皮肤表面微生物的采集方法及检测方法与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种皮肤表面微生物的采集方法及检测方法。


背景技术：

2.作为人体最大的器官，皮肤是机体和环境接触的主要保护屏障，皮肤表面定居有多种微生物，称为皮肤微生物群。皮肤微生物群落的组成和动态分布与皮肤表面组织细胞乃至宿主健康免疫状态之间存在着整体平衡，这种动态平衡一旦被打破，可能会对人体健康产生影响。为了研究皮肤微生物与人体健康之间的关系，需要对皮肤微生物采集后进行分析。传统的皮肤微生物采集方法是棉签采集法，具体为：将生理盐水浸湿的无菌棉签按在取样表面上，用力使其弯曲与擦拭表面成45
°
角，平稳而缓慢地擦拭取样表面，翻转棉签，让棉签的另一面也进行擦拭，但与前次擦拭方向垂直，完成一次取样。重复上述操作，进行多次取样，每次取样位置应避免与前次取样点重复，取样完成后，将每个取样点的棉签头剪下集中放入2～5ml灭菌冻存管，盖子盖紧密封。虽然棉签刮取活检法可以通过大量重复刮取采集到皮肤微生物样本，但取样深度和角度都很难把握，操作带来的误差很大。另外，棉签刮取活检法所采集的微生物量少，会存在难以分析检测的问题。


技术实现要素：

3.基于此，有必要提供一种皮肤表面微生物的采集方法，以解决传统棉签采集法存在的操作繁琐、采集量少以及误差大的问题。
4.此外，还有必要提供一种皮肤表面微生物的检测方法。
5.一种皮肤表面微生物的采集方法，包括如下步骤：
6.获得聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶；及
7.将所述聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面，以采集皮肤表面微生物。
8.传统的皮肤表面微生物的采集方法多采用棉签刮取法，存在操作繁琐、误差大、采集量少等问题，不能准确分析皮肤表面微生物情况。发明人在实验中发现，利用聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面进行微生物采集，能够方便快捷地采集皮肤表面微生物，且采集量较传统方法明显更多。一方面，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶具有良好的生物相容性，对皮肤无刺激，另一方面，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶中聚丙烯酰胺通过共价交联形成网络结构，聚多巴胺通过酚羟基与聚丙烯酰胺中的氨基的相互作用链接在聚丙烯酰胺网络上，且聚多巴胺中的酚羟基还能够形成π-π堆积和氢键作用，上述多重作用使得聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶与皮肤表面具有较好的粘附强度，用其进行微生物采集，所采集的微生物量较棉签拭子擦拭法的采样量更多，效率更高，且仅需贴附在皮肤表面即可，避免了棉签拭子多次擦拭所带来的误差，为皮肤表面微生物采集提供了一种新的方法。
9.在其中一个实施例中，所述聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶包括水凝胶基层，所述水凝胶基层的制备过程包括：
10.将多巴胺在碱性溶液中或在粘土粉末存在下发生部分氧化，形成聚多巴胺，所述聚多巴胺中含有酚羟基；
11.将所述聚多巴胺与丙烯酰胺混合，在引发剂和交联剂作用下使所述丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺。
12.将多巴胺(da)在碱性溶液中或在粘土粉末存在下发生部分氧化，能够使所形成的聚多巴胺(pda)中含有较多的自由酚羟基。将丙烯酰胺(am)单体与聚多巴胺混合，am在引发剂和交联剂的作用下发生自由基聚合形成聚丙烯酰胺(pam)，能够阻止环境中的氧气与pda中的自由酚羟基接触，阻止pda进一步氧化，使水凝胶中保留了足够多的自由酚羟基，从而赋予水凝胶良好的粘附性。
13.在其中一个实施例中，所述引发剂包括光引发剂和热引发剂，将所述聚多巴胺与丙烯酰胺混合，在引发剂和交联剂作用下使所述丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺的步骤包括：
14.将所述聚多巴胺、所述丙烯酰胺、所述光引发剂和所述交联剂混合，在光照条件下进行预聚合，再加入所述热引发剂和催化剂，在加热条件下继续聚合。
15.采用先光引发聚合，再热聚合的方式较单纯的过氧化物引发聚合的方式，更利于成胶，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。另外，光引发聚合反应更快速，聚合后可阻止环境中的氧气与pda中自由酚羟基接触，阻止pda的进一步氧化，能保留足够多的自由酚羟基，从而粘附性会提高。同时，采用紫外线照射也一定程度上对反应液进行杀菌，避免内部的营养物质被杂菌消耗。
16.在其中一个实施例中，所述预聚合的时间为60s～120s；及/或，
17.在加热条件下继续聚合的时间为30min～45min；及/或，
18.加热的温度为80℃～85℃。
19.通过调整光引发聚合和热引发聚合的时间，调控所制备的水凝胶基层的粘附强度，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。
20.在其中一个实施例中，所述多巴胺与所述丙烯酰胺的质量比为(1.3～1.6):100；及/或，
21.所述粘土粉末与所述丙烯酰胺的质量比为(12～15):100；及/或，
22.所述光引发剂与所述丙烯酰胺的质量比为(0.5～1):100；及/或，
23.所述交联剂与所述丙烯酰胺的质量比为(1.2～1.5):100；及/或，
24.所述热引发剂与所述丙烯酰胺的质量比为(3.4～5):100；及/或，
25.所述催化剂与所述丙烯酰胺的质量比为(0.1～0.5):100。
26.通过优化各物质的配比，进一步提高所制备的水凝胶基层的粘附强度，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。
27.在其中一个实施例中，将多巴胺在碱性环境中发生部分氧化的步骤包括：将所述多巴胺与ph为10～11的碱性溶液混合，搅拌20min～30min，使所述多巴胺发生部分氧化；
28.将多巴胺在粘土粉末存在下发生部分氧化的步骤包括：将所述多巴胺与所述粘土粉末在溶液中混合搅拌5h～6h，再超声5min～10min，使所述多巴胺发生部分氧化。
29.通过在碱性环境中快速氧化，避免多巴胺的过度氧化，使所制备的水凝胶保持较多的自由酚羟基。粘土粉末具有层状结构，将多巴胺与粘土粉末混合，使多巴胺插层到粘土
粉末的层间，并在层间被氧化，形成聚多巴胺(pda)插层的粘土粉末。而粘土粉末的层间氧含量不足，使多巴胺进行有限的氧化，避免过度氧化，保留足够数量的自由酚羟基。
30.在其中一个实施例中，在形成聚多巴胺的过程中，还加入了营养液，所述营养液在反应体系中的质量百分比为1％～10％。在水凝胶基层的制备过程中，加入一定量的营养液，更利于微生物的采集。
31.在其中一个实施例中，所述营养液包括：酵母浸出粉0.5g/l、蛋白胨0.3g/l、牛肉膏0.1g/l、葡萄糖0.2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、无水硫酸镁0.024g/l、丙酮酸钠0.2g/l、琼脂8.5g/l及l-半胱氨酸盐酸盐0.1g/l，所述营养液的ph为7～7.4。上述营养液属于皮肤样本采集特有的培养液，较其他营养液，更有利于皮肤低丰度微生物的采集，可增加采样的敏感度，利于针对真实皮肤菌群种类进行分析。
32.在其中一个实施例中，所述聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶还包括纳米纤维膜层，所述纳米纤维膜层层叠在所述水凝胶基层表面。纳米纤维膜层能够保证氧气供应的前提下，避免环境微生物的干扰。
33.在其中一个实施例中，将所述聚多巴胺与丙烯酰胺混合的过程中，还加入了保湿剂和抗脱水剂中的至少一种。在水凝胶中加入保湿剂和抗脱水剂，更利于微生物的采集，且不会影响到粘附强度。
34.在其中一个实施例中，所述保湿剂与所述丙烯酰胺的质量比为(0.1～1):100；及/或，
35.所述抗脱水剂与所述丙烯酰胺的质量比为(1～10):100。
36.在其中一个实施例中，将所述聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面至少2min。
37.在上述时间内，能够保证较高的采样量及较好的采样效果。
38.一种皮肤表面微生物的检测方法，包括如下步骤：
39.通过上述的采集方法对皮肤表面微生物进行采集；
40.将采样后的水凝胶剥离后进行微生物检测。
41.上述皮肤表面微生物的检测方法先通过聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶对皮肤表面微生物进行采集，然后进行检测，通过该方法能够高效地采集微生物，且采集量多，易于进行检测，使得检测效率高，误差小。
42.在其中一个实施例中，将采样后的水凝胶剥离后进行微生物检测的步骤包括：
43.将采样后的水凝胶剥离后进行dna提取，检测所采集的微生物的dna总量。
44.采用dna检测的方法更能够准确地反映皮肤表面微生物的情况。
附图说明
45.图1为一实施方式的皮肤表面微生物的采集方法的工艺流程图。
具体实施方式
46.为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容
的理解更加透彻全面。
47.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
48.针对传统的棉签刮取活检法采集皮肤微生物所存在的操作繁琐、误差大等问题，本发明提供一种用水凝胶采样贴片进行皮肤表面微生物采集的方法。
49.具体地，请参阅图1，一实施方式的水凝胶采样贴片的制备方法，包括如下步骤s110和步骤s120：
50.步骤s110：获得聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶。
51.聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶中聚丙烯酰胺通过共价交联形成网络结构，聚多巴胺通过酚羟基与聚丙烯酰胺中的氨基的相互作用链接在聚丙烯酰胺网络上，且聚多巴胺中的酚羟基还能够形成π-π堆积和氢键作用，上述多重作用使得聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶与皮肤表面具有较好的粘附强度，能够用于皮肤表面微生物采集。
52.具体地，在一些实施例中，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶包括水凝胶基层，水凝胶基层的制备步骤包括如下步骤s112和步骤s114：
53.步骤s112：将多巴胺在碱性溶液中或在粘土粉末存在下发生部分氧化聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺中含有酚羟基。
54.在一些实施例中，将多巴胺在碱性溶液中发生部分氧化的步骤包括：将多巴胺与ph为10～11的碱性溶液混合，搅拌20min～30min，使多巴胺发生部分氧化。通过在碱性环境中快速氧化，避免多巴胺的过度氧化，使所制备的水凝胶保持较多的自由酚羟基。
55.在另一些实施例中，将多巴胺在粘土粉末存在下发生部分氧化的步骤包括：将多巴胺与粘土粉末在溶液中混合搅拌5h～6h，再超声5min～10min，使多巴胺发生部分氧化。进一步地，将多巴胺与粘土粉末在溶液中混合搅拌的过程中，转速为800rpm～1000rpm。粘土粉末具有层状结构，将多巴胺与粘土粉末混合，使多巴胺插层到粘土粉末的层间，并在层间被氧化，形成聚多巴胺插层的粘土粉末。而粘土粉末的层间氧含量不足，使多巴胺进行有限的氧化，避免过度氧化，保留足够数量的自由酚羟基。
56.在一些实施例中，在形成多巴胺的过程中，还加入了营养液。营养液在反应体系中的质量百分浓度为1％～10％。实验证明，在水凝胶基层的制备过程中，加入一定量的营养液，更利于微生物的采集。
57.在一些实施例中，营养液包括：酵母浸出粉0.5g/l、蛋白胨0.3g/l、牛肉膏0.1g/l、葡萄糖0.2g/l、k2po4
·
3h2o 2.6g/l、无水硫酸镁0.024g/l、丙酮酸钠0.2g/l、琼脂8.5g/l、l-半胱氨酸盐酸盐0.1g/l，营养液的ph为7～7.4。在将营养液加入反应体系之前，可使用直径为0.22μm的纤维素微孔滤膜器进行过滤除菌。上述营养液属于皮肤样本采集特有的培养液，较其他营养液，更有利于皮肤低丰度微生物的采集，可增加采样的敏感度，利于针对真实皮肤菌群种类进行分析。
58.步骤s114：将聚多巴胺和丙烯酰胺混合，在引发剂和交联剂作用下使丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺。
59.将丙烯酰胺单体与聚多巴胺溶液混合，am在引发剂和交联剂的作用下发生自由基
聚合形成聚丙烯酰胺，能够阻止环境中的氧气与pda中的自由酚羟基接触，阻止pda进一步氧化，使水凝胶中保留了足够多的自由酚羟基，从而赋予水凝胶良好的粘附性。
60.在一些实施例中，引发剂为过氧化物，将聚多巴胺与丙烯酰胺混合，在引发剂和交联剂作用下使丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺的步骤包括：
61.将丙烯酰胺、引发剂、交联剂和催化剂依次加入到聚多巴胺中，并在冰浴下搅拌10min，使丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺。
62.在另一些实施例中，引发剂包括光引发剂和热引发剂，将聚多巴胺与丙烯酰胺混合，在引发剂和交联剂作用下使丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺的步骤包括：
63.将聚多巴胺、丙烯酰胺、光引发剂和交联剂混合，在光照条件下进行预聚合，再加入热引发剂和催化剂，在加热条件下继续聚合。
64.采用先光引发聚合，再热聚合的方式较单纯的过氧化物引发聚合的方式，更利于成胶，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。另外，光引发聚合反应更快速，聚合后可阻止环境中的氧气与pda中自由酚羟基接触，阻止pda的进一步氧化，能保留足够多的自由酚羟基，从而粘附性会提高。同时，采用紫外线照射也一定程度上对反应液进行杀菌，避免内部的营养物质被杂菌消耗。
65.在一些实施例中，将聚多巴胺、丙烯酰胺、光引发剂和交联剂混合的步骤在冰浴条件下进行。
66.在一些实施例中，预聚合的时间为60s～120s。在一个具体的示例中，预聚合的时间为60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s或这些取值中任意两者所组成的范围。
67.在一些实施例中，在加热条件下聚合的时间为30min～45mi；加热的温度为80℃～85℃。例如，在一个具体的示例中，在加热条件下聚合的时间为30min、32min、35min、38min、40min、42min、45min或这些取值中任意两者所组成的范围。加热的温度为80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃或这些取值中任意两者所组成的范围。
68.通过调整光引发聚合和热引发聚合的时间，调控所制备的水凝胶基层的粘附强度，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。
69.在一些实施例中，da与am的质量比为(1.3～1.6):100。在一个具体的示例中，da与am的质量比为1.3:100、1.35:100、1.4:100、1.45:100、1.5:100、1.55:100、1.6:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
70.在一些实施例中，粘土粉末与am的质量比为(12～15):100。在一个具体的示例中，粘土与am的质量比为12:100、12.5:100、13:100、13.5:100、14:100、14.5:100、15:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
71.在一些实施例中，光引发剂与am的质量比为(0.5～1):100。在一个具体的示例中，光引发剂与am的质量比为0.5:100、0.55:100、0.6:100、0.65:100、0.7:100、0.75:100、0.8:100、0.85:100、0.9:100、0.95:100、1:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
72.可以理解，光引发剂可以为本领域常用的引发am聚合的光引发剂，例如，光引发剂可以为irgacure-2959等。
73.在一些实施例中，交联剂选自n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mba)、n,n-亚甲基双丙烯酰胺(bis)及聚(丙二醇)二丙烯酸酯(ppg-da)的任意一种或几种。
74.在一些实施例中，交联剂与am的质量比为(1.2～1.5):100。在一个具体的示例中，
交联剂与am的质量比为1.2:100、1.25:100、1.3:100、1.35:100、1.4:100、1.45:100、1.5:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
75.在一些实施例中，热引发剂与am的质量比为(3.4～5):100。在一个具体的示例中，热引发剂与am的质量比为3.4:100、3.5:100、3.6:100、3.7:100、3.8:100、3.9:100、4:100、4.2:100、4.4:100、4.6:100、4.8:100、5:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
76.可以理解，热引发剂可以为本领域常用的引发am聚合的热引发剂。例如，热引发剂为过氧化物，更具体地，热引发剂可以为过硫酸铵。
77.在一些实施例中，催化剂与am的质量比为(0.1～0.5):100。在一个具体的示例中，催化剂与am的质量比为0.1:100、0.15:100、0.2:100、0.25:100、0.3:100、0.35:100、0.4:100、0.45:100、0.5:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
78.可以理解，催化剂可以为本领域常用的催化am聚合的催化剂。例如，催化剂可以为四甲基乙二胺(tmeda)。
79.通过优化各物质的配比，进一步提高所制备的水凝胶基层的粘附强度，且使得用水凝胶采样时，保证贴服感不粘腻，皮肤上无残留。
80.进一步地，在一些实施例中，将聚多巴胺与丙烯酰胺混合的过程中，还加入了保湿剂和抗脱水剂中的至少一种。
81.在其中一个实施例中，保湿剂与am的质量比为(0.1～1):100。例如，保湿剂与am的质量比为0.1:100、0.2:100、0.5:100、0.6:100、0.8:100、1:100或者这些取值中任意两者所组成的范围。在一个具体的示例中，保湿剂可以为透明质酸等。
82.在其中一个实施例中，抗脱水剂与am的质量比为(1～10):100。例如，抗脱水剂与am的质量比为1:100、2:100、3:100、4:100、5:100、5.5:100、6:100、6.5:100、7:100、7.5:100、8:100、8.5:100、9:100、9.5:100、10:100或这些取值中任意两者所组成的范围。
83.在其中一个实施例中，抗脱水剂选自羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素及甘油中的任意一种或几种。
84.水凝胶通常指由亲水的聚合物链通过氢键、共价键或范德华力等物理、化学的作用交联而形成的具有水溶胀性能的三维聚合物分子网络，其具有广泛的高可形变性、良好的粘附性与生物组织的结构相似性等，使其在人体可植入设备、伤口敷料、组织工程以及药物递送系统都有着广泛的应用。然而，并无相关技术将水凝胶用于皮肤微生物采集领域。发明人发现，利用多巴胺与丙烯酰胺所形成的水凝胶具有较好的粘附强度和优异的生物相容性，能够贴附在皮肤表面进行微生物采集，为皮肤表面微生物采集提供了一种新的思路。
85.进一步地，在一些实施例中，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶还包括纳米纤维膜层，纳米纤维膜层层叠在水凝胶基层表面。在一个具体的示例中，纳米纤维膜层通过静电纺丝制成。纳米纤维膜层的孔径≤0.22μm。
86.纳米纤维膜层能够保证氧气供应的前提下，避免环境微生物的干扰。可以理解，在实际使用过程中，由于水凝胶的贴附时间很短，所以环境影响很小，而且也可以通过在无菌检测环境中进行以避免环境微生物的影响。因此，纳米纤维膜层也可以省略。
87.步骤s120：将聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面，以采集皮肤表面微生物。
88.在一些实施例中，将聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面至少2min。在上
述时间内，能够保证较高的采样量及较好的采样效果。
89.在一些实施例中，将聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶贴附于皮肤表面的步骤之前，还包括对聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶进行消毒的步骤。例如，对聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶进行巴氏灭菌处理。
90.在一些实施例中，对皮肤表面并无特别限定，例如皮肤表面可以为面部、臂膀、头皮等。例如，在一些实施例中，皮肤表面为面部，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶可制备为适合贴附于面部的面膜式凝胶，便于全脸的采集。在另一些实施例中，聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶还可以根据人体工学制备成贴附于其他皮肤表面的采样凝胶，达到原位微生物采集的目的。
91.上述皮肤表面微生物的采集方法至少具有以下优点：
92.(1)通过上述皮肤表面微生物的采集方法所采集的微生物量较棉签拭子擦拭法采样更多，效率更高，且仅需贴附在皮肤表面即可，避免了棉签拭子多次擦拭所带来的误差。另外，上述水凝胶具有良好的生物相容性，对皮肤无刺激，其具备的顺应性和粘性促进了凝胶式贴片在人体皮肤上的保形附着，减少皮肤活动带来的影响。
93.(2)上述皮肤表面微生物的采集方法在样本采集结束后，水凝胶能轻易地从脆弱的皮肤组织上剥离，易去除，不粘腻，肤感好。
94.(3)在水凝胶中混入营养液，可为皮肤微生物提供持续的营养，利于皮肤低丰度微生物的采集，增加采样的敏感度。
95.本发明还提供一实施方式的皮肤表面微生物的检测方法，包括如下步骤：
96.对皮肤表面微生物进行采集；
97.将采样后的水凝胶剥离后进行微生物检测。
98.具体地，通过前述的皮肤表面微生物的采集方法对皮肤表面微生物进行采集，在此不再赘述。
99.在一些实施例中，将采样后的水凝胶剥离后进行dna提取，检测所采集的微生物的dna总量。
100.在一些实施例中，将采样后的水凝胶贴片放于-80℃或保存液中进行临时保存，保存后2h内进行dna提取。
101.在一些实施例中，将采样后的水凝胶立即使用dna提取试剂盒进行dna提取，并经基因测序快速检测皮肤微生物的种类及丰度。
102.上述皮肤表面微生物的检测方法先通过聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶对皮肤表面微生物进行采集，然后进行检测，通过该方法能够高效地采集微生物，且采集量多，易于进行检测，使得检测效率高，误差小。传统棉签采集法在检测过程中，为了保证有足够的dna量进行16s rrna基因扩增子分析，常需要在每管保存5-6个拭子(宏基因组/humichip项目应增加至6-10个)，增加了操作次数。
103.为了使本发明的目的以及优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明的水凝胶采样贴片及其效果做进一步详细的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不得用以限定本发明以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的
方法实现。
104.实施例1
105.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
106.(1)用去离子水溶解da粉末制备da溶液，将粘土粉末(clay)分散到da溶液中以制成粘土/da悬浮液，将悬浮液剧烈搅拌(转速为900rpm)5小时，使多巴胺插入粘土粉末的层间并氧化形成聚多巴胺pda，之后将溶液超声5min，得到pda-clay悬浮液。其中，去离子水中加入有质量百分浓度为3％的营养液，营养液包括：酵母浸出粉0.5g/l、蛋白胨0.3g/l、牛肉膏0.1g/l、葡萄糖0.2g/l、k2po4
·
3h2o 2.6g/l、无水硫酸镁0.024g/l、丙酮酸钠0.2g/l、琼脂8.5g/l及l-半胱氨酸盐酸盐0.1g/l，营养液ph＝7.2
±
0.2，营养液在加入去离子水之前使用直径为0.22μm的纤维素微孔滤膜器进行过滤除菌。
107.(2)在搅拌下的冰浴条件中将丙烯酰胺、光引发剂irgacure-2959和交联剂n,n-亚甲基双丙烯酰胺(bis)加入到步骤(1)所制备的pda-clay悬浮液中，在紫外光照下引发预聚合，预聚合时间为60s，之后继续在冰浴条件下加入过硫酸铵(aps)和四甲基乙二胺(tmeda)，在80℃下加热45min，使am继续聚合，得到水凝胶贴片。其中，da/am＝1.3wt.％，clay/am＝12wt.％，光引发剂/am＝0.5wt.％，交联剂/am＝1.2wt.％，aps/am＝3.4wt.％，tmeda/am＝0.1wt.％。
108.本实施例还提供一种皮肤微生物的采集方法，包括如下步骤：
109.将上述所制备的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶调整为面积为4cm2(2cm
×
2cm)，然后贴附于人体面部2min，采集完成后收集于保存液中备用。
110.实施例2
111.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，步骤(1)的去离子水中未加入营养液。
112.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
113.实施例3
114.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，营养液不同，本实施例所用的营养液包括：蛋白胨0.3g/l、牛肉膏0.1g/l、葡萄糖0.2g/l、k2po4
·
3h2o 2.6g/l、无水硫酸镁0.024g/l、琼脂8.5g/l及l-半胱氨酸盐酸盐0.1g/l。
115.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
116.实施例4
117.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，营养液不同，本实施例所用的营养液r2a培养基(英国oxoid公司)。
118.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
119.实施例5
120.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
121.(1)将da粉末溶解在去离子水中形成da水溶液，然后将粘土加入到da溶液中，搅拌形成clay/da悬浮液，将该悬浮液剧烈搅拌5h(转速为900rpm)，使得da插入粘土粉末的层间并氧化形成pda，之后将溶液超声5min，得到pda-clay悬浮液。
122.(2)将丙烯酰胺(am)、过硫酸铵(aps)、n,n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)和四甲基乙二胺(tmeda)依次加入到步骤(1)得到的pda-clay悬浮液中，并在冰浴下搅拌混合均匀。搅拌10min后，除去冰浴和搅拌器，am单体聚合形成pda-clay-pam水凝胶。其中，da/am＝0.6wt.％，clay/am＝10wt.％、aps/am＝10wt.％，bis/am＝1.2wt.％，余量为水。
123.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
124.实施例6
125.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，在步骤(2)中，还加入了保湿剂透明质酸和抗脱水剂羧甲基纤维素，保湿剂与am的质量比为0.3wt.％，抗脱水剂am的质量比为1wt.％。
126.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
127.实施例7
128.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，步骤(2)中的配比不同，在本实施例中，da/am＝1.5wt.％，clay/am＝13wt.％，光引发剂/am＝0.5wt.％，交联剂/am＝1.5wt.％，aps/am＝4.0wt.％，tmeda/am＝0.5wt.％。
129.本实施例的皮肤微生物的采集方法与实施例1相同。
130.实施例8
131.本实施例提供一种聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，与实施例1的聚多巴胺-聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法相似，区别在于，步骤(1)不同，本实施例的步骤(1)具体为：将多巴胺溶解在ph为11的氢氧化钠水溶液中，然后搅拌20min，使多巴胺发生部分氧化形成聚多巴胺。
132.对比例1
133.对比例1提供一种皮肤表面微生物的采集方法，具体包括如下步骤：
134.无菌植物绒棉签采样：使用湿润的一次性无菌采样拭子，施加稳定的压力，以及摩擦的一致性(在采样点2min内来回约100次，50次一根拭子，两侧脸颊各两次，4cm2)，采集区域为两侧脸颊，采集完后做好标记，样本收集于保存液中。
135.以下为具体测试部分：
136.1、采集的dna总量测试
137.(1)共纳入健康女性10例，年龄为23
±
2岁，分别使用实施例和对比例的方法同时采集同一受试者的左右两侧脸颊。按照革兰氏阳性菌的基因组提取方法，样本在采集后的2h内使用通用世纪dna提取试剂盒提取dna，使用qubit仪器检测dna浓度，分别使用0ng/μl以及10ng/μl确定标准曲线后使用仪器检测，具体细节流程如下：
138.(1)标定：按照10μl:190μl比例加入标准液(dna浓度为0、10μg/μl)与qubit工作液，使总体积为200μl，混匀后放入样品槽中，读取dna浓度，制作标准曲线。
139.(2)检测：加入2～10μl dna溶液，再加入qubit工作液补齐至200μl，检测浓度。数据如下表1所示：
140.表1
[0141][0142][0143]
由表1中可以看出，通过实施例1的采集方法的采集量最大，通过实施例2的采集方法的采集量稍低于实施例1，说明在水凝胶中添加了一定量的营养液更利于微生物的采集，采用实施例1、实施例2、实施例6和实施例7的采集方法的采集量均优于实施例5，说明用优化后的水凝胶制备方法所制备的水凝胶进行微生物采集，采集效果好。由实施例1和实施例6可以看出，在水凝胶中添加一定量的保湿剂和抗脱水剂会更有利于微生物的采集。且各实施例的采集效果均明显优于传统的棉签采样法。对比例1中共收集10个样本，其中3个棉签采样的样本未采集到足够的dna量，无法进行16s rrna基因扩增子分析的要求。
[0144]
另外，采用实施例1～实施例4的方法对同一受试者进行微生物采集，并采用上述方法进行检测，得到如下表2所示的实验数据：
[0145]
表2
[0146] 采集的dna总量(μg)实施例1207实施例2167实施例3184实施例4174
[0147]
由上述表2中可以看出，在水凝胶中加入实施例1中所用的营养液并进行微生物采集，所采集的微生物量更大。实施例1所用的营养液为评估皮肤样本采集的最适营养液，属于皮肤样本采集特有的培养液，有利于皮肤低丰度微生物的采集，可增加采样的敏感度，利于针对真实皮肤菌群种类进行分析。
[0148]
2、皮肤组织粘附强度试验
[0149]
选择猪皮代表生物体组织进行粘附性测试，通过拉伸-粘附试验测试不同实施例所制备的水凝胶在新鲜猪皮作为生物组织的代表的表面粘附强度。具体为：将面积为20mm
×
20mm的水凝胶样品粘在两块新鲜猪皮之间，再通过万能试验机以5mm/min的加载速率将样品拉伸至破坏，通过粘附-拉伸-粘附的循环试验评价水凝胶的粘附强度，粘附强度(σ)由
最大拉伸力(f)和水凝胶的涂覆面积(s)通过σ＝f/s公式得到。具体数据如下表3所示：
[0150]
表3
[0151]
组别粘附强度(kpa)实施例133.9实施例233.4实施例632.8实施例527.9
[0152]
从表3中可以看出，实施例1、实施例2和实施例6所制备的水凝胶的粘附强度接近，优于实施例5，说明在水凝胶中加入营养液、保湿剂及抗脱水剂并不会影响水凝胶的粘附性能，且通过进一步优化水凝胶的制备过程能够提高水凝胶的粘附强度。
[0153]
3、水凝胶贴片的皮肤刺激性试验
[0154]
采用人体皮肤刺激试验，由20名志愿者组成，各分为两组，其中男女比例一致，将实施例1和实施例5所制备的水凝胶分别贴附于志愿者的上臂外侧，贴附面积为2cm
×
2cm，水凝胶贴片接触皮肤的时间从15min、30min、1h、2h、4h、24h、36h、48h、72h时均没有产生刺激性反应，在除去水凝胶贴片后24h、48h和72h均没有产生刺激性反应，且经测试，实施例1的10名志愿者中水凝胶贴片无残留，不粘腻，使用肤感好，无撕裂感，实施例5中有9名志愿者在水凝胶贴片剥离后，皮肤上均带有些许的残留液，使用肤感差。
[0155]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0156]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。