一种HPV病毒检测试剂盒的制作方法

一种hpv病毒检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，更具体的涉及一种hpv病毒检测试剂盒。


背景技术：

2.宫颈癌是全球范围内女性第二大常见的恶性肿瘤，每年约有52.8万新发病例和27.5万死亡病例，其中，87％的新发病例发生在发展中国家。中国每年约有9.9万新发病例和3.1万死亡病例。大量研究表明，人乳头瘤病毒(hu-manpapillomavirus，hpv)的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，高危型hpv感染是引起宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia，cin)和子宫颈癌的主要因素。目前已发现200多种hpv基因型别，其中，约54种hpv基因型别可感染生殖道黏膜，并且还有更多的hpv亚型正在鉴定中。新的hpv基因型的判定标准是指该hpv基因型别在e6、e7或者l1区的核苷酸序列与其他任意已确定型别的hpv有超过10％的不同。根据其致病力及致病危险性的大小可将其分为高危型hpv和低危型hpv。高危型hpv感染可引起宫颈、阴道、肛门、阴茎和口咽部位的上皮内瘤变或癌变，其hpv型别主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。低危型hpv感染仅可引起生殖器疣等良性病变，其hpv型别主要包括6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81。与高危型hpv相比，低危型hpv的e6和e7蛋白干扰p53基因和prb基因的作用相对较弱。
3.hpv检测技术广泛应用于宫颈癌的筛查、流行病学调查及宫颈癌疫苗有效性的评价中。目前，国内外针对hpv的检测方法层出不穷，hpv不同检测方法的优劣主要通过两个方面进行评价：临床使用价值(即临床灵敏度)与检测极限(即分析灵敏度)。临床灵敏度(又称功能灵敏度)是指在hpv检测技术中试验结果为阳性的患者所占的比例以及hpv对cin2级及以上2的检出能力；分析灵敏度(又称检测限量)是指可检测的最低分析物浓度。良好的hpv检测技术需要满足较高的临床灵敏度及较低的分析灵敏度。目前，全世界约完成150个不同的hpv检测实验，尚有一部分仍在进行中。已采用的检测方法主要包括dna检测、rna检测和与hpv相关的标志物检测以及抗原检测。
4.aptima hpv于2012年获批，其是第一个也是唯一一个经过fda认证的用于hpvmrna检测技术。该技术基于转录介导的扩增(transcription—mediatedamplification，tma)技术检测hpv e6/e7mrna：即在上游引物5’端添加t7启动子，在反应体系中引入rna聚合酶，目的mrna经过逆转录成cdna后，以转录的方式实现目的分子扩增。该技术目的在于检测hpv致癌基因e6/e7的mrna，较之于hpv—dna检测而言，可以有效避免hpv一过性感染对检测结果的干扰，但aptimahpv检测费用也较昂贵。
5.hpv抗体血清学检测在hpv疫苗学和流行病学研究中具有重要意义。目前针对hpv的快速免疫检测试剂盒的研究还不够多，有待于进一步的研究，特别是能同时针对多种hpv亚型的检测试剂还不够多。因此，开发针对hpv多亚型检测的试剂盒变得尤为迫切。


技术实现要素：

6.本发明克服现有技术的缺陷，筛选并获得了hpv6和hpv11高免疫原性抗原肽，其序
列如seq id no：1所示。
7.本发明另外一方面，以hpv6和hpv11高免疫原性抗原肽作为免疫原制备并获得了相应的单克隆抗体。
8.一方面，本发明提供了特异性针对hpv6/11的单克隆抗体，其特征在于其轻重链可变区序列分别如seq id no：3和4所示。
9.本发明抗体，其片段或vh链条vl抗体的链包括具有序列同一性的那些抗体，片段或vh链条vl本文所述抗体的链。例如，本发明包括与本文所述例证序列(例如，seq id no:3-4)具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或99.8％序列同一性的序列。因此，抗体的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区可以不同于本文提出的序列，并且仍然在本文公开的实施方案的范围内。例如，一个或多个互补决定区(cdr)可以不同于本文所述抗体氨基酸序列的重链和/或轻链可变区。或者，一个或多个互补决定区(cdr)可以与本文所述的序列(例如，seq id nos:3-4)相同，但是重链或轻链可变区的其它部分可以不同。本文所述的示例性序列(例如，seq id nos:3-4)的这种序列变化将被认为是本文所公开的本发明范围内的实施方案。
10.本发明的抗体的非限制性例子包括，例如，完整的免疫球蛋白及其本领域已知的保留抗原结合亲和力的变体和片段。抗体片段的例子包括但不限于fv，fab，fab’，fab
’‑
sh，f(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包括通过修饰全抗体或使用重组dna方法重新合成的抗原结合片段。
11.北发明的抗体包括保守变体：“保守的”氨基酸取代是那些基本上不影响或降低蛋白质的功能，例如蛋白质与靶蛋白质相互作用的能力的取代。例如，与参比抗体序列相比，ftc特异性抗体包括多达1，2，3，4，5，6，7，8，9或多达10个保守取代，并保留了对ftc的特异性结合活性。术语保守变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸。
12.另外，普通技术人员将认识到，单独的取代，改变的删除或添加，在编码序列中添加或删除单个氨基酸或小部分氨基酸(例如少于5％，在一些实施方案中少于1％)是保守变异，其中该变异导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。
13.提供功能相似氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员公知的。以下六个基团是被认为是彼此保守取代的氨基酸的例子：
14.1)丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；
15.2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；
16.3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；
17.4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；
18.5)异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，蛋氨酸(m)，缬氨酸(v)；
19.6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)。
20.本发明的抗体还偶联有可检测标记：可检测分子(也称为标记)，其直接或间接缀合到抗体，以促进检测。例如，可检测标记能够通过elisa，分光光度法，流式细胞术，显微镜或诊断成像技术(例如ct扫描，mri，超声，纤维光学检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记物的具体，非限制性例子包括亲和素，生物素，荧光团，化学发光剂，酶键，放射性同位素和重金属或化合物(例如用于mri检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。在一个实施例中，“标记抗体”是指在抗体中掺入另一个分子。例如，标签是可检测的标记，例如掺入放射性标记
的氨基酸或生物素基部分与多肽的连接，所述生物素基部分可通过标记的亲和素(例如，含有荧光标记的链霉亲和素或可通过光学或比色法检测的酶活性)检测。标记多肽的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。多肽标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如35s或131i)，荧光标记(如异硫氰酸荧光素(fitc)，罗丹明，镧系磷光体)，酶标记物，化学发光标记物，生物素基，由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列，二级抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标记)，或磁性试剂，例如钆螯合物。在一些实施例中，标签由不同长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间阻碍。例如，sambrook等人讨论了使用可检测标记和指导选择适合于各种目的的可检测标记的方法。
21.合适的酶标记的例子包括苹果酸氢化酶，葡萄球菌核酸酶，5-类固醇异构酶，酵母醇脱氢酶，甘油磷酸脱氢酶，三糖磷酸异构酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，乙酰胆碱酯酶等。合适的放射性同位素标记的例子包括：3h，125i，131i，32p，35s，14c，51cr，57到，58co，59fe，75硒，152eu，90y，67铜，217ci，211at，212pb，47sc，109合适的荧光标记的例子包括a152eu标签，荧光素标记，异硫氰酸酯标签，罗丹明标签，藻红蛋白标签，藻蓝蛋白标签，别藻蓝蛋白标记物，邻苯二甲醛标记物，荧光胺标记物等化学发光底物的例子包括管腔底物，异管腔底物，芳族吖啶鎓酯底物，咪唑底物，吖啶鎓盐底物，草酸酯标记物，荧光素底物，荧光素酶标记物，水蛭素标记物等。
22.抗体，其片段以及抗体的vh和vl链可以使用包括将编码序列的全部或部分表达到宿主细胞中的遗传技术产生。抗体可使用包括杂交瘤技术，重组和噬菌体展示技术的技术或其组合来产生(参见美国专利4,902,614，4,543,439和4,411,993；也参见单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析中的新维度，plenum press，kennett，mckearn和bechtol(编著)，1985，和harlow等，抗体：实验室手册，冷泉港实验室压力机，第二版。单克隆抗体也可通过直接从动物(包括哺乳动物如兔，灵长类或人类受试者)克隆免疫球蛋白序列而获得。
23.在另外的实施方案中，检测样品中的hpv的方法包括通过结合捕获抗体使样品与抗体接触，然后用检测抗体检测捕获抗体。检测抗体可以直接用酶，荧光团等标记，因此可以直接检测。本测定中的检测抗体可以使用本领域已知的任何标记物进行标记。
24.本发明还提供了用于实施本发明的检测方法的试剂盒。该试剂盒包括含有由至少一种本发明杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的容器和使用该单克隆抗体以结合hpv形成免疫复合物的说明，使得免疫复合物的存在或不存在复合物与样品中hpv的存在或不存在相关联或指示样品中hpv的存在或不存在。所述试剂盒可包括含有本文所述抗体的第一容器装置。该试剂盒还可以包括具有实施本发明所需或方便的溶液的其它容器装置。容器装置可以由玻璃制成，塑料，所述试剂盒还可以包含书写信息，例如用于实施本发明的过程或分析信息，例如包含在第一容器装置中的试剂的量。容器装置可以与书写信息一起在另一个容器装置(例如，盒子，袋子等)中。
25.本发明进一步的，提供hpv单克隆抗体在制备检测hpv6/11亚型的试剂盒中的用途。
26.进一步的，本发明的诊断试剂盒包含通常用于免疫学测试的仪器和试剂。当hpv抗体是基于elisa方法的诊断试剂盒的组分时，这样的试剂盒另外包含：
27.用本发明的mabs(夹心型elisa)或hpv抗原(belisa，celisa)包被的板，其中非特
异性结合位点用适当的阻断物质完全饱和，用于洗板，稀释样品和试剂的缓冲液，用于酶的底物，以及用于酶反应抑制的溶液。
28.进一步的，所述试剂盒采用本领域常规的制备方法制备获得。具体的可以是如下方法制备而成：抗hpv单克隆抗体与金标偶联；检测抗原释放垫的制备；乳胶结合垫的制备；样本处理液的制备；抗hpv单克隆抗体的稀释与固定；单纯疱疹病毒检测试剂盒的制作；所述抗hpv单克隆抗体的稀释与固定的步骤具体为：用稀释液将亲和素稀释至1-5mg/ml，单克隆抗体稀释至1-5mg/ml；在温湿度分别为30-40℃、40-50％的条件下，使用自动化喷点机将抗hpv单克隆抗体溶液喷到硝酸纤维素膜上作为检测线；将亲和素溶液喷到硝酸纤维素膜上作为质控线；所述稀释液中包括50nm的pbs缓冲液、2.5％质量百分比浓度的蔗糖和80nm的edta。
29.有益效果
30.本发明通过筛选优化获得了hpv6/11特异性的免疫抗原肽，将所述抗原肽免疫小鼠制备获得了特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的结合hpv6/11，并且还具有抑制hpv6/11感染正常细胞的效果，将所述单抗制备成为试剂盒可以有效的用于hpv的检测，具有较好的应用前景。
附图说明
31.图1抗原反应特异性鉴定结果图
32.图2单抗对hpv感染hacat细胞的影响结果图
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1特异性针对hpv6和hpv11亚型的单克隆抗体的制备
35.根据hpv6和hpv11的氨基酸序列，采用计算机模拟，联合应用kyte-doolittle和hopp-woods的氨基酸亲水性方案，karplus-schulz的可塑性方案，emini的表面区域可能性方案，jameson-wolf的抗原可能性方案以及kolaskar-tongaonkar的抗原表位指数预测法，并辅以cohen方法、garnier-robson方法和chou-fasman方法对蛋白二级结构中柔性区域的分析，多参数预测hpv6和hpv11的主抗原表位序列，对预测结果进行综合比较分析后，设计了1条最好的能够同时针对hpv6和hpv11的共同抗原表位：vqwaydndiceeseiafeyaqrgdfdsnaraflnsnmqakyv(seq id no：1)。将所述抗原表位肽委托人工合成备用。
36.以抗原表位肽为免疫原免疫balb/c小鼠。首次免疫与弗氏完全佐剂混合，免疫剂量为100μg/只，采用皮下多点注射；再与弗氏不完全佐剂混合，加强免疫3次，采用腹腔注射。最后1次免疫后5d，经鼠尾采血，分离血清，间接elisa检测免疫效果，选择免疫效果最好的一只小鼠；并在细胞融合前3d，以200μg/只的剂量直接脾内注射抗原表位肽强化免疫效果。取免疫鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合，分别采用含hat和ht的培养基进行选择性培养，有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆，并以抗原表位肽作为检测抗原，
采用间接elisa法测定杂交瘤细胞培养上清的抗原-抗体反应能力，从中筛选并鉴定阳性最强的杂交瘤克隆共3株，分别是3a2a，7c4c，8d2b。
37.单克隆抗体的制备及纯化：以1.5
×
106个/只将三株3a2a，7c4c，8d2b杂交瘤细胞分别腹腔注射经石蜡油预处理的balb/c小鼠，10d后，抽取腹水，4℃，12000
×
g离心30min，收集上清液，加入等体积的结合缓冲液(0.1mol/lpbs，ph8.0)稀释，经0.45μm微孔滤膜过滤后，利用抗体fc段的生物学特性亲和层析纯化抗体。平衡rproteina层析柱后上样，经结合缓冲液充分洗涤后，用洗脱缓冲液(0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ph3.0)洗脱目的抗体；立刻向收集的纯化抗体中加入ph8.9的1mol/l tris-hcl缓冲液充分中和，并置换缓冲液于pbs中，取样，采用bca法测定抗体的浓度。采用间接elisa法，以抗原表位肽作为包被抗原，单抗稀释度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
和10-8
，以a450值大于1.0的最高稀释度作为抗体效价。结果如下表1所示。
38.表1纯化单克隆抗体的浓度及效价
39.单抗浓度(mg/ml)效价(稀释度)3a2a4.62.2
×
10-5
7c4c5.24.3
×
10-5
8d2b4.95.8
×
10-5
40.单克隆抗体的抗原反应特异性鉴定：采用间接elisa法，分别以seq id no：1的抗原表位肽及khkaltlikcppllvtsnid(seq id no：2)的表位肽、bsa蛋白作为包被抗原，测定单克隆抗体的抗原-抗体反应能力，分析单克隆抗体的抗原反应特异性。结果如图1所示。
41.间接elisa结果显示，3株单抗(3a2a，7c4c，8d2b)均能与序列1的免疫抗原肽发生较强的抗原-抗体反应，而与序列2的表位肽不发生反应，与人bsa也不发生反应，表明这3株单抗为针对hpv6/11的特异性单抗，见图1。
42.实施例2 7c4c单克隆抗体序列分析及亲和力鉴定
43.表面等离子共振仪spr抗体亲和力测定：根据proteon xpr36(b10-rad)仪器及相应芯片说明，将抗原通过氨基偶联试剂edac，100mm和sulfo-nhs，25mm)(proteon氨基偶联试剂盒)连接到glc芯片上，然后不同浓度(600，300，150，75，37.5，和18.75nm in pbst，ph7.4)的待测抗体溶液注入仪器进行检测。
44.通过表面等离子共振仪spr方法进行了7c4c抗体和抗原表位的亲和力测定。以不同浓度的抗体作为流动相，进行测定。结果显示，7c4c抗体和抗原表位的识别具有很高的亲和力，解离常数达到kd为3.24
×
10-9
m。
45.应用针对鼠抗体重链和轻链可变区基因5’端及3’保守序列设计轻重链扩增引物，以7c4c杂交瘤细胞的cdna为模板进行扩增，将扩增产物插入puc19质粒后测序分析，获得了7c4c的轻重链可变区序列分别如下所示。
46.轻链可变区(seq id no：3)
[0047][0048]
重链可变区(seq id no：4)
[0049][0050]
实施例3 7c4c单克隆抗体对人乳头瘤病毒6/11病毒颗粒体外感染hacat细胞的影响
[0051]
取hpv6/11阳性感染尖锐湿疣组织，于平皿中，用灭菌pbs充分洗涤剪碎；剪好的组织放于研钵中，加提取缓冲液充分研匀，以12000r/min、4℃离心10min；取上清加入等体积聚乙二醇，4℃静置1h后，8000r/min、4℃离心10min；弃去上清，向沉淀中加人适量pbs缓冲液，4℃过夜；次日以10000r/min、4℃离心1h，收集上清，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置-70℃备用；取待检病毒悬液行pcr检测，制备的病毒样颗粒悬液dna载量为5
×
106拷贝/ml。
[0052]
在24孔板中按1
×
105/孔接种hacat细胞；次日弃培养液，将6组稀释倍数为1：10、1：50、1：100、1：200、1：400、1：1000的单克隆抗体(初始浓度为1mg/ml)分别加到hacat细胞上，置于冰上1h，其间不时轻晃培养板；弃去培养液，加入适量pbs充分洗涤，用106拷贝/ml的hpv6/11病毒样颗粒体外感染hacat细胞，以等量pbs取代单抗和hpv6/11病毒样颗粒作为阴性对照，阳性对照为不加单抗只加hpv6/11病毒样颗粒；取感染后的hacat细胞行pcr检测；以上过程共进行重复实验3次；计算：单抗抑制率＝(1-加单抗后hacat病毒拷贝数/未加单抗hacat病毒拷贝数)
×
100％。
[0053]
图2可见，6组不同稀释倍数的单抗对浓度为106拷贝/ml的hpv6/11病毒样颗粒体外感染hacat细胞后所测得的抑制率不同，通过比较发现，随着单抗浓度的增加，单抗对106拷贝/ml的hpv6/11病毒样颗粒黏附到宿主细胞的抑制率随之增加，差异有统计学意义(p＜0.05)。在1:10的稀释条件下，抑制率达到了(72.30
±
3.98)％，抑制效果较好。
[0054]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。