一种富硒豆类中硒多糖的快速检测方法与流程

技术特征：
1.一种富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将待检测的富硒豆类粉末用无水乙醇和去离子水提取，之后将所得的上清液浓缩后进行固相萃取和洗脱，得到洗脱液，将洗脱液和三氟乙酸水溶液在无氧环境下于90～100℃进行热处理，得到反应液，调节反应液的ph至7～8，最后涡旋、离心，所得上清液用甲醇稀释后过滤，得到提取液；步骤2，将提取液利用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱，在全扫描的数据依赖扫描模式下，对未知硒多糖进行非定向筛查，得到每一种未知硒多糖分子的碎裂途径、同位素峰对应的质荷比和色谱峰峰面积；将待检测的富硒豆类中含硫元素的多糖中的硫元素用硒元素替换，用得到的硒多糖分子式列表和结构式列表获取每一种硒多糖分子的理论碎裂途径和同位素峰对应的理论质荷比；步骤3，通过比对每一种未知硒多糖分子的碎裂途径和理论碎裂途径，以及同位素峰对应的质荷比和同位素峰对应的理论质荷比，确定每一种未知硒多糖分子的分子式，最后利用每一种硒多糖分子的任意一个特征碎裂片段对应的标准溶液、同位素内标溶液和色谱峰峰面积，采用内标法，得到待检测的富硒豆类中每一种硒多糖分子的含量。2.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤1中，先将待检测的富硒豆类粉碎后过80～100目筛，再对得到的待检测的富硒豆类粉末进行提取。3.根据权利要求2所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤1将待检测的富硒豆类粉末用无水乙醇浸泡12～16h后过滤，待检测的富硒豆类粉末和无水乙醇的比例为(0.5～1.0)g：(20～25)ml，之后按照1g：(20～25)ml的渣液比，向所得的滤渣中加入70～80℃的去离子水，涡旋混匀，用70～80℃的去离子水超声提取3～5次，每次30～60min，最后在4～10℃下5000～10000r/min离心15～20min，重复3～5次，合并得到待浓缩的上清液。4.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤1先将固相萃取柱用甲醇活化，将活化后的固相萃取柱对浓缩后的上清液进行固相萃取，之后蒸馏水洗脱，蒸馏水与浓缩后的上清液的体积比为(2～3)：5，得到洗脱液。5.根据权利要求4所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤1中所述三氟乙酸水溶液的浓度为4mol/l，洗脱液和三氟乙酸水溶液的体积比为1：(2～5)，洗脱液和三氟乙酸水溶液于90～100℃热处理3～6h，之后冷却至室温得到反应液。6.根据权利要求5所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤1用4mol/l的naoh溶液调节反应液的ph，之后的离心在4000～8000r/min下进行10～15min，所得上清液用甲醇稀释5～10倍后过滤，得到提取液。7.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤2对未知硒多糖进行非定向筛查，先得到每一种未知硒多糖分子的一级质谱图和二级质谱图，再从二级质谱图中得到碎裂途径，从一级质谱图中得到同位素峰对应的质荷比。8.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤2中超高效液相色谱使用的是hypersil gold反相c18色谱柱，检测条件如下：流动相a为甲酸铵、甲酸和蒸馏水的混合体系，其中甲酸铵的浓度为4mmol/l，甲酸的体积浓度为0.1％，流动相b为甲酸铵、甲酸和甲醇的混合体系，其中甲酸铵的浓度为4mmol/l，
甲酸的体积浓度0.1％；流动相梯度洗脱程序为0～3min内，流动相a的体积比例为97％，3～9min内，流动相a的体积比例由97％线性减小至3％，9～11min内，流动相a的体积比例为3％，11～14min内，流动相a的体积比例由3％线性增加至97％，14～15min内，流动相a的体积比例为97％；柱温箱为25～35℃，流速为0.1～0.3ml/min。9.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤2中四极杆静电场轨道离子阱质谱的条件如下：扫描方式为电喷雾离子源下正离子模式；扫描范围m/z为50～1000；毛细管电压为3.5～5kv；鞘气压力为200～300kpa；辅助气加热温度为300～400℃；毛细管温度为300～350℃；全扫描分辨率为70000～80000fhwm；二级扫描分辨率为17000～18000fhwm；归一化碰撞能量为15.0～50.0ev；容许质量误差范围为5～10ppm。10.根据权利要求1所述的富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，其特征在于，步骤3先用超纯水分别配制均1000mg/l的每一种硒多糖分子任意一个特征碎裂片段的同位素内标溶液和标准溶液，之后用超纯水稀释所述的两种溶液，加入到1.0ml步骤1所述的提取液中，使得到的每一种硒多糖分子的特征碎裂片段标准品的浓度均为1500μg/l，同时同位素内标浓度均为500μg/l，然后按照步骤2进行非定向筛查，得到目标硒多糖对应的色谱峰峰面积和目标硒多糖对应的同位素内标下的色谱峰峰面积，按下式计算每一种硒多糖分子的含量：其中c为提取液中每一种硒多糖分子的浓度，单位为μg/l，s
s
为提取液中每一种硒多糖分子的色谱峰峰面积，s
i
为每一种硒多糖分子对应的同位素内标的色谱峰峰面积。

技术总结
本发明一种富硒豆类中硒多糖的快速检测方法，将富硒豆类粉末提取后上清液浓缩，再固相萃取和洗脱，将洗脱液和三氟乙酸溶液热处理，调节反应液pH后涡旋、离心，上清液稀释过滤得提取液；用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱，对硒多糖非定向筛查，得到碎裂途径、同位素峰对应的质荷比和色谱峰峰面积；将富硒豆类中含硫元素多糖中的硫用硒替换，用得到的分子式列表和结构式列表获取理论碎裂途径和同位素峰对应的理论质荷比；比对硒碎裂途径和理论碎裂途径，以及同位素峰对应的质荷比和同位素峰对应的理论质荷比，确定分子式，利用特征碎裂片段对应的标准溶液、同位素内标溶液和色谱峰峰面积，得到富硒豆类中硒多糖分子的含量。子的含量。子的含量。


技术研发人员：贾玮 樊子便 夏曾润 周媛媛 石琳 祁蒙
受保护的技术使用者：安康市富硒产品研发中心
技术研发日：2022.06.17
技术公布日：2022/9/13