一种瑶药少花海桐的快速繁殖方法

1.本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种瑶药少花海桐的快速繁殖方法。


背景技术：

2.瑶药少花海桐(pittosporum pauciflorum hook)系海桐花科南海桐花属植物的茎、枝，是经典瑶药“五虎”中的“上山虎”，也称海金子。少花海桐以茎皮入药为主，具有祛风活络、散寒止痛、镇静等功效，瑶族地区用于风湿性神经痛、坐骨神经痛、牙痛、胃痛、神经衰弱、遗精早泄、毒蛇咬伤等治疗。有临床研究表明，用“上山虎”伤湿止痛膏治疗膝骨性关节炎，可有效减轻膝节肿胀程度，减少滑膜厚度，疗效较好。少花海桐主要分布于广西、广东及江西灌木丛中。目前少花海桐于野生状态，但其野生资源锐减，因此人工种植少花海桐显得十分迫切。目前少花海桐主要通过播种方式进行繁殖，但存在种苗遗传不稳定以及退化现象，导致产量低、茎小枝细，药用价值不高。
3.目前，国内外尚未有少花海桐组织培养技术的报道，也未有少花海桐快速繁殖专利的申请。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种瑶药少花海桐的快速繁殖方法，选择少花海桐当年生未木质化带节茎段为外植体，经诱导不定芽、继代、诱导生根、移栽等步骤，其不定芽诱导率可达到86.8％以上，诱导生根率达到了89.7％以上，移栽成活率达到95％以上，实现了瑶药少花海桐种苗的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。
5.本发明提供的技术方案为：一种瑶药少花海桐的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：采集少花海桐外植体、诱导不定芽、继代培养、诱导生根培养、移栽；
6.所述的用于诱导不定芽的诱导培养基包括：ms培养基、3.0～6.0mg/l 6-ba、1.0～ 3.0mg/l naa、20～30g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂，诱导培养基ph为5.4～5.8。
7.所述的诱导外植体形成不定芽操作的方法为：将少花海桐当年生未木质化带节茎段经消毒后切成2.0～3.0cm的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全黑暗培养70～90天即可诱导形成不定芽。
8.所述的继代培养操作所用到的继代培养基包括：ms培养基、1.0～3.0mg/l 6-ba、0.5～ 1.5mg/l naa、20～30g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂，继代培养基ph为5.4～5.8。
9.所述的继代培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽去除顶端后接种到继代培养基中培养45～60天即可实现不定芽的继代。
10.所述的诱导生根培养操作所用到的生根培养基包括：ms培养基、2.0～4.0mg/l ggr、 1.0～2.0mg/l iba、1.0～2.0mg/l naa、15～20g/l蔗糖、3.0～4.0g/l琼脂、0.5～1.0g/l活性炭，生根培养基ph为5.4～5.8。
11.所述的诱导生根培养操作具体为：将继代培养操作得到的长2.0～3.0cm的无根不
定芽接种到生根培养基中培养25～30天即能诱导不定芽生根。
12.所述的移栽操作的具体方法为：将经诱导生根培养操作得到的高约4～5cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗5～7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗。
13.继代培养操作、诱导生根操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2000～ 3000lx，光照时间为10～12小时/天。
14.有益效果：
15.本发明鉴于目前国内对少花海桐的组织培养未有研究报道，选择少花海桐当年生未木质化带节茎段为外植体，经诱导不定芽、继代、诱导生根、移栽等步骤，建立了瑶药少花海桐的组织培养体系。本发明具有技术性强、成本低廉、工艺简单等特点，可直接用于瑶药少花海桐种苗的工厂化生产，对于促进瑶药少花海桐开发利用具有重要的现实意义。
具体实施方式
16.下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
17.实施例一
18.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的少花海桐植株当年生未木质化带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
19.(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗4次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成2.0～3.0cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃进行全黑暗培养 90天即可诱导形成不定芽，诱导率为86.8％，污染率为低于20％。所述的诱导培养基为： ms培养基 3.0mg/l 6-ba 1.0mg/l naa 20g/l蔗糖 3.0g/l琼脂，ph为5.4。
20.(3)不定芽继代：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约2.0～3.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养60天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到2.7倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 1.0mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 20g/l蔗糖 3.0g/l琼脂，ph 为5.4。
21.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到诱导生根培养基中培养30天即能诱导试管苗生根，生根率为89.7％。所述的生根培养基为：ms培养基 2.0mg/l ggr 1.0mg/l iba 1.0mg/l naa 15g/l蔗糖 3.0g/l琼脂 0.5g/l活性炭，ph为5.4。
22.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约4～5cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗5天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为95％。
23.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天。
24.实施例二
25.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的少花海桐植株当年生未木质化带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
26.(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒25秒钟，无菌水冲洗5次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成2.0～3.0cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于26℃进行全黑暗培养 80天即可诱导形成不定芽，诱导率为87.3％，污染率为低于15％。所述的诱导培养基为： ms培养基 4.5mg/l 6-ba 1.5mg/l naa 25g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.6。
27.(3)不定芽继代：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约2.0～3.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养52天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到2.9倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 2.0mg/l 6-ba 1.0mg/l naa 25g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph 为5.6。
28.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到诱导生根培养基中培养27天即能诱导试管苗生根，生根率为90.3％。所述的生根培养基为：ms培养基 3.0mg/l ggr 1.5mg/l iba 1.5mg/l naa 17g/l蔗糖 3.5g/l琼脂 0.7g/l活性炭，ph为5.6。
29.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约4～5cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗在温室的自然光下炼苗6天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为97.6％。
30.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为2500lx，光照时间为11小时/天。
31.实施例三
32.(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的少花海桐植株当年生未木质化带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
33.(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室的外植体先在自来水下冲洗过夜，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒钟，无菌水冲洗6次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒25分钟，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成2.0～3.0cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，置于28℃进行全黑暗培养 70天即可诱导形成不定芽，诱导率为89.5％，污染率为低于10％。所述的诱导培养基为： ms培养基 6.0mg/l 6-ba 3.0mg/l naa 30g/l蔗糖 4.0g/l琼脂，ph为5.8。
34.(3)不定芽继代：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约2.0～3.0cm的茎段并去除顶端后接种到增殖培养基中培养45天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到3.1倍。所述的增殖培养基为：ms培养基 3.0mg/l 6-ba 1.5mg/l naa 30g/l蔗糖 4.0g/l琼脂，ph 为5.8。
35.(4)诱导生根：从基部切取步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到诱导生根培养基中培养25天即能诱导试管苗生根，生根率为94.6％。所述的生根培养基为：ms培养基 4.0mg/l ggr 2.0mg/l iba 2.0mg/l naa 20g/l蔗糖 4.0g/l琼脂 1.0g/l活性炭，ph为5.8。
36.(5)移栽：将步骤(4)得到的高约4～5cm、根系粗壮、生长健壮、叶色浓绿的试管苗
在温室的自然光下炼苗7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:农家肥:河沙＝8:1:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为 96.1％。
37.上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为3000lx，光照时间为12小时/天。
38.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。