用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及儿茶酚胺代谢产物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(ppgl)是分别起源于肾上腺髓质或肾上腺外交感神经链的肿瘤，主要合成和分泌大量儿茶酚胺，引起患者血压升高等一系列临床症候群，并造成心、脑、肾等严重并发症。激素及代谢产物的测定是ppgl定性诊断的主要方法，包括测定血和尿去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)、肾上腺素(epinephrine，e)、多巴胺(dopamine，da)及其中间代谢产物变肾上腺素(mn)、去甲变肾上腺素(nmn)、3-甲氧基酪胺(3-mt)和终末代谢产物香草扁桃酸(vma)及高香草酸(hva)浓度。mn、nmn及3-mt分别是e、ne及da的中间代谢产物，它们仅在肾上腺髓质和ppgl瘤体内代谢生成并且以高浓度水平持续存在，故是ppgl的特异性标记物，检测这3种代谢产物能明显提高ppgl的诊断敏感性及降低假阴性率。
3.因此，一种能够准确、高效地检测尿液中nmn、mn和3-mt的含量，以为临床嗜铬细胞瘤的诊断提供帮助的试剂盒是目前市场亟需的产品。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒，缓解了现有技术中缺少一种能够准确、高效地检测尿液中nmn、mn和3-mt含量的试剂盒的问题。
6.本发明的第二目的在于提供上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量中的应用。
7.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
8.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒，所述儿茶酚胺代谢产物为mn、nmn和3-mt；
9.所述试剂盒包括校准品、内标、淋洗液和洗脱液；
10.所述校准品为含有mn、nmn和3-mt的混合溶液；所述内标为香兰素胺盐酸盐。
11.优选地，所述校准品的基质选自人工尿液、生理盐水或缓冲液；
12.优选地，所述缓冲液为pbs缓冲液；
13.优选地，所述校准品的基质选自人工尿液。
14.优选地，所述淋洗液为乙酸铵水溶液；
15.优选地，所述淋洗液为10-60mmol乙酸铵水溶液；
16.优选地，所述淋洗液为20mmol乙酸铵水溶液。
17.优选地，所述洗脱液为乙腈、水和甲酸的混合溶液；
18.优选地，按照体积百分比计，所述洗脱液中含有90～98％的乙腈，1～5％的水和1～5％的甲酸；
19.优选地，所述洗脱液中乙腈、甲酸和水的体积比为98:2:2。
20.优选地，所述内标为内标储备液或内标工作液；
21.优选地，所述内标储备液中香兰素胺盐酸盐的浓度为1000μg/ml；
22.优选地，所述内标工作液中香兰素胺盐酸盐的浓度为2000～7000ng/ml，优选为4000ng/ml。
23.优选地，所述试剂盒还包括质控品；
24.所述校准品和所述质控品分别按照目标浓度配制，然后经高一级校准品赋值得到所述校准品和所述质控品的标示浓度，所述标示浓度的准确度的相对偏差≤
±
15％；
25.优选地，所述质控品的基质选自人工尿液、生理盐水或缓冲液；
26.优选地，所述缓冲液为pbs缓冲液；
27.优选地，所述质控品的基质选自人工尿液。
28.优选地，所述校准品中nmn、mn和3-mt的目标浓度为：校准品c1：nmn、mn和3-mt依次为20ng/ml、20ng/ml和8ng/ml；校准品c2：nmn、mn和3-mt依次为50ng/ml、50ng/ml和20ng/ml；校准品c3：nmn、mn和3-mt依次为200ng/ml、200ng/ml和80ng/ml；校准品c4：nmn、mn和3-mt依次为500ng/ml、500ng/ml和200ng/ml；校准品c5：nmn、mn和3-mt依次为2000ng/ml、2000ng/ml和800ng/ml；校准品c6：nmn、mn和3-mt依次为5000ng/ml、5000ng/ml和2000ng/ml。
29.优选地，所述校准品中nmn、mn和3-mt的标示浓度与目标浓度的偏差不超过目标浓度的15％。
30.优选地，质控品的目标浓度为：低值质控品：nmn、mn和3-mt依次为250ng/ml、250ng/ml和100ng/ml；中值质控品：nmn、mn和3-mt依次为2500ng/ml、2500ng/ml和1000ng/ml；高值质控品：nmn、mn和3-mt依次为4000ng/ml、4000ng/ml和1600ng/ml。
31.优选地，所述质控品中nmn、mn和3-mt的标示浓度与目标浓度的偏差不超过目标浓度的15％。
32.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量中的应用，所述检测包括先采用固相萃取法预处理样品，然后采用高效液相色谱法检测尿液中儿茶酚胺代谢产物含量。
33.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
34.本发明针对市场上诊断人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的高效液相色谱法试剂盒的空白，提供了一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒，该试剂盒用于检测儿茶酚胺代谢产物中的变肾上腺素(mn)、去甲变肾上腺素(nmn)和3-甲氧基酪胺(3-mt)。
35.该试剂盒包括用于进行高效液相色谱分析的校准品和内标。该试剂盒选用香兰素胺作为内标，人体内不含有香兰素胺可以排除内源性干扰，同时香兰素胺与三种待测物性质相似，在相同的前处理及色谱条件下具有一定的稳定性，与三种待测物保留时间接近但不重叠，因此可以作为内标物，在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。
36.该试剂盒还包括用于对样品进行固相萃取的淋洗液和洗脱液，该试剂盒在使用时
先通过固相萃取的前处理方法去除尿液中的大部分干扰及杂质，然后采用高效液相色谱法结合荧光检测法进行分析，能够得到更为准确的结果。
37.本发明提供的用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒能准确、高效地评价人尿液中儿茶酚胺代谢产物mn、nmn和3-mt的含量，能满足相关法规对试剂盒的线性、重复性、批间差、准确度、均匀性等的要求，对测定人体尿液中儿茶酚胺代谢产物的含量有重要作用。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为采用本发明提供的试剂盒进行液相色谱分析得到的色谱图。
具体实施方式
40.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒，所述儿茶酚胺代谢产物为变肾上腺素(mn)、去甲变肾上腺素(nmn)和3-甲氧基酪胺(3-mt)。
42.本发明提供的试剂盒包含用于固相萃取的淋洗液和洗脱液，以及用于高效液相色谱分析的校准品和内标；并可选地包括用于对检测结果进行质量控制的质控品。
43.本发明试剂盒提供了用于固相萃取的淋洗液和洗脱液，通过固相萃取的前处理方法可以去除尿液中的大部分干扰及杂质，固相萃取具有操作简单、价格便宜、吸附容量大、易与检测仪器联用的优点。
44.淋洗的目的是洗去吸附于固定相上的干扰组分，淋洗液优选为乙酸铵水溶液，淋洗液中乙酸铵浓度优选为10～60mmol，例如可以为但不限于为10、20、30、40、50或60mmol，更优选为20mmol乙酸铵水溶液。使用乙酸铵水溶液作为淋洗液能够尽可能的将干扰组分从固定相上洗脱，同时降低分析物的损失。
45.洗脱液的目的是洗脱待分析物，洗脱液优选使用乙腈、水和甲酸的混合溶液，具体组成优选如下：按照体积百分比计，所述洗脱液中含有90～98％的乙腈，例如可以为但不限于为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％；1～5％的水，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％；和1～5％的甲酸，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％。更优选地，所述洗脱液中乙腈、甲酸和水的体积比为98:2:2。本发明试剂盒还提供了用于高效液相色谱分析的校准品和内标。
46.内标采用香兰素胺盐酸盐。人体内不含有香兰素胺，因此可以排除内源性干扰；同时香兰素胺与三种待测物性质相似，在相同的前处理及色谱条件下具有一定的稳定性，与
三种待测物保留时间接近但不重叠，因此可以作为内标物，从而在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差。
47.试剂盒中的内标优选以内标储备液或内标工作液的形式存在，内标储备液的浓度优选为1000μg/ml，在使用时稀释到目标浓度；内标工作液中香兰素胺盐酸盐的浓度优选为2000～7000ng/ml，例如可以为但不限于为2000、3000、4000、5000、6000或7000ng/ml，更优选为4000ng/ml
48.使用高效液相色谱分析样本时首先需要建立标准曲线，标准曲线是已知浓度的校准品中待测物质的含量与其色谱图特征值的函数关系，例如与峰面积或峰高的函数关系。然后将待测样本色谱图的特征值带入构建的标准曲线中，便可以得到待测样本中待测物质的含量。因此本发明提供的试剂盒还含有用于构建标准曲线的校准品。本发明提供的校准品为含有mn、nmn和3-mt的混合溶液。
49.本发明提供的试剂盒中的校准品由校准品c1～c6组成，每个校准品中同时含有nmn、mn和3-mt，各校准品之间nmn、mn和3-mt的浓度水平不相同。校准品c1～c6中nmn、mn和3-mt的目标浓度如下：
50.校准品c1：nmn、mn和3-mt依次为20ng/ml、20ng/ml和8ng/ml；校准品c2：nmn、mn和3-mt依次为50ng/ml、50ng/ml和20ng/ml；校准品c3：nmn、mn和3-mt依次为200ng/ml、200ng/ml和80ng/ml；校准品c4：nmn、mn和3-mt依次为500ng/ml、500ng/ml和200ng/ml；校准品c5：nmn、mn和3-mt依次为2000ng/ml、2000ng/ml和800ng/ml；校准品c6：nmn、mn和3-mt依次为5000ng/ml、5000ng/ml和2000ng/ml。
51.本发明中“目标浓度”指的是，在配制校准品时对其目标浓度的期望值，而非校准品的实际浓度。在实际操作中，校准品的配制由于操作、仪器以及容器等因素会产生误差，使校准品的实际浓度与预配制的理论浓度，即目标浓度产生偏差。在实际操作中通常会使用更高一级的校准品对用于建立标准曲线的校准品进行校正与赋值，经更高一级的校准品赋值后的校准品的标示浓度可能会与目标浓度的值产生偏差，这种偏差是本领域可接受的。因此，当根据上述目标浓度配制校准品和质控品后，得到的校准品即使并非严格符合上述目标浓度，但是只要在本领域可接受的误差内，也属于本发明的保护范围。
52.用于构建标准曲线的校准品经高一级校准品赋值后得到其标示浓度，标示浓度的准确度的相对偏差≤
±
15％。标示浓度与目标浓度的偏差优选不超过目标浓度的15％。即校准品c1～c6的标示浓度范围如下：
53.校准品c1：nmn、mn和3-mt依次为20
±
3ng/ml、20
±
3ng/ml和8
±
1.2ng/ml；校准品c2：nmn、mn和3-mt依次为50
±
7.5ng/ml、50
±
7.5ng/ml和20
±
3ng/ml；校准品c3：nmn、mn和3-mt依次为200
±
30ng/ml、200
±
30ng/ml和80
±
12ng/ml；校准品c4：nmn、mn和3-mt依次为500
±
75ng/ml、500
±
75ng/ml和200
±
30ng/ml；校准品c5：nmn、mn和3-mt依次为2000
±
300ng/ml、2000
±
300ng/ml和800
±
120ng/ml；校准品c6：nmn、mn和3-mt依次为5000
±
750ng/ml、5000
±
750ng/ml和2000
±
300ng/ml。
54.本发明提供的试剂盒优选还含有对检测结果进行质量控制的质控品，为了更全面的对检测结果进行评价，所述质控品包括低值质控品、中值质控品和高值质控品。质控品的目标浓度优选如下，质控品目标浓度的含义参见校准品目标浓度的描述，在此不再赘述：
55.低值质控品：nmn、mn和3-mt依次为250ng/ml、250ng/ml和100ng/ml；中值质控品：
nmn、mn和3-mt依次为2500ng/ml、2500ng/ml和1000ng/ml；高值质控品：nmn、mn和3-mt依次为4000ng/ml、4000ng/ml和1600ng/ml。
56.质控品经高一级校准品赋值后得到其标示浓度，标示浓度的准确度的相对偏差≤
±
15％。标示浓度与目标浓度的偏差优选不超过目标浓度的15％。即低值质控品、中值质控品和高值质控品的标示浓度范围如下：
57.低值质控品中nmn、mn和3-mt依次为250
±
37.5ng/ml、250
±
37.5ng/ml和100
±
15ng/ml；中值质控品中nmn、mn和3-mt依次为2500
±
375ng/ml、2500
±
375ng/ml和1000
±
150ng/ml；高值质控品中nmn、mn和3-mt依次为4000
±
600ng/ml、4000
±
600ng/ml和1600
±
240ng/ml。
58.校准品和质控品的基质分别独立的优选自人工尿液、生理盐水或缓冲液，其中缓冲液优选为pbs缓冲液。所述基质优选为人工尿液，使用人工尿液作为人尿液样本的替代基质配制标准曲线的各个浓度点和/或各浓度水平的质控品，稳定性好又易于获得，且方便保存。
59.本试剂盒采用液相色谱法测定人体尿液中儿茶酚胺代谢产物nmn、mn和3-mt的含量，该试剂盒nmn线性范围为20～5000ng/ml，mn线性范围为20～5000ng/ml，3-mt线性范围为8～2000ng/ml，相关系数均r≥0.990；nmn，mn及3-mt的加标回收率(r)在85％～115％范围内；低值质控品重复性的变异系数(cv)≤20％，高值质控品重复性的变异系数(cv)≤15％；低值质控品的批间变异系数(cv)≤20％，高值质控品的批间变异系数(cv)≤20％；准确度的相对偏差(b)≤
±
15％。校准品均匀性的变异系数cv≤15％；质控品均匀性的变异系数cv≤15％。
60.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量中的应用，所述检测包括先采用固相萃取法预处理样品，然后采用高效液相色谱法检测尿液中儿茶酚胺代谢产物含量。将上述试剂盒应用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量具有检测速度快，特异性强和准确度高的优点。
61.下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
62.下述实施例使用的材料和试剂如表1和表2所示。
63.表1主要试剂
[0064][0065]
表2设备和仪器
[0066][0067][0068]
实施例1
[0069]
本实施例提供了一种用于检测人体尿液中儿茶酚胺代谢产物含量的试剂盒，试剂组成如表3所示，表中浓度均为标示浓度。
[0070]
表3试剂盒的主要组成
[0071][0072]
配制方法：
[0073]
(一)化合物储备液及次级储备液的配制
[0074]
1.分别精密称量购买的nmn、mn及3-mt标准品，用0.05m盐酸水作稀释液，容量瓶定容，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，分别得到浓度为1000μg/ml的nmn、mn及3-mt的储备液，置于-20℃冰箱中贮存。
[0075]
2.分别精密量取上一步骤得到的三种储备液适量，用0.05m盐酸水稀释，配制成三种代谢产物的终浓度分别为nmn：100μg/ml，mn：100μg/ml，3-mt：40μg/ml的混合次级储备液。以配制10.00ml次级储备液为例：
[0076]
表4次级储备液的配制
[0077][0078]
(二)校准品的配制
[0079]
1.校准品c6、空白液h0配制，以配制50.00ml校准品c6，空白液h0为例：
[0080]
精密移取步骤(一)中的次级储备液2.5ml，再加入人工尿液定容至50ml，上下颠倒至少10次，混合均匀。
[0081]
表5校准品c6配制
[0082][0083]
表6空白液h0配制
[0084][0085]
2.校准品c1～c5的配制
[0086]
以配制50.00mlc1～c5为例，校准品c1～c5的配制是分别将校准品c6与空白液h0稀释后得到，稀释比例见下表：
[0087]
表7校准品c1～c5配制
[0088][0089]
(三)质控品配制
[0090]
以配制50.00ml质控品lqc，mqc，hqc为例，lqc，mqc，hqc的配制是分别将校准品c6与空白液h0稀释后得到，稀释比例见下表：
[0091]
表8质控品lqc，mqc，hqc配制
[0092][0093]
(四)内标储备液及内标工作液的配制
[0094]
1.精密称量购买的香兰素胺盐酸盐，用纯化水作稀释液，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，得到浓度为1000μg/ml的香兰素胺储备液，即为内标储备液，置于-20℃冰箱中贮存。
[0095]
2.精密量取内标储备液适量，用纯化水稀释，配制成终浓度为4000ng/ml的内标工作液。
[0096]
该试剂盒采用如下方法步骤对样品进行检测：
[0097]
(1)前处理步骤：
[0098]
1.预处理：所有校准品、质控品及尿液样本各取100μl至96孔板中，分别加入50μl内标工作液，封膜后振荡混合5分钟，以4000rpm 4℃条件下离心5分钟，备用。
[0099]
2.活化：向新的spe96孔板每孔加入200μl甲醇，使用正压固相萃取装置或负压装置施加压力压下去，弃去；然后每孔加入200μl纯化水；施加压力压下去，弃去，控制流速3-5s/滴。
[0100]
3.上样：向活化过的spe96孔板对应每孔全部转移步骤1中预处理的样本，施加压力压下去，弃去，控制流速3-5s/滴。
[0101]
4.淋洗：每孔加入200μl的淋洗液，施加压力压下去，弃去；然后每孔加入200μl甲醇，施加压力压下去，弃去，控制流速3-5s/滴。
[0102]
5.洗脱：每孔加入200μl洗脱液，施加压力压下去，收集至新的96孔收集板，控制流速3-5s/滴。
[0103]
6.氮吹复溶：将步骤5收集的96孔板在35℃下氮气吹干，然后用200μl纯化水复溶，封膜后振荡混合5分钟，以4000rpm 4℃条件下离心5分钟，用于液相色谱仪分析。
[0104]
7.结果计算：以校准品标示浓度或校准品标示浓度与对应内标的浓度比为x，相应峰面积的比值为y绘制校准曲线，根据待测样本中的儿茶酚胺代谢物及对应内标的峰面积的比值，即可计算出样本中nmn，mn和3-mt的含量。
[0105]
(2)高效液相色谱-荧光检测分析条件
[0106]
1.液相条件
[0107]
表9液相条件
[0108][0109][0110]
2.荧光条件
[0111]
表10荧光条件
[0112]
激发波长ex286nm
发射波长em318nm
[0113]
采用本试剂盒，以上述条件进行液相色谱分析，得到的色谱图如图1所示，色谱图中nmn为去甲变肾上腺素；mn为变肾上腺素；3-mt为3-甲氧基酪胺；is为内标。
[0114]
实施例2试剂盒外观
[0115]
(1)外观
[0116]
1)验证方法：随机取试剂盒中校准品各1瓶，在自然光下以矫正视力目视观察。
[0117]
2)接受标准：包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分应澄清，无沉淀、颗粒或絮状物。
[0118]
(2)实验结果：
[0119]
(a)试剂盒的各组份应齐全、完整、无破损。
[0120]
(b)最小包装标签的文字、内容应清晰、准确，封口严密，无渗漏。
[0121]
(c)液体组分应澄清、透明，无沉淀、颗粒或絮状物。
[0122]
(3)结论：
[0123]
包装完整、无破损；最小包装标签的文字、内容清晰、准确，封口严密，无渗漏；组分澄清，无沉淀、颗粒或絮状物，满足接受标准。
[0124]
实施例3试剂盒装量
[0125]
(1)装量
[0126]
1)验证方法：随机取1试剂盒，用通用量具测量各液体组分的净含量。
[0127]
2)接受标准：试剂盒中各液体试剂的净含量应不少于标示值。
[0128]
(2)实验结果：
[0129]
表11
[0130]
装量实测standard判定校准品c11.1ml≥1ml合格校准品c21.1ml≥1ml合格校准品c31.1ml≥1ml合格校准品c41.1ml≥1ml合格校准品c51.1ml≥1ml合格校准品c61.1ml≥1ml合格lq c1.1ml≥1ml合格mq c1.1ml≥1ml合格hq c1.1ml≥1ml合格内标工作液8.0ml≥7ml合格淋洗液26.0ml≥25ml合格洗脱液26.0ml≥25ml合格
[0131]
(3)结论：试剂盒中各液体试剂的净含量不少于标示值，满足接受标准。
[0132]
实施例4试剂盒线性
[0133]
(1)线性：
[0134]
1)验证方法：连续配制3批标准曲线，分别用实施例1的处理方法和参数进行检测，计算各个浓度点的相对偏差及线性相关系数。运用数据分析软件计算线性回归的相关系数
r。
[0135]
2)接受标准：nmn，mn，3-mt的线性最低浓度点的偏差均在
±
20.0％以内，其余浓度点的偏差均在
±
15.0％以内，线性回归的相关系数r均≥0.990。
[0136]
(2)实验结果：结果如表12～14所示。
[0137]
表12
[0138][0139]
表13
[0140][0141][0142]
表14
[0143][0144]
(3)结论：nmn，mn，3-mt的线性最低浓度点的偏差均在
±
20.0％以内，其余浓度点的偏差均在
±
15.0％以内，线性回归的相关系数r均≥0.990，满足接受标准。
[0145]
实施例5试剂盒加标回收率
[0146]
(1)加标回收率：
[0147]
1)验证方法：将已知浓度的高水平待测物(a液，包含nmn，mn和3-mt三种化合物，a液可以直接选用合适的高浓度参考物质，若无参考物质，也可用与被测量一致的纯品进行配制，配制时应采用重量法，以减小配制过程中的不确定度)，加入到人的尿液样本b液中，配制成至少3个不同浓度的回收样本，所加待测物a与人的尿液样本b之间的体积比例为不大于1∶9，各重复检测3次，取平均值，计算回收率，各样本各化合物的回收率(r)应在85％-115％范围内。
[0148]
r＝(c
实测值-c
本底值
)/c
理论值
×
100％
[0149]
r：回收率；
[0150]c实测值
：根据线性拟合计算出的测量值的平均值；
[0151]c本底值
：人的尿液样本的本底值；
[0152]c理论值
：配制后的样本的理论浓度。
[0153]
2)接受标准：nmn，nm及3-mt的回收率(r)应在85％-115％范围内。
[0154]
(2)实验结果
[0155]
表15
[0156][0157]
(3)结论：nmn，nm及3-mt的回收率(r)在85％～115％范围内。
[0158]
实施例6试剂盒重复性
[0159]
(1)重复性
[0160]
1)验证方法：在重复性条件下，按照检验方法使用试剂盒测试质控品，重复测试10次。按照下列公式计算重复性的变异系数(cv)，低值质控品cv≤20％，高值质控品cv≤15％。
[0161][0162]
cv：重复性的变异系数
[0163]
10次测量结果的平均值
[0164]
s：10次测量结果的标准差
[0165]
2)接受标准：低值质控品的变异系数cv≤20％，高值质控品的变异系数cv≤15％。
[0166]
(2)实验结果
[0167]
表16
[0168][0169]
(3)结论：低值质控品的变异系数cv≤20％，高值质控品的变异系数cv≤15％，满足接受标准。
[0170]
实施例7试剂盒批间差
[0171]
(1)批间差
[0172]
1)验证方法：按照检验方法使用三个不同批号的试剂盒测试质控品，分别测试10次，共30次。按照下列公式计算重复性的变异系数(cv)，低值质控品cv≤20％，高值质控品cv≤15％。
[0173][0174]
cv：重复性的变异系数
[0175]
30次测量结果的平均值
[0176]
s：30次测量结果的标准差
[0177]
2)接受标准：低值质控品的变异系数cv≤20％，高值质控品的变异系数cv≤15％。
[0178]
(2)实验结果
[0179]
表17
[0180][0181]
(3)结论：低值质控品的变异系数cv≤20％，高值质控品的变异系数cv≤15％，满足接受标准。
[0182]
实施例8试剂盒准确度
[0183]
(1)准确度：
[0184]
1)验证方法：以高一级校准品定标，测定试剂盒内校准品，重复检测3次，取测试结果均值(m)，按以下公式计算相对偏差(b)，准确度的相对偏差(b)应≤
±
15％。
[0185]
b＝(m-t)/t
×
100％
[0186]
b：相对偏差
[0187]
m：测试结果均值
[0188]
t：标示值
[0189]
接受标准：准确度的相对偏差b应≤
±
15％。
[0190]
(2)实验结果
[0191]
表18
[0192][0193]
(3)结论：准确度的相对偏差b应≤
±
15％，满足接受标准。
[0194]
实施例9试剂盒质控品预期结果
[0195]
(1)质控品预期结果
[0196]
1)验证方法：在校准品拟合的曲线下，测定试剂盒内质控品，重复检测3次，质控品的检测结果应在该质控品定值的可接受范围内。
[0197]
2)接受标准：质控品的检测结果应在该质控品定值的可接受范围内。
[0198]
(2)实验结果
[0199]
表19
[0200][0201]
(3)结论：质控品的检测结果应在该质控品定值的可接受范围内。
[0202]
实施例10试剂盒校准品均匀性
[0203]
(1)校准品均匀性
[0204]
1)验证方法：在工作标准品拟合的曲线之下，按照检测方法测试同一批号的10瓶校准品，每瓶检测一次，分别计算出各水平校准品每孔检测1次，共10次的平均值(`x1)和标准差(sd1)。然后取其中一瓶，重复检测10次，计算结果平均值(`x2)和标准差(sd2)。
[0205]
按照下列公式计算出变异系数(cv)。
[0206][0207][0208]
当sd1＜sd2时，令cv＝0。
[0209]
2)接受标准：校准品的变异系数cv≤15％。
[0210]
(2)实验结果：
[0211]
表20
[0212]
[0213][0214]
(3)结论：校准品的变异系数cv≤15％。
[0215]
实施例11试剂盒质控品均匀性
[0216]
(1)质控品均匀性
[0217]
1)验证方法：每个浓度取10瓶作为样本，在校准品拟合的曲线之下，每个浓度水平的质控品随机编号1～10，每瓶重复测试3次。
[0218]
3次测试按照以下顺序进行：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。按照下列公式计算出各水平质控品的变异系数(cv)。
[0219]
[0220][0221]
ss
瓶内
＝ss
总和-ss
瓶间
[0222][0223][0224][0225][0226][0227]
式中：
[0228]
cv：变异系数；ss：方差；v：自由度；ms：均方；f：f检验值；
[0229]
n0：有效测量次数；s
bb
：瓶间标准差；sr：重复性标准差；
[0230]
x：测量或计算结果；总平均值。
[0231]
当f≤1时，以sr代替s
bb
计算cv
瓶间
。
[0232]
当f≤f0.05(v1，v2)时，检验结果显示瓶间均匀性无显著性差异，计算结果cv
瓶间
。
[0233]
当f＞f0.05(v1，v2)、s
bb
≤0.3
δ
时，认为瓶间均匀性良好，计算结果cv
瓶间
。
[0234]
当f＞f0.05(v1，v2)、s
bb
＞0.3
δ
时，认为瓶间均匀性较差，不符合要求。
[0235]
注：δ为目标标准偏差。
[0236]
2)接受标准：质控品的变异系数cv≤15％。
[0237]
(2)实验结果
[0238]
表21
[0239][0240][0241]
表22
[0242][0243][0244]
表23
[0245][0246][0247]
(3)结论：质控品的变异系数cv≤15％，满足接受标准。
[0248]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。