一种评价磁珠包被工艺的方法与流程

1.本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种评价磁珠包被工艺的方法。


背景技术：

2.化学发光免疫分析(clia)是将免疫反应与化学发光反应相结合，用于检测样本中微量抗原/抗体的一种高灵敏度、高效、可重复性高的领先的分析技术。该技术中最常见的模式为选取一对可与待测样本结合的抗体/抗原，其中一株抗体/抗原包被在固相载体上，另一株被发光物质标记，检查过程中，二者同时结合样本中的抗原/抗体，形成夹心结构(成为夹心法)；与此同时，clia的方法学还包括竞争法、间接法和捕获法，上述方法中，均会涉及一种将抗体/抗原包被在固相载体上并制备成固相试剂的工艺方法，传统固相载体为聚苯乙烯/聚氯乙烯制成的微孔板，随着科学研究的不断深入，超顺磁珠应运而生。
3.磁珠法化学发光是将抗体/抗原等活性物质包被在磁珠的表面，检测时，待检物、包被有抗体/抗原的磁珠和化学发光分子标记的抗体/抗原一起孵育，抗原抗体反应结合后，在外部磁场作用下，磁珠由于磁性聚集在一起，洗涤后，便可实现结合部分和未结合部分的分离，最后对化学发光分子进行激发，以检测信号。磁珠是化学发光、核酸提取等体外诊断产品的重要“核芯”原料，既作为反应固相又作为分离的载体。整个磁珠包被蛋白工艺过程中，环节因素较多，受不同类型包被物、不同类型磁珠、偶联过程中所涉及的包括偶联缓冲液ph、偶联物比例、偶联反应时间、温度以及工作缓冲溶液体系等因素影响，各环节因素的改变均会导致不同的包被效果，从而直接影响clia固相试剂的整体性能及其长期稳定性。
4.目前市场磁珠种类繁多，各厂家提供的包被工艺五花八门，从宣传效果上很难分别优劣，若以适用于一种磁珠的工作体系去对另一种磁珠作出评价并不客观准确。且如果要验证固相试剂的长期稳定性，按照传统方式需要通过试剂的长期留样去观察检测，拉长了验证周期。因此需要开发一种能够快速准确评价磁珠包被工艺的方法，在不同的工艺中，选出适宜的磁珠包被工艺，以使在该工艺下制得的包被磁珠在后续的化学发光免疫分析中具有较好的使用性能和稳定性能，为后续化学发光免疫分析提供了保障。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种评价磁珠包被工艺的方法，通过此方法能够快速且较客观地对不同的磁珠包被工艺做出准确的评价。
6.为解决上述问题，本发明提供一种评价磁珠包被工艺的方法，包括以下步骤：
7.s1、在不同工艺条件下制备包被磁珠；
8.s2、对步骤s1制得的包被磁珠进行偶联效率、沉降速率、镜检观察、反应的信噪比和灵敏度、热稳定性和zeta电位的检测；
9.s3、基于步骤s2的检测结果进行分析，评价磁珠包被工艺的优劣。
10.本发明提供的方法适用于不同类型的磁珠，例如，羧基磁珠、链霉亲和素磁珠、氨
基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠或nhs磁珠等，不同类型的磁珠包被工艺均有其特殊性，即使在不同反应条件下制得包被磁珠，但根据理化性质和实际测量结果均能较客观准确地对磁珠包被工艺进行评估，在较优工艺条件下得到的包被磁珠在后续的测试中具有较好的整体性能和稳定性。
11.进一步地，在步骤s1中，制备包被磁珠的工艺条件可以是不同磁珠类型、不同偶联缓冲液及ph、不同反应时间、不同反应温度和/或不同偶联物比例，优选地，偶联缓冲液的ph＝5.0-9.0，偶联反应时间为0.5-20h，偶联反应的温度为4-37℃，偶联物比例为10-40ug/mg。
12.进一步地，在步骤s1中，偶联缓冲液包含缓冲剂和无机盐，缓冲剂为 mes缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和碳酸盐缓冲剂中的任意一种，无机盐为氯化钠。
13.进一步地，在步骤s2中，包被磁珠的工作液是通过固相稀释液进行配置的，固相稀释液的配置方法为：将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、金属螯合剂、防腐剂、阻断剂和化学保护剂依次溶解到纯化水中，调节ph＝6.0～8.0，用0.22μm的滤膜过滤。
14.进一步地，在步骤s3中，偶联效率为一级评价指标，偶联效率越大则包被工艺越好。
15.进一步地，在步骤s3中，热稳定性为二级评价指标，偶联效率差值小于5％时，热稳定性的变化幅度越于则包被工艺越好。
16.进一步地，在步骤s3中，反应的信噪比和灵敏度为三级评价指标，热稳定性的变化幅度差值小于5％时，反应的信噪比和灵敏度的相关因数值越大则包被工艺越好。
17.进一步地，在步骤s3中，zeta电位为三级评价指标，热稳定性的变化幅度差值小于5％时，zeta电位的绝对值越大则包被工艺越好。
18.进一步地，在步骤s3中，镜检观察为四级评价指标，反应的信噪比和灵敏度的相关因数差值小于5％或zeta电位的绝对值差值小于5％时，镜检平面图像分散性越好则包被工艺越好。
19.进一步地，在步骤s3中，沉降速率为四级评价指标，反应的信噪比和灵敏度的相关因数差值小于5％或zeta电位的绝对值差值小于5％时，沉降速率越慢则包被工艺越好。
附图说明
20.图1为本发明实施例提供的四组磁珠的偶联效率图。
21.图2为本发明实施例提供的四组磁珠的沉降速率图。
22.图3为本发明实施例提供的编号为s1-21磁珠的镜检观察图。
23.图4为本发明实施例提供的编号为s1-22磁珠的镜检观察图。
24.图5为本发明实施例提供的编号为s1-23磁珠的镜检观察图。
25.图6为本发明实施例提供的编号为s1-24磁珠的镜检观察图。
26.图7为本发明实施例提供的四组4℃磁珠的测试反应性结果图。
27.图8为本发明实施例提供的四组37℃磁珠的测试反应性结果图。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中
的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明的实施例中，使用的全自动化学发光免疫分析仪(ms-i3080) 是由宁波美康盛德生物科技有限公司提供，采用的试剂和实验设备均为市售产品，采用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
30.本实施例一是通过链霉亲和素磁珠进行详细说明的。
31.1、配制甲胎蛋白抗原校准品
32.用校准品稀释液将甲胎蛋白抗原中间品配置成六个浓度的校准品，每个浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、 2000ng/ml，并分别记为s1-01、s1-02、s1-03、s1-04、s1-05、s1-06，按每瓶0.5ml分装，-20℃保存备用。在本实施例中，标准品稀释液由 0.01～0.05mol/l磷酸盐缓冲液、0.1％～2％bsa、0.9％～5％nacl和0.1％ pc-300的物料配制而成，ph＝6.5。
33.2、配制固相试剂稀释液
34.将缓冲剂、无机盐、蛋白保护剂、表面活性剂、金属螯合剂、防腐剂、阻断剂和化学保护剂依次溶解到纯化水中，调节ph＝6.0～8.0，定容后用 0.22μm的滤膜过滤，2-8℃保存备用。
35.具体地，固相试剂稀释液的配制方法如表1所示：
[0036][0037][0038]
值得一提的是，固相稀释液的配制可以根据所选磁珠、抗体或抗原进行调整，在本发明中不受限制。例如，缓冲剂也可以是hepes、mes、pipes 或磷酸盐中的一种；无机盐也可以是氯化钾、氯化镁或氯化钙中的一种；表面活性剂也可以是吐温80、曲拉通-405、聚氧乙烯月桂醚或np-40中的一种；金属螯合剂可以是羟乙基乙二胺三乙酸、黄原酸酯类和聚丙烯酸中的一种；蛋白保护剂可以是牛igg、酪蛋白水解物、甘氨酸或鱼明胶中的一种；防腐剂可以是硫柳汞、叠氮钠、ipbc或mit中的一种；阻断剂可以是mak33-poly、biolipidure、变性的
人igg或sacntibodies hbr中的一种；化学保护剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、聚赖氨酸或二硫苏糖醇中的一种或多种。
[0039]
3、配制不同ph的偶联缓冲液
[0040]
本实施例采用的偶联缓冲液包含缓冲剂和无机盐，缓冲剂是mes缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或碳酸盐缓冲剂中的一种。
[0041]
偶联缓冲液储存条件：2-8℃
[0042]
具体地，不同ph的偶联缓冲液的配制方法如表2所示：
[0043][0044][0045]
4、在不同ph偶联缓冲液中制备包被磁珠
[0046]
取四支试管，并在四支试管内分别加入5mg链霉亲和素磁珠，将四个试管均置于磁铁上，去除上清，分别向四个试管内加入1ml的偶联缓冲液 1-1、偶联缓冲液1-2、偶联缓冲液1-3和偶联缓冲液1-4，涡旋，置于磁铁上，去除上清，此步骤重复3次。
[0047]
按照偶联物比例为20ug/mg，将甲胎蛋白抗体和链霉亲和素磁珠进行偶联，分别向四个试管内加入400μl的偶联缓冲液和100μl的甲胎蛋白抗体 (1mg/ml)，共500μl，涡旋，然后在滚筒搅拌器上室温孵育2小时，2小时后取出上清液以用于偶联效率的测定，分别编号为s1-11、s1-12、s1-13 和s1-14。
[0048]
值得一提的是，偶联物的比例范围控制在10-40ug/mg内适宜。
[0049]
再用500ul的对应的偶联缓冲液分别清洗3次，并将偶联磁珠重悬于 500ul的固相试剂稀释液中，每组浓度均为10mg/ml。
[0050]
将上述浓度为10mg/ml的各偶联磁珠，用固相试剂稀释液分别调配成浓度为0.2mg/ml的工作液备用，分别编号为s1-21、s1-22、s1-23和s1-24。
[0051]
5、偶联效率的检测
[0052]
采用的微量分光光度计：thermo scientific，型号为：nanodrop one 是由thermo fisher scientific公司制造的。
[0053]
将上述分离得到的四个组分的上清液s1-11、s1-12、s1-13和s1-14放在离心机中，离心分离去除少量未被磁场吸附的磁珠，离心条件为 10000r/min，保持10min。使用微量分光光度计测量上述四个组分中上清液中蛋白的浓度，并计算出上清液中蛋白的含量，此为未结合的甲胎蛋白抗体的含量。进而计算出在不同ph偶联缓冲液中甲胎蛋白抗体与链霉亲和素磁珠的偶联效率。其中，蛋白偶联效率＝(蛋白总量-未结合的蛋白量)/蛋白总量。
[0054]
由附图1可知，在这四个组分中，编号为s1-13组分的包被蛋白偶联效率最高，大于90％，编号为s1-14组分的包被蛋白偶联效率最低。
[0055]
6、磁珠沉降速率测定
[0056]
将上述配制的工作液s1-21、s1-22、s1-23和s1-24，进行超声处理5min，并震荡混合均匀，30min后观察磁珠的沉降结果。
[0057]
由附图2可知，在这四个组分中，编号为s1-21、s1-22和s1-23的磁珠沉降速度差别不大，编号为s1-24的磁珠沉降速度最慢。
[0058]
7、光学显微镜的镜检观察测定仪器：nexcope倒置生物显微镜(型号： nib-410)
[0059]
将上述配制的s1-21、s1-22、s1-23和s1-24工作液分别取适量涂在玻璃载片上，在光学显微镜下进行镜检，通过成像法直接观察磁珠的平面投影图像。
[0060]
由附图3-6可知，在这四个组分中，编号为s1-21、s1-22和s1-23的投影图像差别不大，有少量磁珠聚集现象，也说明了当磁珠被较多抗体包被时，导致其亲水性降低，因此磁珠会稍有聚集，编号为s1-24的投影图像显示磁珠较为分散，正好也证明了编号为s1-24的组分磁珠的偶联效率低，沉降速度最慢。
[0061]
8、校准品反应性检测
[0062]
将上述配制的工作液s1-21、s1-22、s1-23和s1-24分别置于试剂盒内，组成四组试剂，在37℃的条件下，热加速保持7天，并在第7天取出，置于2-8℃冰箱保存12-16小时，分别标记为s1-31、s1-32、s1-33和s1-34。
[0063]
将上述配制的工作液s1-21、s1-22、s1-23、s1-24，以及热加速后的 s1-31、s1-32、s1-33和s1-34分别置于试剂盒内，组成八组试剂，利用化学发光磁微粒免疫分析法测试校准品s1-01、s1-02、s1-03、s1-04、s1-05、 s1-06，以此检测灵敏度和信噪比。
[0064]
由附图7可知，编号为s1-23的工作液信噪比和灵敏度最高，由附图8 可知，编号为s1-33的工作液信噪比和灵敏度最高。
[0065]
9、热稳反应性检测
[0066]
将上述配制的工作液s121、s1-22、s1-23、s1-24以及热加速后的s1-31、 s1-32、s1-33和s1-34分别置于试剂盒内，组成八组试剂，利用化学发光磁微粒免疫分析法测试，得到以下数据：
[0067]
其中，编号为s1-21，偶联稀释液ph＝6.0的磁珠热稳反应性实验结果如表3所示：
[0068]
校准品浓度s1-21/4℃对照s1-31/37℃加速7天变化幅度s1-010545522-4.22％s1-0250140300120198-14.33％s1-03200481376406625-15.53％s1-045001055136922365-12.58％s1-05100019168721706554-10.97％s1-06200033551802869694-14.47％
[0069]
编号为s1-22，偶联稀释液ph＝7.0的磁珠热稳反应性实验结果如表4 所示：
[0070][0071]
其中，编号为s1-23，偶联稀释液ph＝8.0的磁珠热稳反应性实验结果如表5所示：
[0072]
校准品浓度s1-23/4℃对照s1-33/37℃加速7天变化幅度s1-0105225102.30％s1-0250129688125198-3.46％s1-03200651893615641-5.56％s1-0450014613511380975-5.50％s1-05100025071702385962-4.83％s1-06200040624283830569-5.71％
[0073]
其中，编号为s1-24，偶联稀释液ph＝9.0的磁珠热稳反应性实验结果如表6所示：
[0074]
校准品浓度s1-24/4℃对照s1-34/37℃加速7天变化幅度s1-010564522-7.45％s1-0250151596127797-15.70％s1-03200678276578437.5-14.72％s1-0450014942611233547.5-17.45％s1-05100025693322193780-14.62％s1-06200042042033554541-15.45％
[0075]
由表3-6的给出的数据可知，编号为s1-22和s1-23的热稳的变化幅度均在10％以内，且s1-23更好。
[0076]
10、zeta电位及粒径测量分析
[0077]
测定仪器：anton paar激光粒度仪(litesizer
tm 500)
[0078]
将上述配制的工作液s1-21、s1-22、s1-23、s1-24，以及热加速后的 s1-31、s1-32、s1-33和s1-34的工作液，取适量置于激光粒度仪中，测量该磁珠的zeta电位及粒径，通过zeta电位大小能够确定溶液中的磁珠是稳定存在还是趋于聚集。
[0079]
其中，不同包被反应时间的磁珠的zeta电位及粒径测量数据如表7所示：
[0080][0081]
由表7提供的数据分析可知，编号为s1-23的zeta电位的最小，绝对值最大，也证明
了当偶联稀释液ph＝8.0时磁珠更稳定、且不易聚集。而当热加速后各组的zeta电位绝对值会更大些。
[0082]
通过上述测定可知，当偶联稀释液ph＝8.0时，在沉降速率以及镜检观察在同组别相差不大的情况下，抗体偶联效率最高，磁珠的zeta电位测试绝对值最大，且该组热稳定性的变化幅度最小，灵敏度以及信噪比最高，故偶联稀释液ph＝8.0时的工艺条件最优。由此可得，此条件下后续的clia 试剂信噪比较佳，且固相试剂长期稳定性较好，长期保存状态时磁珠不易聚集。
[0083]
值得一提的是，上述评价方法不仅能对链霉亲和素磁珠的包被工艺能做出客观准确的评价，对不同类型的磁珠也均适用，例如，羧基磁珠、链霉亲和素磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠或nhs磁珠等，尽管上述不同类型的磁珠包被工艺均有其特殊性，但是根据理化性质和实际测量结果能够快速地对磁珠包被工艺进行客观准确的评估，从而挑选较优的工艺，保证了续clia固相试剂整体性能及其长期稳定性，本发明提供了一种快速完整的磁珠包被工艺评价方案。
[0084]
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。