他克莫司软膏透皮试验检测方法与流程

1.本发明属于药品检测技术领域，具体涉及一种检测他克莫司软膏透皮吸收的方法。


背景技术：

2.他克莫司(tacrolimus)为强效大环内酯类免疫抑制药，可用于治疗肝脏、心脏、肾脏、肺移植等初期的免疫抑制及控制移植物的排异反应，并已试用于治疗少数患有难治性自身免疫病或免疫系统介导疾病的患者。他克莫司软膏是全球首个获批的非皮质类固醇类外用免疫调节剂，适用于因潜在危险而不宜使用激素治疗、或对激素治疗疗效欠佳、无法耐受的中至重度特异性皮炎的患者，可避免其口服制剂全身吸收副作用大，局部作用效率低，个体差异较大的缺陷。
3.经皮渗透给药制剂的体外透皮吸收研究，多采用franz扩散池法，用离体小型乳猪的皮肤模拟人体皮肤，通过检测接收介质中药物的透过量，皮内药物滞留量与皮表面的残留药物量，考察药物的分布情况，全面评价供试制剂与参比制剂透皮吸收程度的差异。接受介质应具有接受透皮药物的能力，并尽可能符合类似体内的漏槽条件，但他克莫司在水中不溶，常用的接受液生理盐水和等渗的磷酸盐缓冲液等达不到溶解要求。添加常规的表面活性剂通常对他克莫司检测带来干扰，有机溶剂会影响皮肤的通透性，因此筛选出既可达到漏槽条件溶解经皮透过药物，又能对微量药物的定量分析无干扰的接受介质非常关键。
4.市售他克莫司软膏浓度仅0.1％，经皮渗透后皮肤各部分的药物含量很小，且软膏中含有大量的油脂性的半固体基质，动物皮肤中含有蛋白质和脂质等大量的生物大分子，药物经皮渗透后，需要对皮表、皮内及透过药物进行提取分离，排除干扰，常规的液相方法很难准确检测，需要建立一种ng级定量检测方法。而皮内滞留药物的样品处理，文献报道透皮试验皮内滞留量的样品处理方法一般是将皮肤剪碎，置于研钵中研碎(不同人研磨力度程度可能不同)，此方法存在操作繁琐，破碎不完全，回收率低，重复性差等缺点，需要建立一种人为干扰小，药物提取完全的皮肤处理方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的问题在于提供一种他克莫司软膏透皮渗透试验的接收介质。
6.本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种他克莫司软膏透皮试验中皮面残留量、皮内滞留量及皮肤透过量检测时，采用的样品前处理方法。
7.本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种能够快速检测透皮试验中他克莫司的皮面残留量、皮内滞留量、皮肤透过量的方法。
8.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
9.本发明提供一种他克莫司软膏透皮试验接收介质。发现乙醇水溶液作为透皮试验接收介质能很好克服检测干扰，经严格的漏槽条件计算，优选为20-30％的乙醇溶液，更优选为25％乙醇溶液。
10.还提供一种检测透皮试验中他克莫司的皮面残留量、皮内滞留量、皮肤透过量的样品前处理方法：取他克莫司软膏适量均匀涂布于皮肤上，在接收池中加入接收介质，使皮肤与接收介质的液面接触，使药物释放到接收介质，得接收液，然后分别采取下列步骤：
11.(1)皮面残留样品处理：取下渗透试验的整块皮肤，刮去表面残留药膏并置洁净离心管中，用溶剂冲洗皮肤表面，加热熔融，超声，离心，取上清液加入溶剂定容，过滤，加入内标溶液混匀，得皮面残留量待测溶液。
12.(2)皮内滞留样品处理：将冲洗的皮表用滤纸吸干，将皮肤剪碎至西林瓶中，加入适量溶剂，用乳化均质机打碎，使皮肤全部呈松散絮状，将该混合溶液转移至离心管中，超声，离心，取上清液加溶剂定容，过滤，加入内标溶液混匀，得皮内滞留量待测溶液。
13.(3)皮肤透过样品处理：接收液经滤膜过滤，加入内标溶液，混匀，得皮肤透过量待测溶液。
14.上述(1)、(2)步骤中所述溶剂为乙腈。
15.优选的，上述(1)步骤中药膏与乙腈的用量为1：60-1：100(m(g)/v(ml))。m为重量，v为体积。
16.更优选的，上述步骤(1)中药膏与乙腈的用量为1：80(m(g)/v(ml))。
17.上述步骤(2)中单位扩散面积(cm2)的溶剂用量为4ml-8ml。
18.优选的，上述步骤(2)中单位扩散面积(cm2)的溶剂用量为5ml-7ml。
19.更优选的，上述步骤(2)中单位扩散面积(cm2)的溶剂用量为6ml。
20.上述步骤(2)中皮内药物的提取采用高剪切分散乳化机的方式进行，其转速为10000-30000rpm，优选为15000-25000rpm。
21.上述(1)、(2)、(3)步骤中所述内标物质为他克莫司的类似物(包括其同系物、脱水物等)，环孢素a及其类似物等，优选为他克莫司的类似物，进一步优选为fk520。
22.还提供一种液质联用快速检测低浓度他克莫司的方法，对上述前处理方法所得到的皮面残留量、皮内滞留量、皮肤透过量待测溶液，采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪对他克莫司的皮面残留量、皮内滞留量、皮肤透过量进行检测。
23.高效液相色谱的检测条件为：
24.①
柱温为40℃-80℃，优选为60℃。
25.②
梯度洗脱，有机溶剂为乙腈或甲醇，优选为乙腈。有机溶剂所占比例为25％-95％，优选为50％-75％。流动相中添加或不添加挥发性酸和/或挥发性盐。
26.优选高效液相色谱的检测条件为:
27.色谱柱:waters acquity uplc beh c
18
柱(2.1mm
×
50mm，1.7μm)；
28.柱温:60℃；
29.检测器：waters公司xevo tq ms质谱检测器；
30.流动相a：10mm乙酸铵水溶液，流动相b：乙腈；
31.流速:0.25-0.5ml/min；
32.进样量:3-7μl；
33.洗脱方式:梯度洗脱；
34.所述三重四级杆质谱的检测条件为:
35.质量分析器:三重四级杆；
36.离子源:esi

；
37.毛细管电压:3.0kv；
38.锥孔电压:30v；
39.离子源温度:150℃；
40.脱溶剂温度:350℃；
41.电喷雾接口干燥气(n2)流速：500-700l
·
hr-1
；
42.所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为:
43.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)05050740607.05406095959.15050115050
44.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
45.(1)本发明筛选出25％的乙醇溶液作为透皮试验接收介质，保证了体外透皮过程更好的与药物实际皮肤渗透情况接近。
46.(2)本发明中，皮面残留样品通过加热熔融，皮内滞留样品处理方法中采用了乳化均质机，通过溶媒用量和破碎时间等参数，使破碎完全彻底，均显著提高了试验的准确性、平行性和可操作性。
47.(3)本发明采用超高效液相色谱质谱联用仪，优化检测条件，检测透皮试验中皮上、皮内、透皮的样品中含有的他克莫司，具有干扰性小、检出限低、灵敏度高、重现性好的特点，实现了对他克莫司软膏质量的精细控制。
附图说明
48.图1为他克莫司软膏透皮试验中皮面样品的灵敏度液质色谱图
49.图2为他克莫司软膏透皮试验中皮内样品的灵敏度液质色谱图
50.图3为他克莫司软膏透皮试验中皮肤透过样品的灵敏度液质色谱图
51.图4为他克莫司类似物(fk520)专属性液质色谱图(空白)
52.图5为他克莫司类似物(fk520)专属性液质色谱图
53.图6为他克莫司专属性液质色谱图(空白)
54.图7为他克莫司专属性液质色谱图
具体实施方式
55.下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
56.仪器与试剂：
57.uplc-xevo tq ms型超高效液相色谱一串联质谱仪(美国waters公司；
58.磁力搅拌器，恒温水浴震荡器；
59.waters acquity uplc beh c18柱(2.1mm
×
50mm，1.7μm)色谱柱，美国waters公
司；
60.检测器：waters公司xevo tq ms质谱检测器；
61.他克莫司对照品，为本公司标定的对照品，纯度：96.7％；内标物质：子囊霉素(fk520)；
62.样品：他克莫司软膏，浓度0.1％(自制)；
63.参比试剂：市售他克莫司软膏，浓度0.1％；
64.试剂：乙腈(色谱纯，美国fisher公司)；乙酸铵(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；屈臣氏水。
65.实施例1他克莫司软膏透皮试验中他克莫司的皮面残留量、皮内滞留量、皮肤透过量的样品的前处理
66.透皮扩散装置：采用改进的franz立体扩散装置，小型乳猪皮为扩散模型；接收介质采用25％乙醇水溶液；水浴温度：34
±
1℃，有效扩散面积为：2.83cm2；接受室体积为8.7ml；搅拌速度约为600r/min。
67.试验方法
68.1)皮肤透过液样品制备：取制备好的巴马香猪的腹部离体皮肤置于franz立式扩散池的供给室与接受室之间，用皮筋固定好，角质层面朝上。取0.1％他克莫司软膏0.1g均匀涂布于皮肤上。在接收池中加入25％的乙醇溶液(接收介质)，使皮肤恰好与液面接触，排尽所有气泡。用磁力搅拌器不断搅拌接收液，使药物自然释放。取接收液，经0.45μm微孔滤膜过滤，加入内标溶液，混匀。
69.2)皮面残留量样品制备：取渗透试验的整块皮肤，刮去表面残留药膏并置10ml洁净离心管中，用8ml乙腈冲洗皮肤表面，将冲洗液全部转移至上述离心管中，在60℃水浴中加热至熔融状态，取出，置于超声波中超声30min，离心10min，取上清液，加乙腈定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤。精密移取该溶液加入内标溶液，混匀。
70.3)皮内滞留量样品制备：将冲洗的猪皮皮表用滤纸吸干，将皮肤剪碎至西林瓶中，加入6ml乙腈，用乳化均质机(25000rpm)打碎皮肤，使皮肤全部呈松散絮状，将该混合溶液全部转移至10ml离心管中，置于超声波中超声30min，离心10min，精密移取上清液至10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，经0.45μm微孔滤膜过滤。取该溶液加入内标溶液，混匀。
71.实施例2液相条件的优化
72.仪器选用超高效液相色谱仪(耐压12000psi)，使用相应规格的色谱柱(c
18
柱(2.1mm
×
50mm，1.7μm))，同时对流动相中，盐种类及盐浓度、柱温、流速、进样量、梯度洗脱进行试验，使每一次试验有较短的保留时间，被检测成分及内标物质有对称、尽量窄的峰型且两者有较好的分离度。
73.实施例3质谱条件的优化
74.采用三重四级杆质谱在esi( )模式下，分别对他克莫司、fk520对照品溶液进行一级质谱全扫描分析，以得到该两种化合物的分子离子，以sir监测模式进行检测，在此基础上对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度、电喷雾接口干燥气(n2)流速进行优化，使选定分子离子的特征离子的丰度达到最佳。
75.实施例4标准曲线和线性范围及最低检出限和定量限
76.(1)透皮试验中皮面残留量标准曲线和线性范围
77.①
取适量他克莫司对照品，用皮表空白溶液溶解并稀释至3.0μg/ml，再依次稀释成0.2，0.5，0.8，1.0，1.5μg/ml的供试品溶液各一份，精密量取一定量上述供试品溶液，分别向其中加入相同量的内标溶液，混匀，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线；
78.皮表空白溶液的制备：用一定量空白软膏均匀涂布于小型乳猪皮上，其他操作同实施例1.2)中皮面残留量样品制备方法(不加内标)，即得。
79.②
线性范围：以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线，其相关系数(r2)大于0.99，表明皮面残留量测定在0.2～1.5μg/ml范围内具有良好的线性关系。
80.③
最低检出限和定量限：根据3倍和10倍信噪比对应的空白样品添加质量浓度作为方法的检出限(lod)和定量下限(loq)，图谱见图1，得到本方法的lod为0.125ng(相当主成分的3.1％)，loq为0.25ng(相当主成分的6.3％)。
81.(2)透皮试验中皮内滞留量标准曲线和线性范围
82.①
取适量他克莫司对照品，用溶样介质溶解并稀释至5.0μg/ml，再依次稀释成0.0550，0.1375，0.2750，0.5500，1.1000μg/ml的供试品溶液各一份，精密量取一定量上述供试品溶液，分别向其中加入相同量的内标溶液，混匀，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线；
83.溶样介质(皮内空白提取液)的制备：用一定量空白软膏均匀涂布于小型乳猪皮上，其他操作同实施例1.3)中皮内滞留量样品制备方法(不加内标)，即得。
84.②
线性范围：以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线，其相关系数(r2)大于0.99，表明皮面残留量测定在0.055～1.100μg/ml范围内具有良好的线性关系。
85.③
最低检出限和定量限：根据3倍和10倍信噪比对应的空白样品添加质量浓度作为方法的检出限(lod)和定量下限(loq)，图谱见图2，得到本方法的lod为0.125ng(相当主成分的4.6％)，loq为0.25ng(相当主成分的9.1％)。
86.(3)透皮试验中皮肤透过量标准曲线和线性范围
87.①
取适量他克莫司对照品，用25％乙醇溶液溶解并稀释至5.0μg/ml，再依次稀释成0.5，1.0，1.2，1.8，2.2，2.8，3.6μg/ml的供试品溶液各一份，精密量取一定量上述供试品溶液，分别向其中加入相同量的内标溶液，混匀，分别注入超高效液相色谱-质谱联用仪，以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线。
88.②
线性范围：以他克莫司与内标峰面积比为纵坐标，他克莫司与内标浓度比为横坐标，进行线性回归得到其标准曲线，其相关系数(r2)大于0.99，表明皮肤透过量测定在0.5～3.6μg/ml范围内具有良好的线性关系。
89.③
最低检出限和定量限：根据3倍和10倍信噪比对应的空白样品添加质量浓度作为方法的检出限(lod)和定量下限(loq)，图谱见图3，得到本方法的lod为0.125ng(相当主成分的1.4％)，loq为0.25ng(相当主成分的2.8％)。
90.实施例5专属性
91.取空白软膏，进行透皮试验，按实施例1方法制备皮表空白溶液、皮内空白提取液和空白接收液，精密量取皮表空白溶液、皮内空白提取液、空白接收液、内标(fk520)溶液和对照品(他克莫司)溶液各5μl注入液质联用仪，记录色谱图，fk520专属性见图4(空白)和图5，他克莫司专属性见图6(空白)和图7。结果表明，皮肤中各内源性物质不干扰他克莫司与内标fk520的测定，内标fk520和他克莫司的测定互不干扰。
92.实施例6供试制剂和参比制剂的透皮试验对比
93.供试制剂与参比制剂分别为自制他克莫司软膏与市售他克莫司软膏，浓度均为0.1％。
94.试验装置和方法基本同实施例1。
95.试验方法
96.1)皮肤透过液样品制备：方法同实施例1中1)皮肤透过液样品制备。分别取供试制剂或参比制剂0.1g均匀涂布于皮肤上。其中分别于涂布后的1，2，3，4，6，9，12，24h各点取接收液0.3ml，取样后即向接收池补充同温同体积的接收介质。
97.2)皮面残留量样品制备：方法同实施例1中2)皮面残留量样品制备。
98.3)皮内滞留量样品制备：方法同实施例1中3)皮内滞留量样品制备。
99.实验结果
100.结果见表1至3，供试制剂与参比制剂的平均累积透过率方差统计分析p值大于0.9，各时间取样点的累积透过率无显著性差异。自制软膏与参比制剂在皮肤透过量及皮内、皮表的分布情况无显著性差异。
101.表1供试制剂与参比制剂对离体猪皮的累积透过率(x
±
s，n＝12)
[0102][0103]
表2平均累积透过率的比较(方差分析表)
[0104][0105]
表3供试制剂和参比制剂皮内滞留率,皮表残留率，24小时累积释放率及物料平衡对比
[0106][0107]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。