用于增强癌症治疗的聚合物纳米颗粒

用于增强癌症治疗的聚合物纳米颗粒
发明领域
1.提供了具有非肿瘤抗原有效载荷的聚合物纳米颗粒以及其用于治疗癌症的用途，所述聚合物纳米颗粒用于给细胞加标签以供由受试者的免疫系统破坏。


背景技术：

2.能够将药物递送到体内部位的功能性纳米颗粒是已知的。已经使用进一步的纳米颗粒以向身体提供肿瘤相关抗原，以提供癌症中涉及的t细胞的靶向刺激。
3.wo2019/023622讨论了包括有效载荷以提供对癌症中涉及的非响应性t细胞的靶向刺激的聚合物纳米颗粒。
4.在现有的肿瘤疫苗生产中，利用肿瘤的新抗原来提供能够靶向肿瘤的新抗原特异性t细胞——见图1。此外，基于树突状细胞的癌症疫苗通常是已知的，这需要患者经历白细胞去除术。此外，嵌合抗原受体(car)-t疗法是众所周知的，其中t细胞经受试者特异性的工程化改造以识别来自有问题的癌症的特定蛋白质。
5.然而，使用此类新抗原来刺激t细胞以生成疫苗，需要分析特定的肿瘤(需要对肿瘤进行活检)、需要考虑hla单倍型以及是否将呈递新抗原以使其具有足够的免疫原性。此外，t细胞受体对新抗原的亲合力通常低于对外来抗原的亲和力。


技术实现要素：

6.希望通过使肿瘤呈递外来(非肿瘤新抗原)抗原而不是新抗原来提供更有效的方法来以高特异性、对肿瘤的强烈响应进行靶向。
7.发明人已经确定了一种对肿瘤细胞“加标签”的方法，以允许其被免疫系统选择性地靶向。适当地，这种“加标签”是通过向癌细胞提供非新抗原的免疫原性蛋白质或肽。特别地，发明人已经确定使用在纳米颗粒中适当地通过与肿瘤连接的渗漏血管递送至癌细胞的非肿瘤蛋白质有效载荷，允许肿瘤细胞hla呈递至少一部分的蛋白质有效载荷和针对hla呈递的蛋白提供免疫应答。适当地，纳米颗粒可以是聚合物纳米颗粒。在实施方案中，非肿瘤有效载荷可以由非天然衍生的合成肽提供。在实施方案中，有效载荷可以由病毒蛋白提供。
8.根据本发明的第一方面，提供了治疗方法，其包括将包含非肿瘤蛋白有效载荷的纳米颗粒施用于患有癌症的受试者。
9.适当地，非肿瘤蛋白或肽有效载荷可以由合成的非肿瘤、非病毒蛋白质提供。
10.任选地，纳米颗粒可以具有约100nm与约300nm之间、优选约150nm与约250nm之间、最优选约200nm的尺寸，即直径。
11.这提供了纳米颗粒的定位也发生在脾脏中以接合树突状细胞的优点。
12.任选地，纳米颗粒可以具有负电荷。在替代方面，纳米颗粒可以具有正电荷，从而增强抗原呈递。适当地，非肿瘤蛋白有效载荷由纳米颗粒包封。
13.有利地，本发明允许表达选定的非肿瘤有效载荷蛋白质抗原，并且因此不需要活检或确定特异性肿瘤新抗原，并且不依赖待治疗的受试者。此外，本发明的组合物和方法允
许肿瘤和树突状细胞的双特异性靶向，而没有单倍型限制。
14.适当地，纳米颗粒可以是聚合物的，任选地，纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物组成。在一些实施方案中，可生物降解的聚合物是乳酸聚合物(pla)、乙醇酸聚合物(plg)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)中的一种或多种。适当地，可以提供聚合物的组合。
15.在一些实施方案中，非肿瘤有效载荷包含来自感染性疾病的至少一种蛋白质。这可能是有利的，因为受试者可能对感染性疾病具有现有的免疫应答。在一些实施方案中，非肿瘤、适当包封的有效载荷可以包含两种或更多种蛋白质。适当地，有效载荷可以是受试者可能对其具有天然免疫力的任何免疫原性蛋白质或肽。适当地，免疫原性蛋白质或肽可以来自冠状病毒，例如冠状病毒刺突蛋白。适当地，有效载荷可以是covid-19中的显性或亚显性sars-cov-2hlai类和hla-dr肽(例如，如2020年9月30日公布的nelde,a.,bilich,t.,heitmann,j.s.et al.sars-cov-2-derived peptides define heterologous and covid-19-induced t cell recognition.nat immunol 22,74
–
85(2021)所讨论的)。适当地，有效载荷可以是肽qyikwpwyi(seq id no:2)。适当地，蛋白质可以选自流感病毒，包括流感a、b和/或c、血凝素和神经氨酸酶。适当地，可以提供一种、两种、三种或更多种蛋白质。适当地，非肿瘤蛋白或肽有效载荷可以任选地选自：
16.(a)流感病毒外壳蛋白，例如衍生自包括a、b和c但不包括d的血清型，
17.(b)血凝素亚型或神经氨酸酶亚型和/或
18.(c)疱疹病毒科的外壳蛋白，任选地包含ghglgp42复合物和lmp2a的成分的爱泼斯坦巴尔病毒蛋白。
19.适当地，可以提供非肿瘤蛋白质或肽有效载荷的组合。在一些实施方案中，包含包封的蛋白质有效载荷的聚合物纳米颗粒可以增加树突状细胞上hla的表达。在一些实施方案中，由纳米颗粒引起的肿瘤树突状细胞和/或巨噬细胞的活化和成熟可以导致其有效地将抗原呈递给t淋巴细胞，从而引发适应性免疫应答。适当地，肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取是通过被动方式，例如，癌细胞比受试者中的典型细胞更新更多的纳米颗粒(虽然肝脏可能摄取这种纳米颗粒，但在这种情况下，认为肝脏将能够从任何响应中恢复)。适当地，纳米颗粒可以靶向癌细胞，例如使用抗体方法。适当地，聚合物纳米颗粒可以与肿瘤细胞结合成员一起被提供。适当地，肿瘤细胞结合成员引起聚合物纳米颗粒优先靶向肿瘤细胞。
20.在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒，诸如本发明的聚合物纳米颗粒，在与有效剂量的免疫调节剂，例如与免疫检查点蛋白结合并抑制其活性的抗体，纯化的肿瘤抗原，例如可溶性肿瘤相关蛋白或其片段、细胞因子、与t细胞检查点蛋白结合并抑制其活性的抗体，例如但不限于pd1；pd-l1；细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)；b和t淋巴细胞衰减因子(btla)；淋巴细胞活化基因3(lag3)；t细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3(tim-3)；t细胞活化的v域免疫球蛋白阻遏物；和具有ig和itim域的t细胞免疫受体(tigit)的联合疗法中施用。
21.适当地，非肿瘤相关有效载荷可以联合溶酶体扰动剂提供，任选地其中溶酶体扰动剂选自豆荚蛋白或组织蛋白酶抑制剂、明矾、奥美拉唑、甲氟喹、他非诺喹和leu-leu-ome中的至少一种。
22.适当地，可以提供非肿瘤蛋白质/肽有效载荷以允许将肽或蛋白质有效载荷的至少一部分mhc/hla呈递给t细胞。适当地，纳米颗粒可以起促进非肿瘤蛋白质/肽有效载荷的
递送和呈递的作用。适当地，纳米颗粒可以包含在纳米颗粒内或联合纳米颗粒的另外的药剂，以增强非肿瘤蛋白质/肽有效载荷的呈递。例如，此类药剂可以减少或抑制非肿瘤蛋白质/肽有效载荷的裂解，从而增强蛋白质/肽有效载荷的呈递。适当地，此类药剂可以是溶酶体破坏剂。适当地，可以提供l-亮氨酰-l-亮氨酸甲酯(llome)以增强非肿瘤蛋白质/肽有效载荷呈递。适当地，另外的药剂可以选自甲氟喹、gencitibine等。
23.在实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，该癌症是实体瘤。在实施方案中，实体瘤可以是癌、肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、中枢神经系统癌症中的一种，例如胶质瘤、髓母细胞瘤或星形细胞瘤。
24.在实施方案中，提供了治疗方法，其包括：向个体提供有效剂量的本文所述的聚合物纳米颗粒，其中有效剂量提供肿瘤特异性cd8

t细胞的活化，并通过增加肿瘤细胞的靶向杀伤来减少肿瘤细胞的生长。
25.在实施方案中，提供了药物配制剂，例如，用于治疗人受试者，其中配制剂包含如本文所述的纳米颗粒，作为单位剂量，例如作为具有稀释剂的以单位剂量的无菌预包装，用于静脉递送装置。药物组合物或试剂盒可以进一步包含第二活性剂，例如化疗剂。
26.除非上下文另有要求，本发明的每个方面的优选特征和实施方案是关于其他方面中的每一个加以必要的必要修改。
27.在本文中引用的每篇文件、参考文献、专利申请或专利均通过引用明确地整体并入本文，这意味着读者应将其作为本文的一部分阅读和考虑。文中引用的文献、参考文献、专利申请或专利在文中不再重复，仅仅是为了简洁。
28.对文本中所引用的材料或信息的提及不应被理解为对材料或信息是公知常识的一部分或在任何国家为人所知的让步。
29.在整篇说明书中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或变体诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包含(includes)”或“包括(including)”将被理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
30.现在将仅以示例的方式参考附图描述本发明的实施方案，其中：
31.图1例示了新抗原特异性t细胞的产生；
32.图2例示了本发明的方法；将抗原包封的纳米配制剂施用于患者。该配制剂靶向脾脏中的树突状细胞和肿瘤细胞，纳米颗粒在此经摄取。树突状细胞加工抗原并将抗原呈递给cd8 t细胞，cd8 t细胞变为活化的并寻出呈递相同抗原蛋白的细胞。同时，肿瘤细胞也加工并在表面上呈递相同的抗原，使得肿瘤细胞对抗原活化的cd8 t细胞可见。cd8 t细胞引发对肿瘤细胞的细胞毒性攻击，导致肿瘤细胞死亡。
33.图3例示了mhc:siinfekl抗体的验证：将mc38细胞用pbs或siinfekl肽处理并温育4小时。然后将细胞与siinfekl抗体或igg对照温育并通过流式细胞术测定抗原呈递，具体地将mc38细胞用pbs或1μmsiinfekl肽处理4小时。用siinfekl结合的mhc抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术确定siinfekl呈递。使用同种型特异性igg对照(siinfekl igg)以检测我们抗体的非特异性结合。b siinfekl结合的mhc抗体在siinfekl处理的细胞表面检测到高水平的siinfekl，导致强荧光信号(几何平均)。在未用siinfekl处理的细胞中未观察到该信号，这证实了该抗体是有功能的。在用同种型特异性抗体染色的细胞中未观察到信
号，表明siinfekl结合的mhc抗体是特异性的并且不与随机人工制品结合。
34.图4：例示了纳米颗粒包封的siinfekl在上皮肿瘤细胞系mc38上呈递的结果：mc38细胞用250μg/ml空白纳米颗粒(b-np)、250μg/ml包封siinfekl肽的纳米颗粒(siinfekl-np)处理或1μm游离siinfekl(阳性对照)处理6小时。用siinfekl结合的mhc抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术确定siinfekl呈递。同种型特异性igg对照(siinfekl igg)用于检测我们抗体的非特异性结合；
35.图5：例示了纳米颗粒包封的siinfekl在jaws ii树突状细胞系中的mhc i上呈递的结果：将jaws ii细胞以1x105接种在6孔板中并放置过夜。第二天，用500μg的plga-siinfekl np(siinfekl np)、plga np(b-np)或游离siinfekl(阳性对照)处理细胞。将细胞在37℃、5％co2中温育6小时。温育后，使用对与mhc i结合的siinfekl具有特异性的抗体来检测抗原的细胞表面表达。使用流式细胞术进行评估。使用同种型特异性igg对照(siinfekl igg)以检测抗体的非特异性结合。因此，b-np和siinfekl igg处理的细胞对抗体染色呈阴性，而阳性对照在几乎100％的细胞中显示出明显的阳性。重要的是，siinfekl-np处理的细胞也显示出阳性，强烈表明这些细胞正在表达与mhc 1类结合的siinfekl。示图是来自3个独立实验的代表性图；
36.图6：例示了纳米颗粒包封的siinfekl的呈递依赖于内吞作用的结果：(a)jaws ii细胞和(b)mc38细胞用250μg/ml用空白纳米颗粒(b-np)、250μg/ml包封siinfekl肽的纳米颗粒(siinfekl-np)或1μm游离siinfekl(阳性对照)在4℃或37℃下处理1小时。清洗细胞以去除未内吞的纳米颗粒或游离肽，并在37℃下温育。用siinfekl结合的mhc抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术确定siinfekl呈递。使用同种型特异性igg对照(siinfekl igg)以检测我们抗体的非特异性结合。在4℃下温育降低了内吞作用的速率，因此纳米颗粒递送和siinfekl呈递减少。
37.图7：例示了当使用plga纳米颗粒外源性递送时，可以交叉呈递全长卵清蛋白的结果。细胞用250μg/ml的空白纳米颗粒(b-np)、游离siinfekl模型抗原(游离siinfekl)或包封在plga np中的卵清蛋白处理24小时。使用igg对照来说明非特异性染色，并使用阳性对照来确认阳性。将细胞与siinfekl-mhc i特异性抗体温育，并使用流式细胞术评估结果。igg用作阴性对照；
38.图8：例示了吉西他滨增强siinfekl呈递的结果：mc38细胞用30nm吉西他滨预处理24小时。然后，用1μm siinfekl肽处理细胞6小时。6小时后，用pe-siinfekl结合的mhc抗体对细胞进行染色以确定siinfekl呈递的水平。在用吉西他滨预处理后，siinfekl的呈现增强，突出了通过将纳米配制剂与吉西他滨组合来加强肿瘤细胞的cd8 t细胞识别的潜力；
39.图9：例示了吉西他滨增强包封在纳米颗粒内的卵清蛋白衍生的siinfekl的呈递的结果：mc38细胞用7.5、15和30nm的吉西他滨预处理24小时。然后，用ova-np处理细胞6小时。6小时后，用pe-siinfekl结合的mhc抗体和同种型对照抗体对细胞进行染色，以确定ova衍生的siinfekl呈递的水平。在用吉西他滨预处理后，看到np包封的ova衍生的siinfekl增强；
40.图10：例示了表观遗传修饰剂(ema)增强包封在纳米颗粒内的卵清蛋白衍生的siinfekl的呈递的结果：mc38细胞用恩替司他和地西他滨预处理。24小时后，用ova-np(250μg/ml)处理细胞6小时。用siinfekl结合的mhc抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术确
定siinfekl的表面呈递。联合的两种药剂增强了siinfekl的呈递；
41.图11：例示了溶酶体破坏剂l-亮氨酰-l-亮氨酸甲酯(llome)增强包封在纳米颗粒内的卵清蛋白衍生的siinfekl的呈递的结果：mc38细胞用llome预处理24小时。然后，用ova-np处理细胞6小时。6小时后，用pe-siinfekl结合的mhc抗体和同种型对照抗体对细胞进行染色，以确定ova衍生的siinfekl呈递的水平。在用llome预处理后，看到np包封的ova衍生的siinfekl增强；
42.图12：例示了抗疟疾甲氟喹增强包封在纳米颗粒内的卵清蛋白衍生的siinfekl的呈递的结果：mc38细胞用甲氟喹预处理24小时。然后，用ova-np处理细胞6小时。6小时后，用pe-siinfekl结合的mhc抗体和同种型对照抗体对细胞进行染色，以确定ova衍生的siinfekl呈递的水平。在用甲氟喹预处理后，看到np包封的ova衍生的siinfekl增强。
43.发明详述
44.如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数含义，除非上下文另有明确规定。除非另有明确说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
45.本文所述的纳米颗粒包含有效载荷，例如包封的有效载荷，其中术语有效载荷是指包含在纳米颗粒内的一种、两种、三种或更多种非肿瘤蛋白。在一些实施方案中，包封的有效载荷包含至少一种非肿瘤蛋白。在一些实施方案中，包封的有效载荷包含两种非肿瘤蛋白。在一些实施方案中，包封的有效载荷包含三种非肿瘤蛋白。
46.术语“多肽”、“肽”、“寡肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包括编码和非编码氨基酸，化学或生化修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰肽主链的多肽。
47.如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”当在多肽的上下文中使用时是指基本上不含来自获得该多肽的材料的污染材料，例如细胞材料，诸如但不限于细胞碎片、细胞壁材料、膜、细胞器、细胞中存在的大量核酸、碳水化合物、蛋白质和/或脂质。因此，分离的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％、2％或1％(以干重计)的细胞材料和/或污染材料的多肽制备物。如本文所用，术语“纯化的”和“分离的”当在化学合成的多肽的上下文中使用时是指基本上不含参与该多肽合成的化学前体或其他化学物质的多肽。
48.可以根据重组合成或无细胞蛋白质合成的常规方法分离和纯化多肽。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码序列和适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组dna技术、合成技术和体内重组/基因重组。替代地，可以化学合成能够编码感兴趣的多肽的rna。本领域技术人员可以容易地利用众所周知的密码子使用表和合成方法为本发明的多肽中的任一种提供合适的编码序列。
49.就本发明而言，“患者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔等。因此，该方法适用于人治疗和兽医应用。在一个实施方案中，患者是哺乳动物，优选灵长类动物。在其他实施方案中，患者是人。
50.术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指正在评估治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
51.在某些实施方案中，“联合”、“联合疗法”和“联合产品”是指同时向患者施用本文所述的药剂。当联合施用时，每种组分可以同时施用或在不同时间点以任何顺序贯序施用。因此，每种组分可以分开施用，但在时间上足够紧密，以提供期望的治疗作用。
52.在本发明的方法中，活性剂的“伴随施用”是指与药剂一起施用，此时药剂将同时具有治疗作用。这种伴随施用可以涉及药剂的同时(即在同一时间)、之前或随后施用。本领域普通技术人员将不难确定本发明的特定药物和组合物的适当施用时间、顺序和剂量。
[0053]“剂量单位”是指适合作为待治疗特定个体的单位剂量的物理离散单位。每个单位可以含有与期望的药物载体一起的预定量的一种或多种活性化合物，其经计算以产生期望的一种或多种治疗作用。剂量单位形式的规格可以由(a)一种或多种活性化合物的独特特性和待实现的一种或多种特定治疗作用，和(b)复合此类一种或多种活性化合物的技术中固有的限制来决定。
[0054]“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全的、无毒的和期望的，并且包括兽用和人药用可接受的赋形剂。
[0055]“治疗有效量”是指当施用于受试者用于治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。
[0056]
纳米颗粒的生产
[0057]
适当地，为了形成纳米颗粒，聚合物可以溶解到用表面活性剂或稳定剂(水)乳化的有机相(油)中。疏水性药物可以直接添加到油相中，而亲水性药物(水)可以在形成颗粒之前先用聚合物溶液乳化。可以使用高强度声处理来促进小聚合物液滴的形成。将所得乳液添加到更大的水相中并搅动数小时，使溶剂蒸发。可以通过离心收集和清洗硬化的纳米颗粒。
[0058]
聚合物的浓度通常为至少约0.01mg/ml，更通常为至少约0.1mg/ml，至少约1mg/ml，并且不超过约100mg/ml，通常不超过约50mg/ml。以重量百分比计的活性剂与聚合物的比率将有所不同，在约1:1000；1:500；1:100，1:50；1:10；1:5等左右。
[0059]
纳米颗粒可以具有受控的尺寸，以适用于优化生物活性剂的递送。通常颗粒将具有从约50nm、从约100nm、至多约250nm、至多约500nm、至多约1μm、至多约2.5μm、至多约5μm的直径且直径不超过约10μm。在一些实施方案中，纳米颗粒尺寸的直径为约100nm至约500nm，例如约100nm至约300nm、约300nm至约2μm等。纳米颗粒任选地具有限定的尺寸范围，其可以是基本上同质的，其中可变性可以不超过直径的100％、50％或10％。颗粒的尺寸可以通过变化参数来改变，包括有效载荷、聚合物的疏水性、有机溶剂的类型、有机溶剂体积、溶剂与聚合物的比率、乳化剂、声处理强度、离心速度和时间等。
[0060]
纳米颗粒可以包含任何生物相容性聚合物的包被。可用作包被的可生物降解聚合物可以包括羟基脂肪族羧酸，均聚物或共聚物，诸如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯)、聚(乙二醇)；多糖，例如凝集素、糖胺聚糖，例如壳聚糖；纤维素、丙烯酸酯聚合物等。包被可以影响施用后纳米颗粒的降解速率、纳米颗粒的纳米颗粒靶向性等。
[0061]
适当地，纳米颗粒可以包括约4mg的包封的卵清蛋白。
[0062]
使用方法
[0063]
对于癌症的治疗，纳米颗粒可以作为单一药剂施用；可以根据需要重复施用，例如给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等次，其中给药之间的间隔可以是例如1天、2天、3天、4
天、5天、6天、1周、2周、1个月等，以及其之间的范围，直到获得期望效果的时间为止。一个或多个初始剂量可以是引发剂量，例如比治疗剂量低的剂量，或者可以是比治疗剂量高的剂量。
[0064]
如本文所用，“癌症”包括任何形式的癌症，包括但不限于实体瘤癌症(例如，肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、平滑肌肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、神经内分泌癌等)和液体癌症(例如血液癌症)；癌(carcinoma)；软组织肿瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；和脑癌，包括微小残留病，包括原发性和转移性肿瘤两者。
[0065]
癌(carcinoma)的组织学类型包括腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌、小细胞癌和间变性癌(anaplastic carcinoma)。癌可以在皮肤、肺、胰腺、口腔、咽喉、食管、胃、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、肛门、卵巢、脑和肝等中发现。癌的实例包括但不限于：腺癌(始于腺(分泌)细胞的癌症)，例如乳腺、胰腺、肺、前列腺和结肠的癌症可以是腺癌；肾上腺皮质癌；肝细胞癌；肾细胞癌；卵巢癌；原位癌；导管癌；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；移行细胞癌；结肠癌；鼻咽癌；多房性囊性肾细胞癌；燕麦细胞癌；大细胞肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌等等。
实施例
[0066]
卵清蛋白(ova)已用于许多科学项目，以证明疫苗媒介物(或其佐剂)可以在疫苗接受者中产生特异性免疫应答。由于其作为科学模型的普及，c57/bl6小鼠中免疫和上皮细胞对ova的加工已被广泛表征。细胞中存在的所有蛋白质中的约1/3被降解并呈递在与主要组织相容性复合物(mhc)蛋白(在人中称为hla或人白细胞抗原)结合的细胞表面上。mhc蛋白分为两类，称为i类和ii类。处理后，ova的片段将与mhc i类或mhc ii类结合。ova结合的类别决定了免疫应答。例如，ova在mhc i类上的呈递(进行此的ova肽片段的氨基酸序列是siinfekl)将由称为cd8 t细胞的t细胞子集识别。这些细胞毒性cd8 t细胞具有重要意义，因为它们可以被训练以特异性识别展示特定抗原的肿瘤细胞。虽然已经使用ova证明了该应用，但应理解这是其他免疫原性肽的模型。
[0067]
树突状细胞是专职的抗原呈递细胞，一旦由抗原内化活化，就迁移到淋巴结，将外来抗原呈递给t细胞。识别抗原的任何cd8 t细胞(例如ova)均将在淋巴结内增殖并从淋巴结迁移并散播到全身。然后，在mhc i类上展示siinfekl抗原的任何细胞均将由循环的cd8 细胞毒性t细胞杀伤。
[0068]
本发明的纳米颗粒保护抗原在其到达靶肿瘤和树突状细胞之前不被降解。必须选择和提供抗原(在模型系统siinfekl中)，使得树突状细胞在mhc i的背景下呈递抗原，从而提供cd8 细胞毒性细胞。此外，肿瘤上皮细胞必须在mhc i的背景下展示期望的抗原(siinfekl)，因此它们由细胞毒性t细胞靶向。
[0069]
树突状细胞(dc)和上皮细胞处理抗原的方式存在显著差异。然而，发明人已经意识到通过纳米颗粒系统递送抗原允许递送来自外源性来源的抗原(即肽不是在细胞中最初产生)并且能够发生交叉呈递。虽然在树突状细胞中交叉呈递很常见，但在上皮细胞中并不常见。
[0070]
进行了以下体外工作作为本发明的原理证明。
[0071]
树突状细胞(jaws ii)
[0072]
形成siinfekl和卵清蛋白包封的纳米颗粒，并进行抗原呈递评估(流式细胞术)以及细胞表面共聚焦显微术分析以确认mhc:siinfekl的表面呈递。
[0073]
将ot1 cd8 t细胞与脉冲的树突状细胞共同温育以证明抗原的生物活性。
[0074]
认为体外工作证明了非肿瘤蛋白有效载荷的mhc呈递，导致抗原特异性t细胞群的产生，ifn-γelisa显示活性。
[0075]
使用常规注射间隔将使肿瘤消退(这首先是直接注射，然后是静脉注射)。
[0076]
实施例1-用于颗粒配制剂的材料和方法
[0077]
本实施例中使用了模型肽siinfekl。将siinfekl肽(seq id no:1)(anaspec，fremont，usa)重悬浮于pbs中至1mm的最终储备浓度并在4℃下储存
[0078]
纳米颗粒配制
[0079]
将20mg的rg 502h，聚(d，l-丙交酯-共-乙交酯)(plga)酸封端(丙交酯：乙交酯50:50；mw 7,000-17000)聚合物(sigma，uk)溶解在1ml冰冷的二氯甲烷(dcm)中。随后，将200μl的1mm siinfekl(anaspec，fremont，usa)直接添加到dcm中。
[0080]
使用25号针头，将dcm/聚合物/siinfekl混合物直接注射到50mm 2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)水合物缓冲液((mes缓冲液：9.5g
–
mes水合物，1l蒸馏水，调节至ph 5并高压灭菌)中的7ml的2.5％(w/v)聚乙烯醇(sigma uk)(ph5)。在400rpm的恒定搅动下，2.5％(w/v)pva在50mm mes水合物缓冲液中：12.5g pva，500ml mes，(加热至60
°
c并搅动6小时直至pva溶解，然后将ph调节至5并高压灭菌))。通过在冰上声处理(model 120 sonic dismembrator，fisher scientific，uk)90秒(振幅为50％)诱导乳液形成，并在400rpm下搅动过夜以使溶剂蒸发。第二天，进行了三个连续的清洗步骤。在每个步骤中，颗粒在4℃下以16,000g旋转20分钟。在每个步骤后，将纳米颗粒沉淀物悬浮在pbs中并进行声处理(振幅为30％)，以确保沉淀物完全重悬。在最后的清洗步骤之后，将颗粒以5mg/ml的终浓度重悬浮在pbs中以备使用。
[0081]
实施例2-siinfekl肽的呈递依赖于颗粒摄取：将mc38细胞以5x104接种在6孔板中并放置过夜以在2ml适当的生长培养基中粘附。在此之后，用250μg/ml酸封端的聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)纳米颗粒(np)或包封siinfekl肽的plga np处理细胞(对于在4摄氏度处理的细胞，处理前细胞在4℃下维持45分钟)。处理后，用无菌pbs清洗细胞3次(4℃处理组在冰上清洗)，然后将细胞在37℃下温育6小时。通过流式细胞术测定siinfekl的表面表达。
[0082]
实施例3
[0083]
将mc38细胞以5x104接种在6孔板中并放置过夜以在2ml适当的生长培养基中粘附。在此之后，用250μg/ml酸封端的聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)纳米颗粒(np)或包封卵清蛋白的plga np处理细胞。游离的、预处理的siinfekl用作阳性对照。细胞在37℃下温育24小时。此后，收集细胞并用对与siinfekl肽结合的mhc-i具有特异性的pe缀合抗体(biolegend，usa)温育。接下来，通过流式细胞术评估siinfekl肽的呈递。
[0084]
实施例4-细胞表面mhc-i上呈递的siinfekl的共聚焦显微术
[0085]
为了对细胞表面mhc-i上呈递的siinfekl进行共聚焦显微术，可以将mc38细胞以5x104接种在6孔板中并放置过夜。第二天，可以用500μg的plga纳米颗粒(np)或包封卵清蛋白的plganp处理它们。温育24小时后，可以将细胞在4％多聚甲醛中固定10分钟。用pbs清洗
3次后，可以用0.2％pbs吐温(tween)使细胞透化10分钟，然后再清洗3次。为了防止非特异性抗体结合，可以将细胞用0.1％pbs吐温中的1％bsa溶液温育30分钟。然后可以将mhc-siinfekl特异性抗体以1:1000的终浓度添加到细胞中，并在室温下温育1小时。用0.1％pbs吐温清洗3次后，细胞可以安装到含有prolong
tm diamond antifade mountant(thermo fisher，uk)的dapi上，并在共聚焦显微镜上处理图像。
[0086]
实施例5-siinfekl生物活性测定法
[0087]
为了进行siinfekl生物活性测定法，可以使用脾脏分离试剂盒(miltenyi，germany)从ot-1小鼠中分离ot-i细胞，可以根据制造商的说明形成单细胞悬液，并使用dynabeads
tm flowcomp
tm
小鼠cd8试剂盒(thermo fisher，uk)富集cd8

细胞。可以培养和维持所得的cd8 t细胞。然后可以接种并处理mc38细胞。处理后，ot-1cd8 t细胞可以与mc38细胞共温育24小时。可以使用ifnγ分泌来测量t细胞活性。
[0088]
实施例6-hla免疫沉淀(hla-ip)：人上皮肿瘤细胞中血凝素交叉呈递的评估
[0089]
为了评估人上皮肿瘤细胞中的血凝素交叉呈递，可以将hct116和a549细胞以5x106接种在p140中并放置过夜以粘附。次日，可以将plga np或包封重组血凝素的plganp添加到细胞，并在37℃下温育24小时。在此之后，可以将75μl的hla/b/c缀合的添加到样品中并轻轻混合以确保总样品覆盖。温育后，可以吸出培养基并在pbs中清洗细胞。然后可以去除pbs并将补充有蛋白酶抑制剂的discip缓冲液直接添加到细胞上。细胞可以在4℃下裂解30分钟，同时温和摇动。所有规程均在冰上或4℃下进行。可以将细胞刮下并收集在2ml管中，然后放置在dynamag
tm-2磁性架中。流出物(即未与珠结合的任何物质)可以转移到新的2ml管中并在冰上保持。然后将结合的珠在750μlhla洗脱缓冲液中清洗5次，并且在最后一次清洗后离心并去除hla洗脱缓冲液。可以添加100μl的2x上样缓冲液，并随后在95℃下加热5分钟，以制备用于质谱分析的样品。
[0090]
实施例7-评估呈递在人上皮肿瘤细胞上的hla-i类表位
[0091]
为了减少各种细胞蛋白对样品的污染，可以通过在6％sds-page上运行样品来分离hla-ip样品。可以切下在0到10kda之间的凝胶，以确保分离所有mhc i和ii表位(分别在8到14个氨基酸之间)。在此之后，蛋白质在56℃下还原(10mm dtt)1小时，并在25℃下烷基化(55mm碘乙酰胺)30分钟，随后用水和h2o/50％乙腈(acn)交替清洗。胰蛋白酶消化后。可以使用50％acn/0.1％tfa随后用100％can提取肽。然后可以使用液相色谱-质谱法(lc/ms)分析这些肽。
[0092]
实施例8-破坏溶酶体的plganp的制备
[0093]
如前所述制备plga纳米颗粒。通过将药物添加到组合物的有机相中，将几种溶酶体抑制剂/破坏剂包封或包被在plganp中/上。使用的溶酶体破坏剂包括(但不限于)——e64、氯喹、leu-leu-ome、组织蛋白酶抑制剂、明矾、奥美拉唑、甲氟喹、他非诺喹。如前所述包封疏水性药物，然而，对于亲水性药物，使用了水包油包水(w/o/w)。将药物溶解在水基溶剂(诸如pbs)中并注射到1ml冰冷的二氯甲烷中。随后是30秒的声处理(30％振幅)。然后如前所述将其注射到水相中并进行声处理以完成颗粒配制。
[0094]
也可以用药物预处理细胞，然后添加纳米颗粒。
[0095]
实施例9-溶酶体破坏测定法
[0096]
将细胞以5x104接种在6孔板中并放置过夜。然后用plga-溶酶体破坏剂配制剂处
理细胞24小时。在此之后，去除培养基并用pbs清洗细胞并使用1ml胰蛋白酶从孔中脱附。将细胞收集在falcon管中并以2400rpm离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬浮于含有1μg/ml吖啶橙的pbs中。在室温下温育15分钟后，通过流式细胞术测量染色强度。然后测试成功的颗粒。
[0097]
在bd accuri
tm c6 plus流式细胞仪(bd biosciences，san diego，ca，usa)上进行流式细胞术，并在bd csampler
tm plus软件(版本1.0.23.1)上完成分析。
[0098]
抗体缀合：根据制造商的说明，将hlaa/b/c特异性抗体(biolegend，uk)与(thermofisher，uk)缀合。由于质谱的要求，使用pbs代替所提供的试剂盒中的sb缓冲液。
[0099]
mc38和a549细胞在补充有10％fcs(thermo fisher，uk)和1％pen/strep(thermo fisher，uk)的dmem(sigma，uk)中培养。hct116细胞在补充有10％fcs和1％丙酮酸钠的mccoys 5a(改良)培养基(thermo fisher，paisley，uk)中培养。
[0100]
尽管本发明已经参照特定实施例特别显示和描述，但是本领域技术人员将理解，可以对其中的形式和细节进行各种改变而不脱离本发明的范围。