用于产生针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性DNA的免疫学组合物的方法，杂合蛋白，表达载体，免疫学组合物，及其用途与流程

技术特征：
tris，乙酸盐20mm，edta 1mm)中在0.8％(m/v)琼脂糖凝胶上进行电泳测定法，并且经历在blue green上样染料存在下的80v电泳走样。15.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(b)中，为了扩增所述载体，使用大肠杆菌细菌菌株dh5a和top10，其中将所述细菌菌株在37℃下在以250rpm的摇动下在3ml的luria-bertani(lb)培养基(2％胰蛋白胨，1％酵母提取物，1％nacl)中培养大约18小时，然后将该培养物的等分试样在包含加有1.5％琼脂的lb培养基的培养皿中进行划线，在37℃下温育大约18小时，其中选择一个菌落以接种3ml的lb培养基并且将其在与上面所描述的相同的条件下进行培养，在该时间段后，使用1ml的该培养物来接种100ml的lb培养基并且在37℃下在摇动下进行培养直至在600nm下所述培养物的光密度(od600)达到0.4，其中所培养的细菌处于指数生长期的中间。16.根据权利要求15的方法，其特征在于，进行感受态的诱导，其中在达到所希望的细胞密度后，将细菌培养物转移至锥形管并且以5000xg离心10分钟并且在0.1m cacl2溶液中在冰上温育1小时，然后将细菌再次进行离心并且重悬浮在加有10％甘油(w/v)的0.1m cacl2溶液中，其中将200μl的等分试样冷冻于-80℃直至使用。17.根据权利要求1的方法，其特征在于，从感受态细菌开始进行细菌转化的步骤(c)，其中将10μl的大约15g的质粒dna和化学感受态细菌的等分试样的混合物在冰上温育30分钟，经历在42℃下的热休克2分钟，并且再次在冰上温育5分钟，然后添加350μl的s.o.c培养基(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mm nacl，2.5mm kcl，10mm mgcl2，10mm mgso4，20mm葡萄糖)，将混合物在37℃下在250rpm的摇动下温育90分钟，然后将经转化的细菌接种在包含或不包含100μg/ml氨苄青霉素的lb-琼脂培养基平板中并且在37℃下温育18小时。18.根据权利要求17的方法，其特征在于，在包含氨苄青霉素的lb-琼脂培养基平板上生长出的菌落鉴定了通过菌落pcr而选择出的阳性克隆，并且将其接种在包含3ml的lb培养基的管中，在37℃下在摇动下温育大约18小时。19.根据权利要求1的方法，其特征在于，为了在转化后在步骤(d)中选择细菌菌落，使用菌落pcr技术，其中设计2种从l2e6基因序列开始合成的特异性引物，eak03和eak02，并且它们能够生成144bp的产物。20.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述引物是由seq id no:6和seq id no:7所示的。21.根据权利要求19和20的方法，其特征在于，将所述引物以100μm的贮备浓度重悬浮在te缓冲液(10mm tris/hcl，1mm edta)中，其中对于pcr，在微量管中分开地制备每种溶液，所述微量管包含25μl的pcr-mix溶液(1.5mm mgcl2，0.5u taq，5m dntps 200-lgc biotecnologia,cotia,sp,brazil)、0.5μl的25μm的每种引物和超纯水，以达到50μl的最终溶液体积。22.根据权利要求19至21的方法，其特征在于，作为模板dna，使用每个经转化的细菌菌落的样品，在具有氨苄青霉素的lb培养基中进行选择和生长，其中在热循环仪中按照下述实验方案进行扩增：95℃5分钟，在95℃下1分钟、在56℃下30秒和在72℃下1分钟的25个循环，随后为在72℃下7分钟的最终延伸。23.根据权利要求19至22的方法，其特征在于，pcr产物的检测通过在0.5x tae缓冲液中在0.8％琼脂糖凝胶中的电泳来进行，通过添加0.5μl的blue green上样染料i来制备样
品并且使其经历在80a下的走样30分钟。24.根据权利要求1的方法，其特征在于，在提取质粒dna的步骤(e)中，将通过菌落pcr而选择出的阳性克隆在5ml的lb培养基中在选择抗生素存在下在37℃下在摇动下培养大约18小时，然后在环境温度下以12000xg离心1分钟以沉降出完整细菌。25.根据权利要求25的方法，其特征在于，为了纯化质粒dna，使用genejet plasmid miniprep试剂盒(thermo fisher scientific)，其中将经纯化的dna在0.5x tae缓冲液中在0.8％琼脂糖凝胶中进行分析并且经历测序技术以确证目的基因插入到载体中，在分光光度计中进行定量，并且贮存于-20℃。26.根据权利要求1的方法，其特征在于，在dna测序的步骤(f)中，对质粒dna样品进行测序以确证l2e6基因的正确插入及其完整性，其中通过分光光度法来定量从凝胶中纯化出的dna样品，并且等分出5μl质粒的体积并且添加2.5μl的浓度为5μm的eak03引物。27.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(g)中，使用转染试剂transfection reagents通过脂质转染法来进行hek 293t细胞的瞬时转染，其中将所述转染试剂通过涡旋振荡与dmem培养基的等分试样相混合，在环境温度下温育5分钟；以合适的比例向混合物添加目的质粒dna，轻轻地均质化，并且在环境温度下温育15分钟，然后将培养基/转染试剂/dna这一混合物添加至细胞与完全培养基，并且在恒温箱中在37℃和5％co2下进行温育，其中在8小时后更换培养基，现在用包含抗生素和10％fbs的完全培养基，其中当收集细胞并且以免疫荧光和在sds-page电泳凝胶中进行分析时，温育持续了大约48小时。28.根据权利要求27的方法，其特征在于，在步骤(g)中，对于293f细胞，转染测定法通过使用转染试剂293fectin来进行。29.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤(h)中，将hek293t细胞在12-孔培养平板中在直径为13mm的圆形盖玻片上进行培养，其中将容易粘附的株系直接在盖玻片上在d10培养基中进行培养，保持在包含5％co2的潮湿气氛中大约18小时。30.根据权利要求29的方法，其特征在于，在步骤(h)中，对于使用已经转染的293f细胞的测定法，将所述细胞在微量管中进行离心并且弃去上清液。31.根据权利要求29和30的方法，其特征在于，在转染后，将这两个细胞系都在pbs中洗涤2次并且在1％的在pbs中的低聚甲醛溶液中在4℃下固定1小时，其中在连续洗涤以去除所有固定剂后，将所述细胞在pbs 5％bsa溶液中进行温育以封阻非特异性结合并且在环境温度下温育1小时，然后将细胞在pbs中洗涤3次，并随后与在pbs中的0.5％bsa和0.05％tween 20之中进行稀释的特异性的抗-hpv16 l2或抗-hpv16 e6一抗一起在环境温度下温育1小时，期间频繁地摇动管，其中在重新洗涤后，将细胞与在pbs中的1.5％bsa和0.01％tween 20之中进行稀释的各自的特异性二抗一起在环境温度下温育1小时，期间频繁地摇动包含细胞和具有抗体的溶液的管，其中所使用的二抗为在山羊中产生的抗-小鼠igg488(molecularor)和在山羊中产生的抗-兔igg633，其中在最后一次在pbs中洗涤后，将293f细胞散布在用在pbs中的0.5％聚-l-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。32.根据权利要求29至31的方法，其特征在于，在每个转染反应后，将细胞在缓冲液
(0.5m tris ph 7.4，0.5m nacl，0.5m edta ph 8.0，0.2m egta，triton x-100，蛋白酶抑制剂混合物)中进行裂解，以10,000xg离心5分钟，弃去沉淀物，并且将上清液贮存于-20℃直至使用之时。33.根据权利要求29至32的方法，其特征在于，将在斑点印迹测定法中的阳性样品随后用于通过western印迹测定法来进行的重组蛋白质的表达分析。34.根据权利要求33的方法，其特征在于，制备16％的tricine-sds-page凝胶(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)并且经历在变性条件下的电泳分离(30v，300分钟)，其包含在走样缓冲液中进行稀释的经转染的细胞的裂解物样品，然后将凝胶在考马斯蓝溶液(7％乙酸，50％甲醇，0.1％考马斯亮蓝r-250)中进行染色，或者将蛋白质转移至硝酸纤维素膜以用于进行western印迹测定法，在4℃下在转移缓冲液(0.025m tris，0.192m甘氨酸，20％甲醇)中进行电泳转移(30v和15ma进行18小时，或者70v和35ma进行2小时)后，将膜在包含丽春红临时染料的溶液(0.1％丽春红s，5％乙酸)中进行染色以确证分子量指示物的转移和标记，然后将膜在蒸馏水中进行洗涤以去除临时染色，并且在包含在pbst(0.05％tween 20，pbs)中进行稀释的5％脱脂奶粉的溶液中在环境温度下在摇动下温育1小时，在该时段后，将膜在pbst中洗涤4次并且与包含单克隆的抗-hpv16 l2一抗、在兔中产生的多克隆的抗-hpv16l2一抗和/或抗-hpv16 e6一抗的在pbst中的1％脱脂奶粉溶液一起在环境温度下在摇动下温育2小时，然后将膜再次在pbst中洗涤4次并且在包含缀合有辣根过氧化物酶的各自的抗-小鼠igg或抗-兔igg二抗的溶液中在环境温度下在摇动下温育2小时，所述二抗处于在pbst中的1％脱脂奶粉溶液之中。35.根据权利要求34的方法，其特征在于，在最适合于分离1至100kd的蛋白质的16％的tricine-sds-page电泳凝胶中分析细胞裂解物样品。36.根据权利要求35的方法，其特征在于，对蛋白质样品进行定量，并且调整其浓度从而使得使每个样品包含大约15μg的蛋白质，其中通过使用bradford方法(bio-rad laboratories inc.)来进行蛋白质含量测定，其中将样品在样品缓冲液(1m tris-clph 6.8，0.8％sds，0.1％溴酚蓝，40％甘油，14.4mβ-巯基乙醇)中进行稀释并且最后经历在tris-tricine缓冲液(0.1m tris；0.1m tricine；0.1％sds，ph 8.5)中的电泳分离(30v，300分钟)，在分离后，将凝胶用考马斯蓝溶液进行染色。37.核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含通过3个“连接体”序列相连接的seq id no:3中所示的经优化的l2基因的序列和seq id no:4中所示的经优化的e6基因的序列。38.根据权利要求37的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列是由seq id no:1所示的。39.杂合蛋白，其特征在于，所述杂合蛋白由通过权利要求37或38所定义的核酸序列编码。40.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含通过权利要求37和38所定义的核酸序列。41.根据权利要求40的表达载体，其特征在于，为了构建表达载体，将l2e6核酸序列插入到载体pcdna3.3中，侧翼为内切核酸酶位点hind iii和nhe i，从而被称为pcdna3.3/l2e6，其中所构建的质粒具有细菌复制起点puc、氨苄青霉素抗性基因amp(r)和cmv(巨细胞病毒)启动子。42.免疫学组合物，其特征在于，所述免疫学组合物包含通过权利要求39所定义的杂合
蛋白或者通过权利要求40和41所定义的载体，以及在药学上可接受的载料、赋形剂、承载体。43.根据权利要求42的组合物，其特征在于，所述组合物任选地包含疫苗佐剂，特别是阳离子脂质和hpv的vlp(病毒样颗粒)，或者没有佐剂。44.根据权利要求42至43的组合物，其特征在于，所述组合物包含以肌内方式和以真皮内方式进行施用的，优选地用注射器和针头，通过电穿孔，没有针头的生物注射器，或者通过诸如dna纹身的技术进行施用的，或者以口服方式进行施用的剂型。45.通过权利要求39所定义的杂合蛋白的用途，其特征在于，其用于制备针对hpv和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗。46.通过权利要求40和41所定义的表达载体的用途，其特征在于，其用于制备针对hpv和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗。47.根据权利要求45和46的用途，其特征在于，产生持久的体液免疫应答，其能够刺激针对hpv感染的特异性抗-l2和抗-e6抗体的产生(预防作用)，以及激活细胞免疫应答，以对抗肿瘤细胞并且诱导细胞因子tnf(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。

技术总结
本发明涉及针对HPV和与该病毒相关的癌症的预防性和治疗性疫苗，其旨在用于寻求预防的人或者已发展出了癌症的已经被HPV感染的那些人。本发明还涉及DNA表达载体，其能够有效地产生HPV16病毒的衣壳蛋白L2，以及还有与人乳头瘤病毒肿瘤相关的病毒癌蛋白E6。特别地，本发明涉及通过基因克隆到表达载体中来获得重组的融合或杂合蛋白，其通过经由将一个或多个基因的核酸调控序列与一个或多个基因的蛋白质编码序列相组合而形成的融合基因的基因翻译来产生，其用于生成两种不同类型的应答：持久的体液免疫应答，其能够刺激针对HPV的特异性抗-L2和抗-E6抗体的产生(预防作用)，以及激活细胞免疫应答，以对抗肿瘤细胞并且诱导细胞因子TNF(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。子TNF(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。子TNF(肿瘤坏死因子)的表达(治疗作用)。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：布坦坦研究所
技术研发日：2020.12.07
技术公布日：2022/9/6