且开始接触凝胶如同它们在皮肤中那样。16h后收缩，并使用imagequant las4000成像仪追踪凝胶表面上的改变测量收缩。
[0140]
结果
[0141]
经受应力的成纤维细胞收缩的变化。0.5％的根据本发明的提取物的效应(n＝3):
[0142]
表6
[0143]
凝胶表面在16h时的凝胶收缩(％)收缩变化的减少(％)
不含mgo的对照100％参照mgo59.9％40.1；p《0.01mgo 0.5％根据本发明的提取物93.8％-6.2％；nsd
[0144]
nsd:无显著性差异
[0145]
这些结果显示无细胞毒性量的mgo强烈地延缓了对照例中的收缩(与没有经受应力的对照相比-40％)并且0.5％的根据本发明的提取物的存在可以避免这种收缩延缓，并且恢复了收缩值，与没有经受应力的对照没有显著差异。
[0146]
c/根据本发明的组合物的盖伦/制剂的实施例
[0147]
该组合物是含有上面a/章节中所述的活性成分的化妆霜剂，干黄杞提取物的重量为1.11％。
[0148]
表7
[0149][0150][0151]
可以优选地向此组合物中加入刺激细胞外基质(尤其是胶原蛋白)分子的成分，诸
如：
[0152]-和/或
[0153]-如上所述，由sederma销售。
[0154]
任选地，可以加入其它成分，例如：
[0155]
用于敏感性皮肤的舒缓成分，诸如pacifeel
tm
，由sederma销售，包含紫茉莉(mirabilis jalapa)的提取物。
[0156]
保湿成分诸如：
[0157]-aqualance
tm
，由sederma销售，由龙虾肌碱和赤藓糖醇构成的渗透保护保湿活性成分。
[0158]-revidrate
tm
，由sederma销售，它尤其改善表皮的粘着及其水合。
[0159]
作用于肤色焕发的成分，诸如evermat
tm
，由sederma销售，包含富含原小檗碱(protoberberines)和齐墩果酸的绿化恩南番茄(enantia chlorantha)提取物的组合；减少毛孔孔径和亮度；精修易发痤疮皮肤的纹理。
[0160]
保湿/平复成分，诸如optim hyal
tm
，由sederma销售，含有具有类似于透明质酸片段的结构的乙酰化葡萄糖醛酸寡糖。
[0161]
皮脂调控剂成分诸如：
[0162]-sebuless
tm
，由sederma销售，包含通过体外细胞培养获得的欧丁香(syringa vulgaris)的提取物，它是一种皮脂调控剂，净化、控油和清爽肤色，并且遮瑕。
[0163]-poretect
tm
，由sederma销售，包含以cylolinopeptide和洋川芎内脂(senkyunolides)滴定的亚麻籽和芹菜提取物的组合，其对皮肤提供紧致、色调和密度，由此强化了毛孔-保持结构，该毛孔-保持结构随着衰老而塌陷。
[0164]
作用于皮肤/皮肤屏障的弹性特性的成分诸如：
[0165]-idealift
tm
，由sederma销售，包含n-乙酰基-酪胺酰-精氨酰-o-十六烷基酯脂质二肽，对抗面部的松弛并提高对重力的抗性，尤其是通过刺激弹性蛋白。
[0166]-dermaxyl
tm
，由sederma销售，组合了神经酰胺2，角质层的粘合剂，和pal-val-gly-val-ala-pro-gly，棕榈酰化matrikine，其平复皱纹并修复皮肤屏障。
[0167]
抗疲劳成分，诸如prodizia
tm
，由sederma销售，包括合欢(albizia julibrissin)提取物，它通过修复和保护皮肤免受糖化引起的损害来促进疲劳体征可见的减少：黑眼圈，眼袋，肤色暗淡和憔悴面容。
[0168]
防污染成分，诸如citystem
tm
，由sederma销售，基于体外从欧夏至草获得的具有高连翘酯苷b浓度的植物细胞；用来对抗污染攻击：使皮肤柔软和光滑，精修皮肤纹理，减少黑头的可见性，使皮肤明亮和纯净。
[0169]
d/体内研究
[0170]
原则
[0171]
在两个补充研究期间对总计90名女性志愿者评价本发明的美容处理的功效：一个为白种人小组，另一个为中国志愿者。她们的面部均存在明显的衰老体征：皮肤松垂，面容、凹陷和轮廓丧失协调性，在此区域中丧失皮肤弹性。所有志愿者接近绝经期的平均年龄或绝经期后数年。进行的研究使用计量学方式(测量)、专家分析(判断)和自我评估(感知效果)。
[0172]
这两项研究彼此独立进行，允许评价面部松垂、粘弹性特性的丧失、以及皱纹和凹陷(relief)的改变。
[0173]
它们在两个月的时间内进行，与安慰霜剂对比，由下列构成：
[0174]
面容的协调
[0175]-使用条纹投影装置测量面部轮廓
[0176]-使用条纹投影装置测量面部垂肉
[0177]-由专家从照片评价垂肉
[0178]
面部的粘弹性特性：
[0179]-使用elastimeter
tm
测量垂肉弹性，
[0180]-使用cutometer
tm
测量面部皮肤弹性，
[0181]-使用cutometer
tm
测量应力后面部皮肤回弹性/回复。
[0182]
眼睑外观：
[0183]-使用条纹投影装置测量眼睑皱纹高度，
[0184]-使用条纹投射装置测量此皱纹的体积，
[0185]-使用条纹投射装置测量皱纹面积，
[0186]-由专家从照片评价眼睑的下垂外观，
[0187]-由志愿者感知眼睛的疲乏外观。
[0188]
口周的木偶纹：
[0189]-通过条纹投影测量木偶纹深度
[0190]-由专家评价口周下垂的照片
[0191]-由专家视觉和触觉评价粗糙度
[0192]
实验方案
[0193]
在法国对白种人志愿者进行研究，最多38名女性志愿者，平均年龄为57岁(49-66岁)。关于根据绝经期后的年数的志愿者分布，60％为绝经期后0-5年(包括34％的0-2年)，40％为绝经期后6-10年(包括32％的6-8年)。
[0194]
在中国(广州)对中国志愿者进行研究，最多52名女性，平均年龄为56岁(51-60岁)，进入绝经期确定少于7年。
[0195]
研究类型、持续时间和应用
[0196]
志愿者不知晓她们正在她们的面部上应用8周的产品的类型(活性物质或安慰剂)。
[0197]
38名女性的小组如下分成两组：
[0198]-20名女性早晚应用根据本发明的霜剂(表7中描述的霜剂)
[0199]-18名女性早晚应用安慰剂霜剂(相同的配方，但不含根据本发明的活性成分)
[0200]
在应用前后，根据下面的表8，在几个装置上获得不同的测量和入组。
[0201]
表8
[0202]
t0
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》t8周条纹投射(轮廓，垂肉，眼睑)条纹投射(轮廓，垂肉，眼睑)弹性(elastimeter
tm
)弹性(elastimeter
tm
)照片(专家判断，自我评估)照片(专家判断，自我评估)
[0203]
52名中国女性的小组如下分成两组：
[0204]-26名女性早晚应用根据本发明的霜剂(表7中描述的霜剂)
[0205]-26名女性早晚应用安慰剂霜剂(相同的配方，但不含根据本发明的活性成分)。
[0206]
根据下面的表9，在应用前后进行不同的测量。
[0207]
表9
[0208]
t0
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》t4周
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
》t8周条纹投射(木偶纹)条纹投射 弹性，回弹性(cutometer
tm
) 弹性，回弹性临床评价(粗糙度)临床评价临床评价照片照片照片
[0209]
统计学
[0210]
使用相关student t检验、非参数wilcoxon检验或mann-whitney检验进行统计学研究。为了与t0比较效应，对配对系列进行双侧检验。为了产品彼此比较，对未配对系列进行双侧检验。对于问卷评价，使用khi-2检验。
[0211]
方法和结果
[0212]
1.面部特征松垂的评价：轮廓/垂肉
[0213]
关于面部轮廓(面部椭圆形)的测量，志愿者安置条纹投射工作台上，并组合进行立体测量以确保志愿者在几周后准确地以相同的方式定位。特征阴影(条纹)投射到面部上，通过三角测量法测量由皮肤凹陷引起的它们的变形。此技术允许对凹陷三维重建。在两个时间之间使用相同解剖学标志测量已发展的轮廓的长度。
[0214]
对于垂肉，在两个时间点在刚好相同的位置处测量下颌上出现垂肉的皮肤区域的体积。
[0215]
1.1.条纹投射:根据本发明的处理对松垂的面部轮廓和垂肉的变化的作用
[0216]
表10
[0217][0218]
nsd:与t0相比没有显著差异
[0219]
这些结果显示：与安慰剂相比，在使用根据本发明的处理的志愿者中面部轮廓有
显著改善(-5.1％；p《0.05)。
[0220]
此外，垂肉有显著改善，与t0相比，在根据本发明的处理后其体积显著减小(-8.2％，p《0.06)，在使用安慰剂的志愿者则不是这样(nsd)。两组之间的差异明显地支持了根据本发明的处理，因为观察到总计减少-11.4％，相对于安慰剂是显著的(p《0.05)。因此面部被紧致并更协调。
[0221]
1.2.对垂肉的标准化照片的专家评价
[0222]
在t0和t8周使用装有高清数字摄影机的照片工作台、专用照明和用来在不同的时间点将志愿者进行相同定位的系统拍摄标准化照片。6名专家检查照片并判断垂肉改善(面部皮肤松垂的减少)。
[0223]
结果表明：在使用根据本发明的处理的志愿者中，垂肉明显改善，与t0相比，在34％的病例中出现较少的松垂。专家指出：在使用安慰剂的志愿者中仅在14％的志愿者中感知到改善。本发明/安慰剂差异是显著的(p《0.05)，支持了根据本发明的处理。
[0224]
1.3.面部皮肤的生物机械特性的评价
[0225]
使用elastimeter
tm
(它可以以高度可再现的方式测量皮肤弹性)对白种人小组测量垂肉的皮肤的弹性。此测量工具使用装有活塞的探头，活塞使用金属棒对皮肤施加恒定的变形。记录皮肤对此变形的抗力。该装置具有追踪系统，所述追踪系统识别与皮肤的接触。
[0226]
使用mpa580在中国志愿者中测量在变形时颊部皮肤的弹性和回弹性。该装置直接来源于它将皮肤抽吸到小管中。它被广泛用来评价化妆产品的效果。它已经用来显示皮肤的生物机械特性变化和志愿者的年龄之间的相关性，尤其是面部(mondon等人，2010)。研究的参数为ur/ue和ur/uf比率，两者与皮肤弹性密切相关。当评价化妆产品的抗衰老效应时推荐这些参数(krueger等人，2011)。
[0227]
1.3.1获得的elastimeter
tm
结果：垂肉皮肤弹性变化；n＝35；5次测量/部位：
[0228]
表11
[0229][0230][0231]
这些结果显示：应用了根据本发明的霜剂的志愿者的皮肤的弹性特性提高了8.18％。与安慰剂霜剂相比这是显著的(p《0.05)，安慰剂霜剂没有产生任何变化(-0.17，nsd vs t0)。
[0232]
1.3.2.获得的cutometer
tm
结果：垂肉皮肤弹性参数的变化；n＝51名志愿者，n＝3次测量/部位：
[0233]
表12
[0234][0235]
利用中国志愿者获得的这些结果充分证实了利用白种人志愿者获得的结果。结果显示，在绝经后女性的面部上，根据本发明的霜剂的使用非常有利地提高了所研究的年龄相关弹性参数。与安慰剂相比，弹性为14％(p《0.05)，对于皮肤回复率为10.7％更好(p《0.05)。
[0236]
2.眼睑评价(皱纹、下垂的外观、疲乏)
[0237]
2.1.眼睑皱纹的评价
[0238]
根据使用条纹投射的实验方案(图5和6中所示)对白种人志愿者研究皱纹。提取眼睑的眼袋的三个参数：最大高度、体积和占用面积。
[0239]
结果：上眼睑皱纹，眼睑皱纹的高度和体积的变化；n＝29
[0240]
表13
[0241][0242]
结果：上眼睑皱纹，占用表面的变化；n＝29:
[0243]
表14
[0244][0245]
这些结果显示：在使用两个月以后，根据本发明的处理可以非常显著地减少上眼睑的皱纹。平行地，使用安慰剂有趋势减少参数之一(体积)，尽管不显著。
[0246]
与安慰剂相比，最大高度显著减少24.7％(p《0.05)。根据本发明此皱纹的体积大大减小(-32％，p《0.05vs安慰剂)。此外，必须注意：与安慰剂例相比，此小皱褶的投射表面积显著减少30％(p《0.01)。
[0247]
2.2.对下垂的眼睑参数的专家评价
[0248]
使用段落1.2中所述的技术。6名专家检查照片并判断白种人小组的眼睑的下垂外观。
[0249]
结果表明：对于使用根据本发明的霜剂的志愿者，有显著改善，即，与t0相比，在
51％的个例中眼睑出现较少的下垂。专家指出：在使用安慰剂的15名志愿者中仅有31％感知有改善。
[0250]
20％的差异是显著的(p《0.05)支持了本发明(图1中所示，在图1中清楚地看到眼睑紧致，很明显皱纹不太容易看到)。
[0251]
2.3.志愿者对眼睛疲乏参数的评价
[0252]
在使用根据本发明的霜剂两个月后，38名白种人志愿者在镜子前判断她们的眼睛是否看上去有或多或少的疲惫。
[0253]
结果表明：对于使用根据本发明的霜剂的20名志愿者，有显著的改善，即，与t0相比，在80％的个例中眼睛看上去不太疲惫。对于使用安慰剂的18名志愿者，仅在39％的个例中感知到有改善。41％的差异是非常明确的，支持了本发明(p《0.01vs.安慰剂)。
[0254]
3.对木偶纹(口)和凹陷的评价
[0255]
对中国志愿者评价这些参数。将她们安置在组合了立体测量工具(细节见上)的条纹投射系统中。也拍摄志愿者的照片。
[0256]
3.1 1个月后木偶纹的深度(图2)
[0257]
结果：1个月后木偶纹的深度变化；n＝52:
[0258]
表15
[0259][0260][0261]
结果显示：对于使用根据本发明的霜剂的志愿者，相对于t0，木偶纹的深度有6.9％的减少趋势，而对于使用安慰剂的志愿者，在此相同的一个月时期后观察到7.9％的皱纹明显加深。然而，两种情况的比较支持了本发明，因为14.8％的差异是显著的(p《0.05vs.安慰剂)。
[0262]
3.2.皮肤凹陷
[0263]
3.2.3眼角鱼尾纹周围的皮肤凹陷
[0264]
对白种人志愿者评价此参数。监控眼角鱼尾纹的粗糙度参数。每个个例建立50个连续的曲线。
[0265]
结果：眼角粗糙度的改变；n＝30
[0266]
表16
[0267][0268]
结果显示：在应用根据本发明的霜剂8周后，皮肤的凹陷改善。实际上，粗糙度总共有20％减少。安慰剂也有更温和的作用。然而，产品和安慰剂之间的差异是显著的，支持本发明(-9.5％；p《0.05)。
[0269]
3.3.1个月后对粗糙度的评价
[0270]
对中国志愿者评价此参数。除了上面看到的计量学方面(显示眼角粗糙度清晰地改善)以外，在t0和在1个月时专家使用从柔软(0)到僵硬(9)的10点评分量表通过视觉和触觉评价志愿者的皮肤粗糙度。
[0271]
结果：1个月后志愿者的面部皮肤粗糙度的变化；n＝52:
[0272]
表17
[0273][0274]
这些结果表明：专家清楚地观察到应用根据本发明的霜剂的志愿者的面部粗糙度有改善(-5.6％vs.t0，p《0.01)。与应用安慰剂的志愿者相比，差异是明显的，支持本发明(-4.6％vs.安慰剂；p《0.05)。