用于输送黏膜疫苗的免疫球蛋白单域抗体的制作方法

1.本发明涉及特异性结合氨肽酶n(apn)的单域抗体，尤其涉及一种多肽和一种编码这样的多肽的核酸；一种制备这样的多肽的方法；以及一种用于预防、治疗或诊断目的的包含这样的多肽的组合物，尤其是药物组合物。尤其是，本发明的单域抗体能够将一部分靶向黏膜表面。


背景技术：

2.绝大多数病原体和外部有害物质是通过呼吸道、胃肠道(gi)和泌尿生殖道的黏膜表面进入体内的，因此黏膜免疫对预防感染至关重要。目前，无针口服疫苗给药是针对肠道病原体防护的最有吸引力的给药途径，因为它提供了许多优点，例如易于给药、没有血液传播感染的风险、以及对于大规模疫苗接种的实用性。已经发现，与亚单位疫苗相比，只有减毒活疫苗或灭活的病原体微粒能有效刺激高效的免疫反应。但是，由于口服减毒或灭活病原体的安全性问题，只有很少数的此类疫苗获得了批准。另一方面，亚单位疫苗被认为是安全的，因为它们不含病原体的生命成分，但是疫苗抗原穿过肠上皮到达下层免疫诱导部位的输运能力很差，导致免疫反应很差，这对口服疫苗的开发造成了一个很大障碍。肠上皮细胞或吸收性绒毛上皮细胞占所有肠上皮的90％，并且它们具有吞噬作用和胞转作用能力，以将肠道病原体或大分子穿过上皮屏障输运[1]。因此，靶向肠上皮细胞上的胞转受体的抗原是一种用于疫苗输送和诱导针对肠道病原体的强烈黏膜和全身免疫反应的值得关注的途径[2]。
[0003]
近年来，氨肽酶n(apn)已被确定为在包括小肠上皮细胞和抗原呈递细胞(apc)在内的多种细胞上表达但不在胃肠道的其它部分的上皮细胞上表达的f4菌毛受体[3]。使用apn特异性多克隆抗体进行口服免疫能引发黏膜免疫[3，wo09/103555]。此外，apn特异性小鼠单克隆抗体微粒的功能化还能加强肠道上皮对这些微粒的摄取，并引发全身免疫反应[4]。这些发现表明，与疫苗抗原结合的apn特异性输送剂可能是引发更强的肠道免疫反应的一种有吸引力的策略。迄今为止，已经确定了多种靶向机制，例如抗体、细胞介导的靶向(dc免疫治疗、t细胞过继转移)、以及抗原与小分子(例如多糖和氨基酸)的化学结合[5]。由于其强亲和力和特异性，抗体是一种理想的蛋白质，所关注的抗原能够与其基因融合以靶向表达apn的肠细胞。可使用不同的抗体形式，例如单克隆抗体(mab)、单链可变片段(scfvs)、或纯重链抗体的可变结构域(vhh，又称为(scfvs)、或纯重链抗体的可变结构域(vhh，又称为)。虽然常规的mab最初时作为靶向载体是优选的，但是它们与抗原融合的生产方式被证明是麻烦且耗时的。此外，它们的结构复杂性有碍于它们作为潜在配体的用途。因此，考虑了其它更简单的形式(例如scfv和vhh)作为获得全尺寸抗体的替代途径。虽然抗体工程的进展使得能够很容易基于mab的靶向性设计和克隆scfv基因，但是合成scfv蛋白质的稳定性和积累有很大变化，取决于多种因素，包括实现两个可变结构域的正确折叠和组装所需的接头的长度不可预测，这往往限制了scfv靶向应用[6，7]。另一方面，vhh免疫球蛋白结构域仅是源自仅骆驼科重链抗体的一个15kda可变片段[8]。与scfv不同的是，vhh在单个结构域中而不是在常规抗体和衍生
的scfvs的两个可变结构域中包含其抗原结合特性，同时保持相似的亲和力。与传统抗体相比，vhh因其尺寸小、易于生产、良好的热稳定性和高效的组织穿透能力等独特性质而在各种应用中受到了极大的关注[9-11]。
[0004]
本发明提供了一种vhh以及该vhh作为向肠上皮靶向输送的载体以诱导强烈的黏膜免疫反应等的应用。


技术实现要素：

[0005]
本发明确定了能够以高水平生产并且很稳定的一个vhh家族。所述vhh家族不仅结合apn，而且在生理条件下被猪肠道中的细胞系高效地内吞，尤其是能够引发全身和肠道iga反应，尤其是在口服后。本发明的多肽可用作靶向apn受体的输送载体，并用于高效地将分子特异性地输送至表达apn的黏膜，更具体地说是输送至(小)肠。此外，本发明的多肽在给猪口服后会穿过上皮屏障，表现出其作为将异源化合物/抗原靶向肠黏膜免疫系统的载体的功用。
[0006]
在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)，其中所述isvd包含3个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)，其中：
[0007]
(i)cdr1选自由seq id no:1和与seq id no:1有1个、2个或3个氨基酸差异、尤其是有2个氨基酸差异、更尤其是有1个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组；
[0008]
(ii)cdr2选自由seq id no:3和与seq id no:3有1个、2个或3个氨基酸差异、尤其是有2个氨基酸差异、更尤其是有1个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组；
[0009]
并且
[0010]
(iii)cdr3选自由seq id no:4和与seq id no:4有1个、2个或3个氨基酸差异、尤其是有2个氨基酸差异、更尤其是有1个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组。
[0011]
更具体地说，(i)cdr1选自seq id no:1或2；(ii)cdr2是seq id no:3；并且(iii)cdr3选自seq id no:4或5。
[0012]
本发明的特定多肽包含选自以下cdr1、cdr2和cdr3组合：
[0013]-cdr1是seq id no:1，cdr2是seq id no:3，cdr3是seq id no:4；或者
[0014]-cdr1是seq id no:2，cdr2是seq id no:3，cdr3是seq id no:5。
[0015]
更具体地说，本发明的isvd由4个骨架区(分别是fr1至fr4)和本文提供的互补决定区cdr1、cdr2和cdr3组成或者基本上由这些区域组成。
[0016]
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含seq id no:6或由seq id no:6组成的多肽、或者与seq id no:6有至少80％序列同一性的多肽，例如seq id no:7或seq id no:8。
[0017]
在另一个实施方案中，提供了一种包含本发明的至少一种多肽的apn结合构建体。所述构建体可包含与免疫球蛋白单可变结构域连接的其它部分。所述另外的部分可结合至或不结合至apn。在一个特定实施方案中，所述构建体还包含fc结构域和/或另外的诊断或治疗部分，例如生物活性化合物。
[0018]
在另一个实施方案中，没有提供所述免疫球蛋白单可变结构域本身，而是将其作为核酸提供，即，编码本文所述的多肽的分离或重组的核酸分子。此外，提供包含这样的核酸的载体或宿主细胞。典型情况下，这样的宿主细胞已经被所述核酸转化或转染。所想到的
这些宿主细胞的一个特定用途是生产本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽。因此，被编码本文提供的多肽的核酸分子转化或转染的宿主细胞可用于生产免疫球蛋白单可变结构域。
[0019]
根据另一个方面，本文提供的多肽、核酸或构建体用于医药，尤其是用作人用或兽用药物。根据另一个实施方案，所述多肽(或编码它们的核酸)用于(胃)肠疾病的治疗性治疗或预防。
[0020]
本发明的多肽可作为蛋白质(作为免疫球蛋白单可变结构域，作为apn结合构建体、嵌合分子或药物组合物的一部分)提供，或者可作为编码所述免疫球蛋白单可变结构域的核酸分子或作为包含这样的核酸分子的载体施用。能想到不同的施用途径。作为非限制性实例，所述多肽可全身、口服或鼻内施用，但是尤其是口服施用。在所述免疫球蛋白单可变结构域作为核酸或载体提供的情况下，尤其能想到通过基因治疗施用所述免疫球蛋白单可变结构域。一个特定实施方案提供了用于疫苗接种、尤其是黏膜疫苗接种的所述多肽、构建体、嵌合分子或药物组合物。
[0021]
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的多肽、所述构建体或嵌合分子、所述核酸或所述宿主细胞、以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。尤其是，所述药物组合物是疫苗，更尤其是是口服疫苗，即，适当配制用于口服输送的疫苗。
[0022]
本发明还包括一种治疗或预防受试者的肠道疾病或失调的方法，该方法包括以有效治疗、减轻或预防所述疾病或失调的至少一种症状的量向所述受试者施用所述多肽、所述构建体、所述嵌合分子或所述药物组合物。
[0023]
在另一个实施方案中，本发明涉及本文所述的多肽、构建体或嵌合分子、核酸或宿主细胞的用于诊断的用途，例如用于生物成像或用于竞争测定。此外，所述多肽、所述构建体或嵌合分子可在用于识别和获得能够穿过受试者的黏膜屏障的化合物或生物体(例如病毒)的体外方法中使用，所述方法包括：a)将含有apn或其功能片段的源、细胞或细胞系与待测试的化合物或生物体一起孵育；以及b)确定所述分子的与本文提供的多肽或嵌合分子竞争的能力。
[0024]
还提供了一种生产本发明的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
[0025]-将编码多肽的核酸引入表达系统，尤其是毕赤酵母，以及
[0026]-纯化表达的多肽。
附图说明
[0027]
图1是基于bioxp
tm 3200系统的吉布森克隆策略的示意图，该克隆策略用于高效地获得vhh-mg(融合至鼠类igg的fc结构域的仅重链抗体的可变结构域)融合蛋白。(a)vhh-mg融合蛋白片段的末端的40bp与sapi线性化的pkaigg载体的末端同源。mg代表小鼠igg的fc结构域。在bioxp系统上整夜运行期间，合成了vhh-mg片段，并将其连接到sapi消化的pkaigg中。用连接样品转化了dh5α细胞，并在补充了博莱霉素(zeo)的培养基上筛选转化体。随后，从四个随机选择的克隆体中分离dna，并通过限制性消化或菌落pcr和测序对其进行分析，以筛选阳性克隆体。(b)通过bioxp克隆系统获得无错克隆体的效率。通过测序表明，在为每种构建体筛选一个克隆体时，获得无错克隆体的概率是77％，在筛选两个克隆体
时，获得无错克隆体的概率是97％。
[0028]
图2示出了通过酶联免疫吸附测定(elisa)和流式细胞术选择apn特异性vhh-mg。将克隆体按照所属家族排列，并以虚线隔开。(a)elisa板包被apn，并使用培养基对其进行孵育。以比色反应的od(od)值描述vhh-mg的apn结合。(b)对结合至在apn转染的bhk21(bhk21-apn，灰色条)和apn转染的ipec-j2(ipec-j2-apn，黑色条)的膜上表达的全长apn的vhh-mg进行流式细胞术筛选。imm013(鼠igg1)是阳性对照物。igg1同型、v2-mg和d3-mg是阴性对照物。v2-mg和d3-mg融合蛋白包含与不相关的靶结合的vhh(分别是v2和d3)。图中示出了平均荧光强度(mfi)。
[0029]
图3示出了不同vhh-mg融合蛋白的纯化。(a)六种不同vhh-mg融合蛋白在蛋白a纯化后的尺寸排阻色谱(sec)图，在右上角标有各自的名称。箭头指示大约80kda的位置和分子量，这与由两个vhh-mg多肽(每个大约40kda)之间的二硫键组装的单体vhh-mg融合蛋白对应。(b)在还原(左)和非还原(右)条件下在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上进行sec之后80-kda峰的合并级分的sds-page分析。在还原条件下一价vhh-mg(大约40kda)完整全长多肽的预期位置以箭头示出，在非还原条件下二价vhh-mg(大约80kda)完整全长多肽的预期位置以箭头示出。m是分子量标记(kda)。(产量-3l94-mg：2.7毫克/升；2l48-mg：2.3毫克/升；2l69-mg：1.9毫克/升；2l65-mg：5.9毫克/升；2l22-mg：8毫克/升；2l46-mg：1.4毫克/升)。
[0030]
图4示出了结合表达apn的细胞系的vhh的筛选。周质粗提物是从含有来自库中的重组噬菌粒的tg1细胞制备的。通过流式细胞术在表达apn的细胞系上筛选了28种apn结合vhh候选物。按照克隆体在cdr3序列中的相似性对克隆体进行分组；虚线之间的顶部数字表示不同克隆体所属的家族。y轴代表apn转染的(apn)和亲代未转染的bhk21细胞(亲代)的中值荧光强度(mfi)的比值。
[0031]
图5示出了纯化的vhh-mg融合蛋白的结合分析和apn介导的内吞作用。(a)用纯化的vhh-mg融合蛋白进行的apn结合elisa。在包被有apn的微量滴定板上对一系列三倍稀释的纯化vhh-mg进行孵育，并使用与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠igg探测。以od(492纳米)值描述vhh-mg与固定的抗原的结合。imm013是阳性对照物，gbp-mg是阴性对照物。将背景阈值确定为阴性对照物的od(492纳米)值的两倍。(b)通过流式细胞术确定的vhh-mg融合蛋白与表达apn的细胞的结合。图中示出了在所示浓度(微克/毫升)下与vhh-mg结合的apn阳性细胞的数量。
[0032]
图6示出了用vhh-mg对仔猪进行口服免疫引发循环抗体和小肠抗体反应。(a)口服免疫实验的设计。(b)在使用1毫克vhh-mg 2l65和3l94以及等摩尔量的无关小鼠igg2a对仔猪进行口服免疫(n＝4头/组)时小鼠igg2a特异性血清igg和iga反应。dppi：初次免疫后的天数；od：光密度。数据以平均值 标准偏差表示*，对于igg2a，p《0.05(friedman)。(c)在所示的时间点循环小鼠igg2a特异性igg和iga分泌细胞的数量。asc：抗体分泌细胞。**，对于第0天，p《0.01；δ，对于igg2a，p《0.05(friedman)。(d)初次免疫后第28天时小肠小鼠igg2a特异性igg和iga分泌细胞的数量。mln：肠系膜淋巴结；jlp：空肠固有层；jpp：空肠派伊尔淋巴结；ilp：回肠固有层；ipp：回肠派伊尔淋巴结*；p《0.05(holm-sidak)。
[0033]
图7示出了apn特异性vhh-mg融合蛋白的不同变体在毕赤酵母中的表达。通过考马斯染色和蛋白免疫印迹分析筛选酵母转化体的培养基(每种构建体4个菌落)，以识别最高表达克隆体。在此，对于每种构建体仅示出了一个高表达克隆体，并且根据它们的cdr3相似
性对它们进行分组；虚线之间的数字表示它们所属的家族。用1％甲醇诱导蛋白表达48小时。收获培养物，并通过sds-page(上图)和蛋白免疫印迹(下图)分析上清液。使用
‘
v2-mg pure’作为加载对照物，加载500纳克样品用于考马斯染色，并加载200纳克样品用于蛋白免疫印迹分析。
[0034]
图8示出了本发明的多肽的代表性氨基酸和核酸序列。cdr带有下划线。
[0035]
图9示出了vhh-fc小鼠igg2a融合构建体(2l65-mg融合蛋白)的氨基酸和核酸序列。2l65 vhh的序列以加粗形式示出。hinge序列带有下划线。
[0036]
图10：(a)猪iga的一部分的氨基酸序列(aaa65943.1；u12594.1)；(b)猪iga的铰链-ch2-ch3片段；(c)猪igg3的一部分的氨基酸序列(eu372658.1)；(d)猪igg3的ch1-铰链-ch2-ch3片段(ch1结构域始于位置5)。
[0037]
图11示出了apn特异性vhh被bhk-apn细胞内化。
具体实施方式
[0038]
除非另有所示或限定，否则所用的所有术语都具有其在本领域中的通常含义，这对技术人员来说是显而易见的。
[0039]
除非上下文另有明示，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“试剂”的指代包括一种或多种这样的不同试剂，对“方法”的指代包括对本领域普通技术人员已知的可被修改或替代成本文所述的方法的等同步骤和方法的指代。
[0040]
除非另有所示，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员应认识到或能够确定，只需通过常规试验就能获得在本文中所述的本发明的特定实施方案的许多等同形式。这种等同形式应视为被本发明所涵盖。
[0041]
在本文中所用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的所有或任何其它组合”的含义。在本文中所用的术语“大约”或“近似”指在给定值或范围的20％以内，优选在15％以内，更优选在10％以内，最优选在5％以内。
[0042]
在本说明书和所附的权利要求中，除非上下文另有要求，否则“包括”一词和其语法变化形式应理解为意味着包含所述的整数或步骤或者一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或者其他整数或步骤组。在本文中所用的术语“包括”可用术语“含有”或“包含”代替，或者有时在本文中使用时可用术语“具有”代替。
[0043]
在本文中所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“vhh序列”或“蛋白质序列”等术语中)通常应理解为包含相关的氨基酸序列以及对其编码的核酸或核苷酸序列，除非上下文要求更有限度的解释。在核酸或氨基酸序列已经与在源或培养基中通常与其相关联的至少一种其它成分(例如另一种核酸或氨基酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物成分或大分子、或至少一种污染物、杂质或微量成分)分离时，该核酸或氨基酸序列被认为是“(处于)(基本上)分离的(形式)”，例如与从中获得该核酸或氨基酸序列的反应介质或培养基相比。
[0044]
为了比较两个或更多核苷酸序列，可通过将[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中的相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸的总数]并乘以[100％]来计算第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比，其中，与第一核苷酸序列相比，第二核苷酸序列中的每个核苷酸缺失、插入、取代或添加被
认为是单个核苷酸(位置)处的差异。或者，可使用已知的计算机序列比对算法(例如ncbi blast v2.0)并使用标准设置来计算两个或更多核苷酸序列之间的序列同一性程度。
[0045]
为了比较两个或更多氨基酸序列，可通过将[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中的相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基的总数]并乘以[100％]来计算第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比(在本文中又称为“氨基酸同一性”)，其中，与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中的每个氨基酸残基缺失、插入、取代或添加都被认为是单个氨基酸残基(位置)处的差异，即，如本文中所定义的“氨基酸差异”。或者，可使用已知的计算机算法(例如上面提到的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法)并且也使用标准设置来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。
[0046]
此外，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可考虑到所谓的“保守”氨基酸取代，这种“保守”氨基酸取代一般可被描述为一个氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基所取代并且对多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或基本上没有影响的氨基酸取代。这种保守取代优选是下面的(a)-(e)组中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小脂肪族、非极性或弱极性残基：丙氨酸(ala)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、脯氨酸(pro)和甘氨酸(gly)；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：天冬氨酸(asp)、天冬酰胺(asn)、谷氨酸(glu)和谷氨酰胺(gln)；(c)极性、带正电荷的残基：组氨酸(his)、精氨酸(arg)和赖氨酸(lys)；(d)大脂肪族、非极性残基：蛋氨酸(met)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)和半胱氨酸(cys)；以及(e)芳香族残基：苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)和色氨酸(trp)。特别优选的保守取代如下：ala变成gly或ser；arg变成lys；asn变成gln或his；asp变成glu；cys变成ser；gln变成asn；glu变成asp；gly变成ala或pro；his变成asn或gln；ile变成leu或val；leu变成ile或val；lys变成arg、gln或glu；met变成leu、tyr或ile；phe变成met、leu或tyr；ser变成thr；thr变成ser；trp变成tyr；tyr变成trp；和/或phe变成val、ile或leu。
[0047]
应用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代也可基于对不同物种的同源蛋白质之间的氨基酸变化的频率的分析。
[0048]
除非另有所示，否则术语“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白序列”用作包含全尺寸抗体的通用术语。“免疫球蛋白单可变结构域”或“isvd”是由单个可变抗体结构域组成的抗体片段。像完整的抗体一样，它能够有选择性地结合至特定的抗原。isvd的分子量仅为12-18kda，它远小于由两条重蛋白质链和两条轻蛋白质链组成的常规抗体(150-160kda)，甚至小于fab片段(大约50kda，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(大约25kda，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。一般来说，isvd会具有包含4个骨架区(fr1至fr4)和3个互补决定区(cdr1至cdr3)的氨基酸序列，优选符合以下式：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。isvd的抗原结合位点由不超过三个cdr形成。在本文中所用的术语“isvd”包含骆驼重链抗体(vhh)的可变结构域，该抗体又称为驼重链抗体(vhh)的可变结构域，该抗体又称为结构域抗体(dab)和源自鲨鱼的isvd(ignar结构域)。例如，在图8中列出了优选的骨架序列，并且这些骨架序列可在本发明的isvd中使用。优选表2所示的cdr与相同isvd构建体的相应骨架区相匹配。
[0049]
术语“免疫球蛋白单可变结构域”可与“单可变结构域”互换使用。因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如vl序列)或其适当的片段；或者是重链可变结构域序
列(例如vh序列或vhh序列)或其适当的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元即可(即，基本上由单个可变结构域组成的功能性抗原结合单元，由此单抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原结合单元)。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是vhh序列。
[0050]
本发明的apn结合物可以是以任何适当的方式从任何适当的来源获得的免疫球蛋白，例如免疫球蛋白单可变结构域，并且例如可以是天然存在的vhh序列(即，来自适当的骆驼科物种)或者合成或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化的”vhh序列、“骆驼化的”免疫球蛋白序列(尤其是骆驼化的重链可变结构域序列)、以及通过诸如亲和性成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、cd移植、镶饰、组合源自不同免疫球蛋白序列的片段、利用重叠引物的pcr组装等技术、以及本领域技术人员所熟知的用于对免疫球蛋白序列进行工程设计的类似技术获得的纳米抗体；或者任何前述物质的任何适当的组合。
[0051]
更具体地说，本发明提供了一种多肽，尤其是特异性结合apn的多肽，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域，该结构域是具有(一般)结构fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的氨基酸序列，其中fr1至fr4分别指骨架区1至4，并且其中cdr1至cdr3分别指互补决定区1至3。在本发明的一个实施方案中，所述isvd与seq id no:6-8(参见图8
–
cdr加下划线)、尤其是seq id no:6的至少一个氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少92％的氨基酸同一性。
[0052]
在本文中在任何seq id no的上下文中所用的“由
……
代表/所示”等同于“包括”所述seq id no或“由”所述seq id no“组成”，优选等同于“由”所述seq id no“组成”，在本说明书中所用的“vhh家族”或“家族”指一组具有相同长度(即，在其序列中具有相同数目的氨基酸)并且其中的氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性(例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高)的vhh序列。
[0053]
在一个实施方案中，等同序列指氨基酸取代，该氨基酸取代优选是保守氨基酸取代(如本文中所定义)；和/或与本文中确定的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸缺失或插入；和/或与本文中确定的氨基酸序列之一具有3个、2个或仅1个“氨基酸差异”(如本文中所定义)的氨基酸序列。更具体地说，所述等同序列具有氨基酸取代，该氨基酸取代优选是保守氨基酸取代(如本文中所定义)；和/或与本文中确定的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列优选仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸缺失或插入。
[0054]
可互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”指被诸如免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或本发明的多肽等抗原结合分子识别的诸如多肽或蛋白质等大分子的部分，更具体地说是被所述分子的抗原结合位点识别的部分。表位限定免疫球蛋白的最小结合位点，因此代表免疫球蛋白特异性的靶标。可“结合至”或“特异性地结合至”特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)和/或对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的氨基酸序列(例如免疫球蛋白单可变结构域、抗体、本发明的多肽或统称为抗原结合蛋白质或多肽或者其片段)被称为“针对”或“指向”所述表位，抗原或蛋白质，或者是相对于这样的表位、抗原或蛋白质的“结合”分子，或者被称为“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质(例如“抗”apn)。
[0055]
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常以kd或离解常数给出，其单位为摩尔/升(或m)。亲和力也可表示为缔合常数ka，该缔合常数等于1/kd，单位为(摩尔/升)-1
(或m-1
)。被认为有意义(例如特异性)的生物相互作用的kd通常在10-12
m(0.001nm)至10-5
m(10000nm)的范围内。相互作用越强，kd就越低。
[0056]
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可通过本身已知的不同技术来测量，例如众所周知的表面等离子体共振(spr)生物传感器技术(例如参见ober等人的文献[12])，在该技术中，一个分子被固定在生物传感器芯片上，而另一个分子在流动条件下通过固定的分子，从而产生k
on
、k
off
测量值并由此产生kd(或ka)值。例如，这可使用众所周知的仪(瑞典乌普萨拉市的pharmacia biosensor ab)进行。动力学排斥试验[13]测量溶液中的结合事件而无需标记结合配偶体，并且以动力学排斥复合物的解离为基础。还可使用免疫分析系统进行溶液内亲和力分析，该系统为自动化生物分析和快速样品周转提供了一个平台[14]。
[0057]
术语“特异性”指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的isvd或多肽)分子可结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数量。抗原结合蛋白的特异性可基于亲和力和/或亲和性确定。典型情况下，抗原结合蛋白(例如本发明的isvd和/或多肽)会以10-5
至10-12
摩尔/升或更低、优选10-7
至10-12
摩尔/升或更低的解离常数(kd)与其抗原结合。任何大于10-4
摩尔/升的kd值(或任何低于10-4
升/摩尔的ka值)通常被认为指示非特异性结合。优选本发明的单价isvd会以大约或小于10μm、尤其是大约或小于5μm、更尤其是小于1μm、例如小于500nm、更具体地是小于200nm、更具体地是小于10nm、例如小于500pm、例如在10和5pm之间或更小的亲和力结合至期望的抗原。
[0058]
抗原结合蛋白(例如isvd)与抗原或抗原决定簇的特异性结合可通过本领域技术人员已知的任何适当方式确定，例如包括饱和结合试验和/或竞争性结合试验，例如放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(eia)和夹层竞争试验以及在本领域中本身已知的这些方式的不同变化形式；以及在本文中所述的其它技术，优选通过流式细胞术或表面等离子体共振确定。
[0059]
在一个实施方案中，多肽与猪apn(papn)的结合是通过elisa确定的，而多肽与表达papn的细胞的结合是通过流式细胞术确定的。但是，由于与固定的抗原的结合可能不等同于与细胞膜的结合，因此流式细胞术数据是最可靠的。它表明与在生物膜上表达的天然形式的全长蛋白质的结合。此外，我们观察到与肠组织结合的明显相关性，这进一步证实了流式细胞术数据。
[0060]
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，该多肽特异性结合apn，并且还表明通过apn受体被细胞特异性摄取，尤其是被表达apn的细胞、更尤其是肠细胞的特异性摄取。在本文中所用的“肠上皮细胞”或肠吸收细胞(又称为吸收性绒毛上皮细胞)是排列在小肠和大肠内表面并具有吞噬作用和胞转作用能力以将肠道病原体或大分子穿过上皮屏障转运的上皮细胞。
[0061]“氨肽酶n(apn)”(又称为cd13、anpep、pepn、丙氨酰氨肽酶)是一种ii型膜糖蛋白，它属于膜结合金属蛋白酶家族，并在包括肠刷状缘细胞膜在内的多种组织中表达。
[0062]
apn的相关结构信息例如可在如下表1所示的uniprot或genbank登记号中找到。
[0063]
表1
[0064][0065]
在本文中所用的“apn”或“cd13”多肽指由哺乳动物apn基因编码的蛋白质(包括等位基因变体以及它们的含有保守或非保守变化的生物活性片段)以及与任何一种前述apn多肽基本上相同的人工蛋白质，即，至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个特定实施方案中，所述apn多肽与猪apn(野猪；登记号adx53333.1)至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在另一个实施方案中，在本文中定义的apn多肽的另一个特征在于它们被糖基化。
[0066]
由此类推，所述“apn”或“cd13”多核苷酸指包括等位基因变体以及它们的含有保守或非保守变化的生物活性片段、以及与任何一种前述的编码apn的多核苷酸基本上相同的任何核酸分子，即，至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0067]
在一个特定实施方案中，所述apn多核苷酸与编码猪apn(genbank登记号hq824547.1)的核酸分至少70％、75％、80％、85％、87％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0068]
在一个实施方案中，本发明的多肽与哺乳动物肠apn、尤其是猪apn、更尤其是猪肠apn、更尤其是在小肠中存在的上皮细胞或肠细胞上表达的apn特异性结合并被其内在化，所述apn包含由蛋白质登记号adx53333.1代表的氨基酸序列。本发明中的独特数据证明，在口服给药后，所述多肽不仅结合apn，而且导致肠上皮细胞的胞吞作用(转运到细胞中)和随后的穿过上皮屏障的胞转作用(穿过细胞内部转运)、以及向黏膜免疫系统的适当呈递。
[0069]
表达apn的细胞可用于确定本发明的多肽的摄取或内化。“表达”通常指多核苷酸
被转录成mrna的过程和/或mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。通过将外源核酸引入细胞中的方法可促进或加强apn的表达。这种细胞可按允许编码的apn多肽表达的方式包含多核苷酸或载体。在本文中提供的编码apn的多核苷酸可作为环状质粒的一部分或作为包含分离的蛋白质编码区的线性dna或在病毒载体中被引入宿主细胞中。将外源核酸引入宿主细胞中的方法在本领域是众所周知和常规实施的，包括转化、转染、电穿孔、核注入或与诸如脂质体、胶束、影细胞和原生质体等载体融合。本发明的宿主细胞系统包括植物、无脊椎动物和脊椎动物细胞系统。
[0070]
用于研究内化的细胞是从小肠上皮组织分离的原代细胞(例如肠上皮细胞制品)；或连续细胞，包括表达apn的重组细胞系，尤其是猪肠上皮细胞(ipec-j2，ipec-i，ipi-2i)、乳仓鼠肾(bhk)细胞(例如bhk21细胞)、或源自成人isc(肠样细胞/器官样细胞)或源自诱导多能干细胞(ipsc)(器官样细胞)的“迷你小肠”。其它细胞可包括但不限于以下细胞：昆虫细胞、猪肾(pk)细胞、猪肾皮质(sk-rst)细胞、猫肾(fk)细胞、猫全胎细胞(fcwf-4)、猪睾丸(st)细胞、非洲绿猴肾细胞(ma-104、marc-145、vero和cos细胞)、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人293细胞和鼠3t3纤维原细胞、人结肠癌上皮(caco2)细胞、人淋巴母细胞(kasumi-3)、人骨髓母细胞(kasumi-4)、人骨髓母细胞(kasumi-6)、人嗜碱细胞系(ku812)、人b淋巴母细胞(sup-b15)、人上皮肾皮质细胞(wt 9-7、wt 9-12)。昆虫宿主细胞培养系统也可用于表达本发明的多肽。
[0071]
在所述上下文中，用于表达本发明的多肽的适当表达载体的选择当然会取决于所用的特定宿主细胞，并且在本领域普通技术人员的技能范围内。适当的表达载体的实例包括psport和pcdna3(invitrogen)、pcmv-script(stratagene)和psvl(pharmacia biotech)。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括源自病毒基因组的转录和翻译控制序列。可用于本发明的常用启动子序列和修饰子序列包括但不限于源自人巨细胞病毒(cmv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)、腺病毒2、多瘤病毒和猿猴病毒40(sv40)的序列。
[0072]
作为一种替代方案，多肽的摄取或内化可通过在如本发明的实例中所公开的肠结扎环实验中使用猪肠组织确定。这些数据支持靶向apn的vhh穿过小肠上皮的有效转运。
[0073]
由于已知apn序列存在于不同物种的细胞中，因此可修饰内源基因以允许或增强apn多肽的表达。通过使用完整的异源启动子或其一部分完全或部分地代替天然存在的apn启动子，能够修饰细胞(例如通过同源重组)以增强表达，使得细胞以更高的水平表达apn多肽。以使异源启动子与内源apn编码序列有效连接的方式插入异源启动子。还能想到，除了异源启动子dna之外，可与异源启动子dna一起插入可扩增的标记dna(例如ada、dhfr和多功能cad基因，它们编码氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶)和/或内含子dna。若与apn编码序列相连，则通过标准选择方法扩增标记dna会导致细胞中的apn编码序列的共扩增。
[0074]
或者，也可通过使用已知能诱导apn在细胞中的表达的化合物进行处理来诱导apn表达，例如使用碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)[15]或使用苯丁抑制素[16]处理。
[0075]
在一个实施方案中，若本发明的isvd或多肽对两种不同的抗原或抗原决定簇(例如来自不同哺乳动物物种的apn，例如人apn、猪apn、狗apn、猫apn、马apn、牛apn、大鼠apn、小鼠apn和/或恒河猴apn)具有特异性(如本文所定义)，则称其对这些不同抗原或抗原决定簇具有“交叉反应性”。应理解，虽然isvd或多肽对两种不同抗原的结合亲和力可能有所不
同(例如相差2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或甚至更多)，但是只要其对这些不同的抗原或抗原决定簇具有特异性(如本文所定义)，就可认为isvd或多肽是交叉反应性的。
[0076]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，其中所述多肽与本文所述的多肽(例如由seq id no:6、7或8代表的多肽)竞争，这种竞争例如是通过诸如流式细胞术、表面等离子体共振或竞争elisa等竞争性结合试验确定的，尤其是通过竞争elisa确定的。
[0077]
本发明还涉及一种用于确定与本文所述的多肽(例如由seq id no:6、7或8之中的任何一个代表)竞争的竞争物(例如多肽或小分子)的方法，其中本文所述的多肽与所述竞争物(例如多肽)竞争或交叉拦阻与apn(例如猪apn)的结合，其中，与本发明的多肽不存在时竞争物与apn的结合相比，在本发明的多肽存在时，竞争物与apn的结合减少至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或甚至更多，例如80％、90％或甚至100％(即，在给定的试验中实际上检测不到)。尤其是，通过在本文中提供的任何一种试验测量时减少至少80％(优选减少至少90％)表明竞争性结合。竞争和交叉拦阻可通过本领域中已知的任何方法确定，例如竞争性结合试验，例如流式细胞术、表面等离子体共振、生物层干涉测量或竞争elisa。在一个方面中，本发明涉及一种多肽，其中所述多肽交叉拦阻由seq id no:6、7或8代表的至少一种多肽与apn的结合。所应用的试验条件是本领域技术人员公知的和/或在本文中提供的试验条件。
[0078]
术语“(交叉)拦阻”、“竞争性结合”和“竞争”在本文中可互换使用，指免疫球蛋白、抗体、isvd、多肽或其它结合剂干扰其它免疫球蛋白、抗体、isvd、多肽或结合剂与给定靶标结合的能力。例如，在xiao-chi等人[17]或miller等人[18]的文献(这些文献通过引用并入本文)中说明了用于确定免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单可变结构域、多肽或其它针对靶标的结合剂是否如本文所定义的那样(交叉)拦阻、竞争性结合或具有竞争力的方法。
[0079]
本发明确定了一个能够结合apn、诱导穿过肠上皮的转运和诱导免疫反应的vhh家族。所述单域抗体家族的特征在于具有表2中提供的下列互补决定区(分别是cdr1至cdr3)。
[0080]
具有如此高的序列同一性(尤其是在cdr3中，其同一性是80％或更高)的vhh表明相同的表位，并且预期具有相同的功能特征。
[0081]
表2
[0082][0083]
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含结合肠氨肽酶n的免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，其中所述isvd包含3个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)，其中：
[0084]
(i)cdr1由以seq id no:1代表的氨基酸序列或与该氨基酸序列有至少70％同一性的序列组成；
[0085]
(ii)cdr2由以seq id no:3代表的氨基酸序列或与该氨基酸序列有至少80％同一性的序列组成；
[0086]
(iii)cdr3由以seq id no:4代表的氨基酸序列或与该氨基酸序列有至少80％同一性的序列组成。
[0087]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含结合肠氨肽酶n的免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，其中所述isvd包含3个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)，其中：
[0088]
(i)cdr1选自由seq id no:1和与seq id no:1具有1个、2个或3个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组；
[0089]
(ii)cdr2选自由seq id no:3和与seq id no:3具有1个、2个或3个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组；
[0090]
并且
[0091]
(iii)cdr3选自由seq id no:4和与seq id no:4具有1个、2个或3个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组。
[0092]
在一个实施方案中，变体氨基酸位于由seq id no:1代表的氨基酸序列的位置4、6和/或7；和/或由seq id no:4代表的氨基酸序列的位置6、10和/或12。
[0093]
尤其是，本发明涉及一种如本文所述的isvd，其中所述isvd特异性地结合apn，并且基本上由4个骨架区(分别是fr1至fr4)和3个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)组成，其中：
[0094]
(i)cdr1选自由seq id no:1和与seq id no:1具有1个、2个或3个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组，其中在位置4，i变成了f，和/或其中在位置6，n变成了s，和/或其中在位置7，h变成了n；
[0095]
(ii)cdr2由seq id no:3组成；并且
[0096]
(iii)cdr3选自由seq id no:4和与seq id no:4具有1个、2个或3个氨基酸差异的氨基酸序列所组成的组，其中在位置6，v变成了a，和/或其中在位置10，v变成了l，和/或其中在位置12，d变成了e。
[0097]
尤其是，本发明提供了一种包含免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，其中所述isvd包含3个互补决定区(分别是cdr1至cdr3)，其中：
[0098]
(i)cdr1由seq id no:1或2组成；
[0099]
(ii)cdr2由seq id no:3组成；并且
[0100]
(iii)cdr3由seq id no:4或5组成。
[0101]
更尤其是，本发明提供了一种包含免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，其中所述isvd包含选自以下的cdr1、cdr2和cdr3组合：
[0102]-cdr1是seq id no:1，cdr2是seq id no:3，cdr3是seq id no:4；或者
[0103]-cdr1是seq id no:2，cdr2是seq id no:3，cdr3是seq id no:5。
[0104]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，所述多肽包含seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8的序列或与该序列具有至少80％同一性、尤其是至少85％同一性、更尤其是至少90％同一性、更尤其是至少92％同一性的序列，或者由这些序列组成。在一个特定实施方案中，cdr中的序列变化限于由seq id no:1代表的氨基酸序列的位置4、6和/或7；和/或由seq id no:4代表的氨基酸序
列的位置6、10和/或12。在另一个实施方案中，在分别由seq id no:1-5表征的cdr中没有序列变化，只有fr的序列可能不同。更具体地说，本发明提供了一种包含seq id no:6的多肽、或与seq id no:6具有至少80％、尤其是至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，并且其中cdr1由seq id no:1或2组成；cdr2由seq id no:3组成；和/或cdr3由seq id no:4或5组成。
[0105]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，所述多肽是由seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12的核酸序列或与该核酸序列具有至少70％同一性、尤其是至少80％同一性、更尤其是至少85％同一性的核酸序列编码的。在一个特定实施方案中，cdr中的序列变化限于由seq id no:1代表的编码的氨基酸序列的位置4、6和/或7；和/或由seq id no:4代表的氨基酸序列的位置6、10和/或12。在另一个实施方案中，在编码分别由seq id no:1-5表征的氨基酸的cdr中没有序列变化，只有fr的氨基酸序列可能不同。
[0106]
更具体地说，本发明提供了一种包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，所述多肽包含seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的序列或由该序列组成。
[0107]
应理解，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可用作制备多肽的“构件”，但不限于此，并且所述多肽可选地包含一个或多个可用作构件的其它免疫球蛋白单可变结构域(即，针对apn上的同一个或另一个表位和/或针对除了apn之外的一个或多个其它抗原、蛋白质或靶标)。因此，本发明的多肽包含至少一个isvd，所述isvd结合apn，尤其是结合apn并被表达apn的细胞内吞。
[0108]
一般来说，包含单个构件(例如单个isvd)或基本上由单个构件组成的多肽或构建体在本文中将被分别称为“单价”多肽和“单价”构建体。包含两个或更多构件(例如isvd)的多肽或构建体在本文中也被称为“多价”多肽或构建体，并且存在于这样的多肽或构建体中的构件/isvd在本文中也被称为是“多价形式”的。例如，“二价”多肽可包含可选地通过接头序列连接的两个isvd，而“三价”多肽可包含可选地通过两个接头序列连接的三个isvd；等等。
[0109]
因此，结合apn并在本文中提供的本发明的isvd可以是基本上分离的形式，或者它们可形成构建体或多肽的一部分，该构建体或多肽可包含本发明的一个或多个isvd或基本上由这些isvd组成，并且可选地还包含一个或多个另外的氨基酸序列(所有这些氨基酸序列可选地通过一个或多个适当的接头连接)，这些氨基酸序列例如编码蛋白质或多肽，尤其是编码抗原性蛋白质或多肽。
[0110]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种“嵌合分子”(可选地也被称为构建体)，该嵌合分子包含至少一种在本文中定义的多肽，尤其是至少一种在本文中提供的isvd，该多肽或isvd与至少一种具有生物或功能活性的化合物(直接或间接)偶联、连接或缀合，所述化合物例如是化学物质(例如小分子)或生物物质，尤其是药物/治疗剂、生物活性化合物、抗原、毒素和/或诊断物质(例如标签、标记物或显像剂)。在所述实施方案中，所述多肽或isvd将作为载体，用于穿过肠黏膜屏障输送所述化合物。所述药物或治疗剂将在肠黏膜下层或肠黏膜相关淋巴组织中具有活性，和/或所述抗原将在肠黏膜下层或肠黏膜相关淋巴组织中诱导免疫反应。所述治疗剂可以是抗炎剂、抗癌剂、细胞毒性剂、抗感染剂(例如抗真菌剂、抗菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、毒素、细胞毒性药物、放射性核素等)。抗原包括但
不限于蛋白质、肽、脂质、核酸、糖脂和糖蛋白、碳水化合物、寡糖和多糖。不同的药物输送系统或(载有药物的)载体(例如基于纳米微粒(np)的载体)也可与本发明的多肽缀合，包括无机、磁性和聚合微粒或np。
[0111]
在本文中所用的术语“缀合”尤其指导致稳定的共价连接的化学和/或酶缀合。用于获得嵌合分子的偶联可通过存在于isvd中的特定氨基酸(例如赖氨酸、半胱氨酸)进行。如上文所述，任何部分都可偶联，例如具有特定生物活性或特定功能活性的试剂(例如蛋白质、核苷酸序列、脂质、糖类、肽、药物部分(例如细胞毒性药物、抗体药物缀合物或有效载荷)、示踪剂和检测剂)。在偶联部分是遗传编码的治疗或诊断蛋白质或核苷酸序列的实施方案中，偶联部分可通过本领域中公知的肽合成或重组dna方法合成或表达。在另一个方面中，在缀合部分是非遗传编码的肽(例如药物部分)的情况下，该缀合部分可以是人工合成的或从天然来源纯化的。
[0112]
在另一个实施方案中，本文中提供的多肽或嵌合分子还可包含一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元。所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元优选选自由聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可结合血清蛋白的结合单元、可结合血清蛋白的fc部分或小蛋白或肽、其它氨基酸残基、标签或其它功能部分(例如毒素、标签、放射性化学物质)等所组成的组。所述其它基团、残基、部分或结合单元例如可以是本身可具有或不具有生物学和/或药理学活性的化学基团、残基、部分。例如，这样的基团可与本发明的一个或多个isvd或多肽连接，从而提供本发明的多肽或构建体的“衍生物”，但不限于此。
[0113]
一般来说，本领域中已知的各种接头可用于连接本发明的isvd和(生物活性)化合物、试剂或部分。应明悉的是，可使用可裂解和不可裂解的接头来获得所需的释放模式。一般来说，接头和缀合化学物质的最佳组合必须是独特定制的，以关联每个独特的方面：isvd、缀合部分和待治疗的疾病的模式。其它适当的间隔序列或接头对于本领域技术人员来说也是显而易见的，并且通常可以是本领域中使用的任何接头或间隔序列。在特定方面中，所述接头或间隔序列适合用于药物用途。例如，在某些方面中，赖氨酸与缀合物之间的接头也可以是适当的氨基酸序列，尤其是1至50个氨基酸残基的氨基酸序列，或者更具体地说是1至30个氨基酸残基的氨基酸序列。这种氨基酸序列的一些实例包括gly-ser(gs)接头。其它适当的接头通常包括有机化合物或聚合物，尤其是适合用于药用多肽的有机化合物或聚合物。例如，聚乙二醇部分已被用于连接抗体结构域。接头的长度、柔性程度和/或其它性质可能对本发明的最终isvd缀合物的性质有一些影响，包括但不限于对特定靶标的亲和力、特异性或亲合性，这包括在本发明的范围之内。基于本文的公开内容，本领域技术人员能够确定用于本发明的特定isvd的最佳接头，可选地在经过一些有限的常规实验之后确定。
[0114]
在某些疾病中，vhh的小尺寸和快速肾清除有时不是提供在某些疾病中长期保护的很有利的特征。有多种方法能确保半寿命期的延长，并被认为是本发明的实施方案。因此，可通过微调停留时间来提高本发明的vhh的功效。可对本文中提供的vhh进行化学修饰，以增加它们的分子量。这种化学修饰(例如使用聚乙二醇(peg)基团进行修饰)还可保护vhh免受蛋白酶的侵害。另一种延长vhh的半寿命期的策略是将vhh偶联到长寿命血清蛋白或靶向这些长寿命蛋白的构件上。此外，已经观察到带负电荷的小蛋白比中性蛋白在循环中能存留更长时间。有多种方法能向蛋白质添加负电荷，包括添加唾液酸聚合物(多聚唾液酸)
或羟乙基淀粉(hesylation)、以及与存在于人绒毛膜促性腺激素(hcg)中的高度唾液酸化的β羧基末端肽(ctp)氨基酸残基融合。最后，“基于fc结构域的融合构建体”也被广泛用于延长治疗性蛋白质(包括vhh)的半寿命期。因此，另一个策略是将本发明的vhh融合到igg分子的fc区或其它fc部分。但是，也可以使用其它fc结构域，例如在小肠环境中更稳定的iga的fc结构域。
[0115]
例如，为了提高亲和力和亲合性，同时便于纯化，将本发明的vhh结构域融合至小鼠igg(更具体地说是小鼠igg2a)的fc结构域，这在本文中又称为vhh-mg融合蛋白。与猪igg或猪iga的fc结构域融合的本发明的vhh也是本发明的一部分，在本文中分别称为vhh-pg或vhh-pa融合蛋白。例如，在图10中提供了适当的fc结构域或其部分。
[0116]
在一个实施方案中，本发明提供了一种嵌合分子，该嵌合分子包含至少一种多肽(尤其是在本文中提供的isvd)和fc区或fc结合部分(尤其是igg或iga fc结构域)，例如包含seq id no:18-21中的任何一个或由其组成的fc结构域。在一个特定实施方案中，本发明提供了一种多肽，该多肽包含含有seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8的isvd；并融合至包含或由以下序列组成的fc结构域：seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20或seq id no:21或其一部分或者与与这些序列具有至少80％、至少85％或至少90％同一性的序列。
[0117]
本发明的多肽(尤其是如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域)在其最广泛的意义上不限于特定的生物来源或特定的制备方法。它们通常可通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的vhh结构域；(2)通过编码天然存在的vhh结构域的核苷酸序列的表达；(3)通过天然存在的vhh结构域的“人源化”或通过编码这种人源化vhh结构域的核酸的表达；(4)通过天然存在的vhh结构域的“突变”减少与预先存在的抗体的结合或通过编码这种突变的vhh结构域的核酸的表达；(5)通过对来自任何动物物种(尤其是来自哺乳动物物种，例如来自人类)的天然存在的vh结构域的“骆驼化”或通过编码这种骆驼化的vh结构域的核酸的表达；(6)通过如本领域中所述的“结构域抗体”或“dab”的“骆驼化”或通过编码这种骆驼化的vh结构域的核酸的表达；(7)通过使用合成或半合成技术制备本身已知的蛋白质、多肽或其它氨基酸序列；(8)通过使用本身已知的核酸合成技术制备编码的核酸，然后表达如此获得的核酸；和/或(9)通过前述的一种或多种方式的任何组合。isvd是通过将常规4链抗体的天然存在的v结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基替换为在重链抗体的vhf结构域中的相应位置出现的一个或多个氨基酸残基而被“骆驼化”的。这可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。这种“骆驼化”取代优选插入在形成和/或存在于vh-vl界面的氨基酸位置，和/或插入在本领域技术人员所公知的并且例如在wo 94/04678以及davies和riechmann的文献[19]中定义的所谓的骆驼科标志残基处。
[0118]
此外，如本领域技术人员所知的，可使用不同的生产平台(例如哺乳动物细胞、酵母、植物等)来生产复杂的组装糖蛋白，例如抗体。基于哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞)的生产方式是直接的抗体生产方式。转基因植物和酵母表达系统也表现出了巨大潜力。酵母(例如komagataella phaffii[20]，以前以旧命名法命名为毕赤酵母，并且这个名称更广为人知)与植物表达系统相比具有生产时间短、成本效益高、基因操控容易和可扩展性高等明显优势。此外，毕赤酵母分泌的内源蛋白质量非常少，因此分泌的重组蛋白质
高度富集，这有利于下游处理。另一方面，与酵母表达平台相比，植物中的重组蛋白的糖基化模式更像动物细胞中的糖基化模式。
[0119]
在一个实施方案中，本发明提供了一种使用酵母(尤其是毕赤酵母)生产多肽(尤其是isvd、更尤其是嵌合分子)的方法。
[0120]
本发明的多价多肽或嵌合分子通常可通过至少包括以下步骤的方法制备：将本发明的isvd和/或单价多肽与一种或多种其它isvd或本文所述的其它化合物适当连接，可选地通过一种或多种适当的接头连接，从而提供本发明的多肽或嵌合分子。本发明的多肽也可通过通常至少包括以下步骤的方法制备：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，并且回收表达的本发明的多肽。这些方法可按本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是显而易见的，例如基于在本文中进一步说明的方法和技术进行。
[0121]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含本文中所提供的核苷酸序列的载体。在本文中所用的术语“载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如腺病毒、aav或杆状病毒载体)、或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或p1人工染色体(pac))。所述载体包括表达载体和克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常包含在特定的宿主生物(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达有效连接的编码序列所必需的期望的编码序列和适当的dna序列。通常，“表达载体”包含核苷酸序列，在该核苷酸序列中，可表达的启动子或调控核苷酸序列与编码mrna的核苷酸序列或dna区域有效连接或相关联，使得调控核苷酸序列能够调控相关核苷酸序列的转录或表达。典型情况下，载体的调控核苷酸序列或启动子不与天然存在的相关核苷酸序列有效连接，因此与有效连接的dna区域的编码序列是异源的。
[0122]
另一个实施方案涉及一种包含本发明所提供的多肽、嵌合分子或核酸序列的宿主细胞或表达宿主。术语“宿主细胞”、“表达宿主”或“宿主”指用于以重组方式(通过基因重组形成)表达所关注的蛋白质或核酸的细胞系统。宿主细胞可涉及通常是细胞培养物的一部分(例如细胞系，例如hek或cho细胞系)的“高等真核细胞”(例如cho细胞系)，虽然并不总是严格要求这样(例如在植物细胞的情况下，植物本身可用于产生重组蛋白)。宿主细胞也可指在本文中所用的“低等真核细胞”，即，丝状真菌细胞或酵母细胞。酵母细胞可来自酿酒酵母属(例如酿酒酵母)、汉逊酵母属(例如多形汉逊酵母)、阿氏酵母属(例如解腺嘌呤阿氏酵母)、耶氏酵母属(例如解脂耶氏酵母)、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母)或komagataella phaffii(毕赤酵母)，并且也可用于本发明。根据一个特定实施方案，所述低等真核细胞是毕赤酵母细胞，在一个最特定的实施方案中，是毕赤酵母细胞。与“原核细胞”相关的宿主细胞通常指非致病性原核生物，例如细菌细胞，例如大肠杆菌、乳球菌和芽孢杆菌属物种。
[0123]
在另一个实施方案中，本发明提供了在本文中提供的isvd、多肽、嵌合分子、核酸、载体、宿主细胞或组合物用作药物的一种用途，更尤其是用于预防、治疗和/或减轻肠道疾病的症状，更尤其是用于针对肠道疾病的口服疫苗接种。在本文中所用的“肠道疾病”指胃肠或肠道感染以及胃肠或肠道的炎症疾病，更具体地说是小肠的炎症疾病(例如炎症性肠病、节段性回肠炎或溃疡性结肠炎)。这种炎症例如可能是由自身免疫性疾病引起的。肠道病原体感染包括选自以下种属的物种的感染：致病性大肠杆菌(etec、ehec、epec、stec等)、
弧菌、弯曲杆菌、梭菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌、劳森氏菌、轮状病毒、志贺氏菌、pedv、隐孢子虫和等孢菌。尤其是，本发明提供了一种通过向受试者施用本发明的多肽、嵌合分子或组合物来治疗和/或预防肠道疾病的方法。在一个实施方案中，通过口服施用。本文中提供的ivsd可作为靶向穿过(胃)肠黏膜的化合物、尤其是生物活性化合物、更尤其是抗原的载体。在一个方面中，本发明集中于作为用于将疫苗靶向输送至肠上皮以诱导强黏膜免疫反应(例如针对肠病原体的免疫反应)的载体的多肽或isvd。在本文中所用的“黏膜免疫反应”指发生在肠、泌尿生殖道和/或呼吸系统的黏膜(即，与外部环境接触的表面)处的免疫反应(体液和细胞反应)。在本发明的背景下，黏膜免疫反应是发生在小肠的黏膜处的肠黏膜免疫反应，尤其是免疫球蛋白a(iga)的产生。本发明还提供了一种通过向受试者口服施用在本文中提供的isvd、多肽、嵌合分子或组合物来治疗受试者的肠道疾病和/或诱导针对肠道病原体的免疫反应的方法。
[0124]
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的isvd、多肽和/或嵌合分子在制备药物组合物中的一种用途。因此，还提供了一种药物组合物及其在本文中所提及的一种或多种治疗方法中的用途。典型情况下，所述药物组合物包含如本文所述的isvd、多肽和/或构建体、以及药学上可接受的载体和/或赋形剂，这些成分可选地与辅助剂组合。
[0125]“载体”或“辅助剂”(尤其是“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的辅助剂”)是本身不会诱导对接收所述组合物的个体产生有害的抗体也不会引起保护的任何适当的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂。“药学上可接受的”指不是在生物学上或其它方面不可取的物质，即，该物质可与化合物一起向个体施用，而不会引起任何不希望的生物效应或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体优选是在与活性成分的有效活性相符的浓度下对患者较无毒且安全的载体，以确保由载体引起的任何副作用不会削弱活性成分的有益效果。优选药学上可接受的载体或辅助剂增强由抗原引发的免疫反应。适当的载体或辅助剂通常包含在以下的非穷尽列表中所包括的化合物之中的一种或多种：代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性的病毒微粒。在本文中所用的术语“赋形剂”意图包括可存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，例如盐、粘合剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、调味剂或着色剂。“稀释剂”(尤其是“药学上可接受的载体”)包括诸如水、盐水、生理盐水溶液、甘油、乙醇等载体。这些载体中可包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、防腐剂。
[0126]
本发明的多肽和嵌合分子以及可选的药学上可接受的载体和/或赋形剂可通过任何适当的途径施用，例如本领域普通技术人员所公知的任何途径。为了进行治疗，可按照标准技术将本发明的药物组合物施用给任何患者。可通过任何适当的方式给药，包括口服给药、肠道外给药、局部给药、鼻内给药、眼内给药、鞘内给药、心室内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药等，优选口服给药。其它制剂技术(例如纳米技术、气雾剂和吸入剂)也在本发明的范围之内。给药的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状况、其它药物的同时给药、禁忌症、以及临床医生要考虑的其它参数。载体、赋形剂和稳定剂的剂量和浓度对于受试者(人、猪、小鼠和其它哺乳动物)应是安全的，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(例如维生素c)、小多肽、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(例如pvp)、氨基酸(例如氨基乙酸盐、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸)；葡萄糖、
二糖和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(例如edta)、糖醇(例如甘露醇、山梨醇)；平衡离子(例如na

)和/或表面活性剂(例如或peg等)。
[0127]
本发明的另一个方面涉及一种生产本发明的apn结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：
[0128]-在适当的表达系统或宿主细胞中(尤其是在毕赤酵母中)表达在本文中提供的多肽或嵌合分子，和
[0129]-纯化或分离所述apn结合多肽。
[0130]
所述表达的多肽的纯化或分离例如指基于亲和力的纯化，例如亲和层析、亲和纯化、免疫沉淀、蛋白质检测、免疫化学、表面展示等，但不限于此，这些都是本领域中所公知的。
[0131]
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明的多肽、嵌合分子或核酸的试剂盒。该试剂盒还可包含试剂的组合，例如缓冲液、分子标签、载体构建体、参考样品物质、以及适当的固体支撑物、细胞、核酸等。这种试剂盒可用于本文中所述的本发明的任何应用。包含含有本发明的apn结合isvd的多肽的固体支撑物或树脂也包括在本发明的范围内。适当的固体支撑物的非限制性实例包括微珠、柱、载玻片、芯片或板。更具体地说，所述固体支撑物可以是微粒状(例如通常用在提取柱中的微珠或微粒)或片状的(例如薄膜或滤片、玻璃或塑料载玻片、微量滴定测定板、检棒、毛细管填充装置等)，可以是扁平、褶皱或中空的纤维或管。使用本领域已知的技术，固定可以是非共价的或共价的。
[0132]
以下实施例示出了根据公开的主题的方法、组合物和结果。这些实施例并非意图包括本文所公开的主题的所有方面，而是旨在示出代表性的方法、组合物和结果。这些实施例并非意图排除对于本领域技术人员来说显而易见的本发明的等同形式和变化形式。
[0133]
实施例
[0134]
材料和方法
[0135]
1.载体、菌株和细胞系
[0136]
为了制备vhh库，使用了pmecs噬菌体展示载体系统，该系统包含pelb信号序列，该信号序列用于在细菌周质中分泌表达的vhh，并在vhh羧基末端增加ha和his6标签，以便能够纯化。使用为了goldenbraid克隆而修饰的酵母表达载体ppiczalphah6e(ncbi登记号km035419.1，命名为pkaigg)在甲醇诱导型aox1启动子的控制下克隆vhh-mg(鼠igg的mg:fc结构域)融合蛋白。该载体包含用于在细菌以及酵母细胞中进行选择的博来霉素抗性标记。分别使用大肠杆菌菌株tg1和dh5α来构建vhh库和融合蛋白表达载体。vhh-mg融合蛋白在毕赤酵母野生型菌株nrrl y-11430(atcc 76273)中表达。如前文所述，通过转染获得了稳定的表达apn的细胞系(猪肠上皮细胞ipec-j2和乳仓鼠肾bhk-21)，并对其进行培养[3，4]。
[0137]
2.肠apn的纯化
[0138]
按照lundqvist、athlin和的文献[21]所述的方法从3周龄仔猪的小肠中分离出肠上皮细胞。在使用光学显微镜分析后，观察到超过85％的肠上皮细胞纯度。接下来，按照melkebeek、rasschaert、bellot、tilleman、favoreel、deforce、de geest、goddeeris和cox的文献[3]所述从肠上皮细胞中分离出刷状缘膜囊泡(bbmv)。随后在9倍体积的裂解缓冲液(100mm tris-hcl、300mm氯化钠、1％triton x-100、
0.5％脱氧胆酸钠、0.1％sds、2mm亮抑酶肽、5mm dtt、1mm aebsf)中裂解所获得的bbmv，在冰上超声处理2分钟，在4℃下旋转30分钟，并在4℃下以17400g的速度离心15分钟。收集上清液，并使用10kda mwco透析盒(thermo scientific)在pbs中透析。按照制造商的建议，通过bca反应测定蛋白质浓度(使用pierce bca蛋白质测定试剂盒)。在-20℃下储存裂解物以备使用。
[0139]
通过免疫沉淀从这些裂解物中纯化肠papn。首先，使亲和纯化的兔抗apn igg(内部)与蛋白a琼脂糖珠(cl-4b，sigma)交联。为此，将50毫克微珠在1毫升蒸馏水中洗涤三次，并通过在400g速度下离心2分钟以去除盐。在室温(rt)下，在1小时内在pbs中向微珠添加兔抗apn igg(4毫克)。接下来，用1毫升0.2m硼酸钠缓冲液(ph＝8.0)洗涤微珠两次，然后在室温下在30分钟内添加1毫升0.2m硼酸钠(ph＝9.0) 20mm庚二亚氨酸二甲酯(dmp，sigma)。在交联后，在1小时内在1毫升0.2m乙醇胺 50mm碳酸氢铵缓冲液(ph＝8.0)中洗涤两次。接下来，在pbs中洗涤微珠三次，然后添加洗脱缓冲液(0.2m甘氨酸-盐酸、50mm l-精氨酸、1m氯化钠(ph＝2.0))以去除未交联的igg。在pbs中再次洗涤微珠三次，并在4℃下储存，以备使用。最后，将抗apn微珠与1毫升bbmv裂解物在旋转轮上在4℃下孵育一整夜。对微珠进行离心(400g，2分钟，4℃)，并收集上清液。用pbs洗涤微珠三次以去除未结合的蛋白质。接下来，在室温下在10分钟内用洗脱缓冲液从微珠上洗脱apn。在离心后，收集上清液，并用1m tris-hcl(ph＝9.0)中和。立即在pbs中对洗脱的apn进行透析，并在-20℃下储存。按照制造商的说明，用pierce bca蛋白质分析试剂盒测定浓度，并通过进行银染色(银染色试剂盒；thermo scientific)来评估纯度(》95％)。
[0140]
3.papn特异性的vhh库的产生
[0141]
如前文所述，apn猪特异性vhh是由比利时布鲁塞尔市的vib纳米抗体核心研究中心开发的。简而言之，在第0、7、14、21和28天对两只美洲驼进行皮下免疫，每次使用320微克(针对每只动物)从猪肾中分离的apn(sigma，分类号l6007-50un)进行。在第35天，使用200微克从猪肠中分离的apn对每只美洲驼进行最后的加强免疫。猪肠apn是如上文所述地纯化的。对于所有免疫接种，使用gerbu p(gerbu biotechnik)作为辅助剂。在第40天，收集抗凝血，用于淋巴细胞制备。使用来自外周血淋巴细胞(pbl)的总rna作为模板，用寡聚脱氧胸苷酸引物合成第一链cdna。使用该cdna，通过pcr扩增vhh编码序列，使用psti和noti消化，并克隆到噬菌粒载体pmecs的psti和noti位点，并以这种方式与组氨酸标签融合。用重组pmecs载体转化电转感受态大肠杆菌tg1细胞。从每只美洲驼获得独立的vhh库，并在稳定转染的表达papn的bhk-21细胞上对每个vhh库进行淘选(在溶液中)。然后将来自两个库的第一轮淘选的噬菌体输出合并，并将合并的库用于进一步的淘选。从第二轮和第三轮淘选中随机选择190个菌落(每轮95个)进行测序，然后基于它们的cdr3序列进行分组。使用周质粗提物，使用表达papn的bhk-21细胞通过流式细胞术分析28个独特的vhh序列对papn的特异性。
[0142]
4.vhh-mg融合蛋白表达载体的构建
[0143]
为了在酵母表达载体pkaigg中克隆电子设计的vhh-mg融合蛋白，从sgi-dna(美国加利福尼亚州的la jolla)获得为设计的定制试剂，sgi-dna是合成产生的融合到小鼠igg2a的fc尾端的编码vhh的序列的dna片段(铰链-ch2-ch3；ncbi登记号kc295246.1)，在插入片段与载体之间有40个碱基重叠。使用sapi消化适于golden gate克
隆的表达载体pkaigg，并进行柱纯化(genejet pcr纯化试剂盒，thermofisher分类号k0701)。该vhh片段总是与相同的fc片段组装在一起，并在5’端框内克隆有α因子分泌信号序列(来自名称为ppiczh6e的新毕赤酵母表达载体；genbank登记号km035419)，在3’端克隆有转录终止序列，通过bioxp
tm 3200系统在大约18小时的反应时间内插入到内部sapi消化的pkaigg载体中，并转化到大肠杆菌dh5α中。在质粒制备和插入序列确认后，用pmei线性化载体转化酵母细胞，并在补充有50毫克/毫升博莱霉素(invitrogen)的ypd(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％右旋葡萄糖)上选择阳性转化株。
[0144]
5.在毕赤酵母中产生vhh-mg融合蛋白
[0145]
首先在2毫升培养基中分析vhh-mg融合蛋白在培养基中的表达和分泌。在第一天，将各个转化体接种到2毫升含有25毫克/毫升博莱霉素的bmgy培养基(1％细菌酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.1m磷酸钾(ph＝6)、1％甘油)中，并在28℃下在振荡的同时培养48小时。对于每种vhh-mg构建体，在24孔板中培养四个独立的转化体。然后将细胞在1500g下沉淀10分钟，并重悬在2毫升bmmy培养基(1％细菌培养用酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.1m磷酸钾(ph＝6)、1％甲醇)中，以诱导vhh-mg的表达。在28℃下在振荡的同时对培养物培养48小时，每12小时加入1％甲醇(体积比)。在诱导48小时后，使酵母细胞沉淀，并通过sds-page、蛋白免疫印迹分析和elisa分析上清液，以评估分泌的vhh-mg融合蛋白在培养基中的积累水平。
[0146]
6.vhh-mg合蛋白的亲和纯化
[0147]
使用与上述2毫升培养物相似的生长和诱导条件，选择产生高水平vhh-mg的酵母转化体，用于在1升培养物中倍增。在诱导48小时后，收获在挡板烧瓶中生长的毕赤酵母培养物。使用0.22μm pes膜滤器(millipore)过滤培养物上清液，并在1毫升hitrap mabselect sure蛋白a柱(ge healthcare)上亲和纯化，并用20mm磷酸钠、300mm氯化钠缓冲液(ph＝7.8)平衡。用1m精氨酸(ph＝2.7)洗脱结合的蛋白质，并立即用1m tris(ph＝9)中和。合并具有高浓度vhh-mg的相关级分，并进行尺寸排阻色谱分析(superdex 200，ge healthcare)。合并在色谱图中包含主抗体峰的级分，通过针对pbs中的20％聚乙二醇透析进行浓缩，并在-80℃下储存以备使用。蛋白质浓度是通过od280测量确定的。
[0148]
7.sds-page和蛋白免疫印迹分析
[0149]
在还原条件下，按照制造商的说明在商售4-20％梯度凝胶(bio-rad)上分析vhh-mg融合蛋白(粗制/纯化)，并用coomassie g-250染色。对于蛋白免疫印迹分析，使用半干转移法(bio-rad)将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。在4℃下，用pbst中的2％脱脂牛奶(pbs 0.1％(体积比)tween-20)封阻印迹膜一整夜。然后，用与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗小鼠igg(ge healthcare，nxa931)探查上述膜，在封阻溶液中按1:2000比例稀释，并在室温下孵育1小时。然后用pbst洗涤该膜三次，通过添加hrp底物(westernbright ecl，advansta)使条带可见。使用chemidoc mp成像系统(bio-rad)对膜进行成像，并通过imagelab软件(bio-rad)进行分析。
[0150]
8.抗原结合elisa
[0151]
使用在pbs中稀释的400纳克apn(sigma)在37℃下包被96孔elisa板2小时。然后用pbst洗涤该板三次，并使用在pbs中制备的3％(重量/体积)明胶和0.05％tween-80在4℃下封阻一整夜。在用pbst洗涤三次后，将vhh-mg融合蛋白在稀释缓冲液(2％脱脂乳 pbs
0.05％tween-20)中连续稀释，添加到每个孔中，并室温下孵育1小时。使用内部产生的papn特异性mab(imm013，参见参考文献[4])作为阳性对照物，并使用与鼠igg3(gbp-mg)融合的gfp特异性vhh用作阴性对照物[23]。在洗涤后，使用在稀释缓冲液中按1:5000比例稀释的抗小鼠igg(ge healthcare，nxa931)检测结合的vhh-mg融合蛋白。在室温下孵育1小时后，用pbst洗涤板三次，并通过添加hrp底物(将一片sigmafast
tm opd溶解在20毫升去离子水中)进行显影。最后，用1m盐酸终止反应，在492纳米波长下测量比色反应的光密度(versamax
tm
)。
[0152]
9.流式细胞术
[0153]
使用流式细胞术分析不同vhh-mg融合蛋白与表达apn的细胞系的结合。培养野生型和apn转染的ipec-j2和bhk-21细胞系，直至达到90％汇合度，并使用stempro accutase(gibco)分离。将分离的细胞(3.0
×
105)转移到锥形底96孔微量滴定板(gibco)中的200微升培养基中，并在350g和4℃条件下离心3分钟。将细胞与2微克/毫升vhh-mg融合蛋白或抗apn mab(克隆体imm013)在冰上孵育30分钟。使用af647缀合抗小鼠igg2a抗体(4微克/毫升；invitrogen，a21241)检测结合的vhh-mg融合蛋白，对于imm013，使用af647缀合抗小鼠igg1抗体(4微克/毫升；invitrogen，a-21240)进行检测。将细胞在冰上孵育30分钟。使用sytox蓝染色(5nm；分子探针)排除死细胞。对于每种条件，测量总共10000个存活的单细胞(cytoflex，beckman coulter)。
[0154]
10.vhh-mg胞吞作用试验
[0155]
将表达apn的bhk-21细胞接种在无菌盖玻片上的24孔板(1毫升中含1.0
×
105个细胞)中，并进行培养，直到形成单层。用冰冷的pbs洗涤细胞两次，并在冰上储存，然后向置于冰冷的培养基中的细胞添加vhh-mg融合蛋白或imm013(250微升；100微克/毫升)。在4℃下孵育30或60分钟后，用冰冷的pbs洗涤细胞两次，并在37℃、含有5％co2的温暖培养基中孵育30分钟。在使用pbs洗涤两次后，用500微升4％多聚甲醛在室温(rt)下固定细胞10分钟。接下来，在室温和避光条件下，使用af568缀合抗小鼠igg(h l)(2微克/毫升；invitrogen，a-11004)检测30分钟，以检测在细胞膜上是否存在vhh-mg或imm013。在用pbs 1％fcs洗涤三次后，用250微升0.2％triton-x100渗透细胞2分钟，然后用pbs 1％fcs再次洗涤。然后，在室温下和避光条件下，使用fitc缀合抗小鼠igg(1/50；整个分子)(sigma，f2883)对vhh-mg和imm013检测30分钟。通过hoechst(1/100稀释)染色使细胞核可见。在洗涤三次后，取出盖玻片，并在固定溶液(防褪色剂1,4-重氮双环-2,2,2-辛烷-dabco
tm
)中固定在显微镜载玻片上。用共焦显微镜(leica)获取图像。
[0156]
11.抗apn vhh-mg的体内摄取
[0157]
如前文所述[24]，使用三只5周龄的雌性仔猪来评估vhh-mg在肠结扎环中的摄取。简而言之，在麻醉和剖腹手术后，找到空肠，形成六个3厘米的环，环之间的间隔是10厘米，以避免出现派伊尔淋巴结。通过在肠系膜弓之间放置结扎线来保证血液供应。使用papn特异性mab(imm013，参见参考文献[4])作为阳性对照物，并使用gbp-mg作为阴性对照物[24]。将抗apn mab imm013(1毫克)或等摩尔量的不同vhh-mg稀释在3毫升pbs中，并注射到环的内腔中。在注射后，将每个环放回腹腔，并封闭腹部。在孵育5小时后，用过量的戊巴比妥钠对动物实施安乐死，并从肠、环和肠系膜淋巴结收集组织样品。将组织样品埋置在2％mc(fluka)中，在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存以备使用。所有动物处理
程序都是由根特大学兽医学院伦理委员会核准的(ec 2018-04)。
[0158]
12.免疫组织化学分析
[0159]
用leica cm3050 s低温恒温器切割从3周龄仔猪或肠环获得的猪回肠的冷冻切片(8微米)，将冷冻切片安装在包被有apes的载玻片上，干燥(30分钟，40℃)，并在-20℃下在丙酮中固定10分钟。随后，将冷冻切片在氯化铵缓冲液(50mm，ph＝8)中孵育30分钟，并彻底洗涤。所有洗涤步骤都是在室温下在pbs中进行的。使用含有10％绵羊或山羊血清的pbs在37℃下封阻fc受体30分钟。通过使用fitc缀合绵羊抗鼠igg(10微克/毫升；sigma；f2883)或山羊抗鼠igg2a在37℃下孵育1小时来检测vhh-mg或imm013的结合。使用hoechst(10微克/毫升)对细胞核进行复染色。为了评估胞吞作用，使用兔光谱细胞角蛋白抗体(abcam，ab9377)对切片染色，并使用texasred缀合抗兔igg检测。将切片在超纯水中洗涤，并在固定溶液(dabco)中固定。用安装有scion公司的摄像头的leica dc 100荧光显微镜或leica共焦显微镜对组织进行成像。使用fiji对图像进行分析和处理。
[0160]
13.口服免疫实验
[0161]
所有动物处理程序都是由兽医学院伦理委员会核准的(ec 2018-51)。对来自比利时农场的12头常规饲养的仔猪(比利时长白猪
×
皮特兰猪)在3周龄时断奶，并运送到我们的设施。在实验开始前，用硫酸粘杆菌素(100.000u.i./公斤动物体重)处理动物5天。口服免疫实验的设计如图6所示。将动物随机分为三组：小鼠igg2a对照组和接受apn特异性vhh-mg 2l65或3l94的两组。连续三天对动物进行口服免疫，然后在初次免疫后第14天进行加强免疫。通过在每次免疫前24小时施用奥美拉唑(20毫克/只动物)来阻断胃中的盐酸产生，并且在免疫前12小时不给动物喂食。用1毫克3l94-mg、2l65-mg或等摩尔量的无关小鼠igg2a(美国西莱巴嫩市的bio x cell)辅以50微克霍乱毒素(merck，参考号c8052)对动物进行口服免疫。在初次免疫(ppi)后的第0、9、14、21和28天采集血液，以分析引发的免疫反应。在第28天，通过静脉注射20％戊巴比妥钠(60毫克/2.5公斤；kela)对动物实施安乐死，并在放血后收集小肠组织样品。
[0162]
14.小鼠igg2a elisa
[0163]
从颈静脉取血到凝胶和凝块活化剂管(vacutest，kima)中。在室温下孵育1小时后，对该管进行离心，收集血清，并在56℃下灭活30分钟。将血清样品在-20℃下储存，以备使用。
[0164]
在37℃下在pbs中以6微克/毫升的浓度将内部生产的小鼠igg2a单克隆抗体包被在96孔微量滴定板(polysorp；life technologies)上2小时。在补充有0.2％tween-80和3％bsa的pbs中在4℃下封阻一整夜后，将稀释的血清样品(在稀释缓冲液中以1:10倍率开始稀释)加入孔中。在37℃下孵育1小时后，洗涤该板，并在37℃下与hrp缀合小鼠抗猪igg(mt424，1/1000；瑞典nacka strand市的mabtech)或hrp缀合羊抗猪iga(1/10.000；bethyl；美国德克萨斯州蒙哥马利市)一起孵育1小时。在三个洗涤步骤后，添加2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)底物，在37℃下孵育45分钟后，使用分光光度计(tecan spectrafluor)以405纳米波长测量光密度。
[0165]
15.elispot
[0166]
打肝素并从仔猪的颈静脉取血，使用(挪威奥斯陆市的alere technologies)通过密度梯度离心分离pbmc。在氯化铵溶液中溶解红细胞。在冰冷的pbs
1mm edta中将所得的pbmc级分洗涤两次，然后重悬于补充有1％青霉素(100iu/毫升)、链霉素(100微克/毫升)和卡那霉素的ctl-test btm(美国克利夫兰市的cellular technology limited)中，达到1
×
107细胞/毫升浓度。从肠系膜淋巴结(mln)、空肠派伊尔淋巴结(jpp)、空肠固有层(jlp)、回肠派伊尔淋巴结(ipp)和回肠固有层(ilp)分离单核细胞(mc)，并按照之前所述的方法进行处理[25]。将分离的mc重悬于白细胞培养基(含有10％胎牛血清、1mm丙酮酸钠、2mm l-谷氨酰胺、青霉素(100iu/毫升)、链霉素(100微克/毫升)和非必需的氨基酸(1％)的rpmi-1640(gibco))中，并计数。
[0167]
用70％乙醇活化多滤网过滤板(96孔形式，maipa4510，millipore)，用超纯(up)水洗涤，并在4℃下用10微克/毫升小鼠igg2a包被一整夜。在洗涤后，在37℃下使用ctl-test b培养基将板孵育2小时。将来自每种组织的单核细胞加入孔中(2.5
×
105/孔)，并在37℃下在湿润的5％co2气氛中孵育18小时。然后通过用含有0.1％tween-20的pbs强烈洗涤以去除细胞。在洗涤后，向测定缓冲液(含有0.1％tween-20和0.1％bsa的pbs)中添加hrp缀合抗猪igg(mt424，1/1000；mabtech)或iga(1/10.000；bethyl laboratories)，并在室温下孵育1小时。最后，在3个洗涤步骤后，向孔中添加用于成膜的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物(sigma)。通过用超纯水强烈洗涤来停止反应，并使板在4℃下干燥一整夜。使用免疫斑点读取器(luminoskan)获取图像。基于尺寸区分手动计数斑点。
[0168]
16.竞争试验
[0169]
流式细胞术
[0170]
使用基于流式细胞术的竞争试验来确定vhh是否识别apn上的相似表位。培养apn转染的bhk-21细胞系，直至达到90％汇合度，并用stempro accutase(gibco)分离。将分离的细胞(3.0
×
105)转移到200微升培养基中的锥形底96孔微量滴定板(gibco)中，并在350g和4℃条件下离心3分钟。接下来，首先在冰上将bhk-apn细胞与40微克/毫升浓度的2l65、3l2、3l73 vhh-mg或阴性对照物一起孵育30分钟。在用pbs 1mm edta洗涤后，在冰上将细胞与2微克/毫升浓度的第二种标记的2l65、3l2、3l73 vhh-mg(alexafluor405小鼠igg2a zenon标记试剂盒)孵育30分钟。在用pbs 1mm edta洗涤后，用流式细胞仪(cytoflex，beckman coulter)分析细胞。使用碘化丙锭染色排除死细胞。对于每种条件，测量总共10000个存活的单细胞(cytoflex，beckman coulter)。
[0171]
生物层干涉测量
[0172]
使用生物层干涉测量法在环境温度下进行表位鉴定测量(bli；octet red96)。在此，将pbs中的10微克/毫升生物素化猪apn(sigma)结合在浸泡在pbs中的高精度链霉亲和素(sax)生物传感器上，随后在pbs 0.2％tween-20 1％bsa(pbst bsa)中添加500nm的vhh。接下来，在pbst bsa中添加250nm的2l65 vhh。用高通量表位鉴定软件分析数据。
[0173]
elisa
[0174]
使用在pbs中稀释的400纳克apn(sigma)在37℃下包被96孔elisa板2小时。然后用pbst洗涤该板三次，并使用在pbs中制备的3％(重量/体积)明胶和0.05％tween-80在4℃下封阻一整夜。在用pbst洗涤三次后，在稀释缓冲液(2％脱脂乳 pbs 0.05％tween-20)中以饱和浓度向每个孔中添加vhh-mg融合蛋白，并在室温下孵育1小时。在洗涤后，向每个孔中添加处于稀释缓冲液中的10微克/毫升浓度的生物素化2l65vhh，并在室温下孵育1小时。通过在稀释缓冲液中以1:5000倍率稀释的链霉亲和素-hrp(thermofisher scientific)检测
结合的生物素化2l65 vhh。在室温下孵育1小时后，用pbst洗涤板三次，并通过添加hrp底物(将一片sigmafasttm opd溶解在20毫升去离子水中)进行显影。最后，用1m盐酸终止反应，在492纳米波长下测量比色反应的od(versamaxtm)。
[0175]
17.统计分析
[0176]
使用graphpad prism 6分析数据。使用双向anova和dunnett检验进行多重比较，以分析血清抗体水平和循环抗原特异性抗体分泌细胞的数量。使用t检验和holm-sidak进行多重比较，以分析肠抗原特异性抗体分泌细胞的数量。将显著性水平设定为0.05。
[0177]
结果
[0178]
1.apn特异性vhh库的构建
[0179]
为了制备抗apn vhh库，用市售的肾papn对两只美洲驼免疫五次。使用由相同的基因编码的肠papn进行第六次加强免疫，并按照“材料和方法”一节中说明的方法制备。构建了两个独立的vhh-噬菌体展示库，每个库包含大约108个转化体。在对表达猪氨肽酶n的稳定转染的bhk21细胞进行连续两轮淘选后，随机选择190个克隆体并测序。通过比对，将在其cdr3区(b细胞谱系)中具有80％以上的序列同源性的vhh归类为一个家族，因为它们最有可能识别相同的表位(参见参考文献[26])，但是它们的特性(例如亲和力、表达量、稳定性等)可能有所不同。通过这种方式，我们获得了属于14个不同家族的28种独特的vhh，作为apn的候选结合物(图4)。这28种独特的vhh是在大肠杆菌细胞中产生，并且通过流式细胞术对周质粗提物对于表达papn的bhk21细胞的结合特异性进行了分析。亲代未转染的bhk-21细胞用作阴性对照细胞。一种不相关的vhh(对细菌β-内酰胺酶特异的bcii10，由conrath等人的文献[27]说明)和一种小鼠抗apn mab imm013[4]分别用作阴性对照物和阳性对照物。这种差异facs分析证实了最初28种筛选出的不同vhh中的22种属于对猪apn特异的11个不同家族，证明了在papn转染的细胞上进行的库淘选高度富集了apn结合vhh克隆体(图4)。
[0180]
2.通过bioxp dna打印机构建vhh-mg表达载体
[0181]
由于对apn转染的bhk-21细胞的淘选的facs分析是用粗周质提取物进行的，因此必须用纯化的蛋白质进一步分析不同vhh的结合质量，以允许在不同vhh之间进行比较，并在facs分析中排除任何实验变量，例如纳米抗体表达、周质提取效率等(图4)。重要的是要认识到，一些vhh可能在vhh序列中含有琥珀终止密码子，因为具有c末端组氨酸标签的vhh库是在将琥珀终止密码子(tag)读作谷氨酰胺(q)的抑制型大肠杆菌菌株tg1中制备的。因此，在通过测序识别出琥珀密码子时，它也被谷氨酰胺密码子取代。
[0182]
传统上，所选择的vhh在非抑制型大肠杆菌菌株中与亲和标签直接融合进行亚克隆，但在此我们采用了一个新的策略。我们对与fc片段直接融合的vhh进行了亚克隆，以在毕赤酵母的培养基中产生融合蛋白，这具有以下优点：fc可用作蛋白质纯化的亲和标签，它使vhh-fc融合二价体提供亲合效应，并允许与作为阳性对照物的小鼠单克隆抗体imm013进行apn结合的比较。将28种选定的vhh融合至小鼠igg2a的fc结构域，并克隆到内部毕赤酵母表达载体中。使用分别对产肠毒素大肠杆菌的f4和f18菌毛有特异性的两种不相关的vhh(v2[28]和d3[29])作为阴性对照物。
[0183]
使用bioxp
tm 3200系统合成了vhh和fc结构域的序列，并将其转化到酵母表达载体中(图1a)。将使用bioxp dna打印机成功构建的所有30种构建体(具中有28种选定的vhh和2种阴性对照物)转化到大肠杆菌中，并通过菌落pcr或限制性消化对每种构建体分析4个菌
落，然后测序以识别具有正确插入片段的克隆体。通过仅对一个菌落测序，得出在30种构建体中有23种(77％)产生了无错克隆体，而对于其它7种vhh-mg构建体，必须分析两个菌落以获得正确的克隆体；仅对于一个克隆体(即，2l58mg(3％))来说，在所有四个菌落中的序列仍然是不正确的，在编码序列中具有一个突变(图1b)。巧合的是，这个来自家族12的错误克隆体在vhh库制备期间的淘选中也是阴性的(图4)。因此，我们在进一步的分析中忽略了它。
[0184]
3.酵母产生的vhh-mg融合蛋白能高效结合全长的表面表达的apn
[0185]
然后将获得的29种编码vhh-mg的构建体转化到毕赤酵母中，对于每种构建体，筛选四个单独的酵母菌落以识别在培养基中产生最高的vhh-mg积累量的转化体。因此，通过sds-page和蛋白免疫印迹分析对等量的上清液进行了分析，以研究重组蛋白信号的强度和蛋白的完整性(图5)。仅对于最佳表达的构建体来说，在sds-page之后能观察到一个条带；但是对于大多数构建体来说，在蛋白免疫印迹分析后，在预期的分子量处明显存在一个条带。使用纯化的v2-mg和d3-mg参考蛋白测定在毕赤酵母中产生的不同vhh-mg的浓度，基于imagelab软件的分析，在2毫升培养物中，该浓度是4-60毫克/升。仅对于一些融合蛋白(例如3l11mg(家族10)，2l22mg(家族5)和v2-mg)来说，除了全长产物外，还检测到降解产物，这表明vhh对vhh-mg融合蛋白的稳定性有影响，正如在vhh-iga融合蛋白的情况中也看到的那样[30]。
[0186]
接下来，我们在肾apn特异性elisa中测定了vhh-mg融合蛋白的结合特异性(图2a)。用抗小鼠igg探查培养上清液中的vhh-mg的三倍稀释系列。三种最强的vhh-mg(即，2l48mg、3l94mg和2l76mg)显现出对固化定的apn的强结合活性，每种属于不同的cdr3组。这三种vhh-mg在进行淘选以筛选噬菌体展示的vhh之后进行的facs分析中也显现出良好的结合性(图4)。但是，有趣的是，一些vhh-mg融合蛋白家族在elisa中是完全阴性的，例如家族4(2l63-mg、2l69-mg)，而它们在facs分析中是强结合物(图4)。因此，需要说明的是，在elisa试验中在apn包被的孔上的相对结合活性与vhh-mg融合蛋白对细胞表达的apn的亲和力不相关。应说明的是，vhh筛选是通过facs使用在其表面上表达apn的细胞进行的，因此在固定的apn上的结合可能不同于在细胞上的结合，这可能是因为表位在固定过程中变得不太容易接近。此外，由于实验是用粗制培养基样品进行的，在该粗制培养基样品中vhh-mg蛋白质积累不平衡，因此elisa信号可能与培养基中的蛋白质浓度有关，而不是与亲和力有关。(图2a，图4)。
[0187]
通过流式细胞术使用等量的vhh-mg蛋白进一步评估了vhh-mg融合蛋白相对于衍生的转染的apn表达细胞系(bhk21和ipec-j2)在亲代细胞系上的结合特异性和亲和力(图2b)。应说明的是，ipec-j2是在其表面上表达低水平的apn的猪小肠上皮细胞系，因此，仅使用稳定转染的细胞。基于通过蛋白免疫印迹分析测定的相对vhh-mg浓度，将等摩尔量的vhh-mg蛋白和阳性对照物(imm013)掺入毕赤酵母的废培养基中。通过流式细胞术基于与vhh-mg结合的细胞的数量确定了多种强apn结合物，但未观察到用过的培养基与未转染的bhk21/ipec-j2细胞的结合。有趣的是，在apn特异性elisa中为阴性的家族4(2l63和2l69)在基于细胞的结合试验中被证明含有强结合物(图2b，图7)。这些发现与在vhh库筛选期间从粗周质提取物中获得的facs数据一致(图4)。我们发现，与bhk21-apn相比，ipec-j2-apn细胞上的结合活性的幅度明显较低，这可能与ipec-j2细胞膜上表达的apn的量有关。
[0188]
我们从在流式细胞术筛选中表现出结合活性的家族中选择至少一种克隆体(不包
括家族6、10、11和14：家族6、11和14不含任何apn结合vhh；家族10(3l11)表现出降解并且仅有很低的结合强度)以通过免疫组织化学(ihc)方法进一步评估它们对小肠组织的亲和力。基于它们的结合活性，选择并纯化了一些克隆体以进行体内分析。从进一步分析中略去了产量低的克隆体，例如2l76-mg、2l34-mg和2l52。因此，仅选择包含强结合物(1，4，8，9；大约100000mfi)和中等结合物(5，12；高于200000mfi)的六个家族用于扩增。每种vhh-mg显现出与回肠的结合，而所有的对照物都是阴性的，并且未显现出背景；此外，在facs分析中，信号强度与结合活性相关联(图2b)。
[0189]
4.纯化的apn结合的vhh-mg融合蛋白被肠上皮细胞内化
[0190]
对于每个家族，选择在废毕赤酵母培养基中表现出高表达和分泌能力并在facs中表现出强结合能力的单个vhh-mg融合蛋白用于扩增。在蛋白a上对分泌的vhh-mg融合蛋白进行亲和纯化，并通过尺寸排阻色谱(sec)进一步评估(图3a)。对于大多数融合蛋白，sec图谱显现两个主峰，其中一个代表聚集体和多聚体，另一个代表具有两个相关联的vhh-mg多肽的相应分子量的单体。2l76 vhh-mg的主要部分是在聚集体中发现的；因此，我们将其排除在进一步分析之外(数据未显示)。
[0191]
对于剩余的六种融合蛋白，将与单体vhh-mg对应的级分合并，并在还原和非还原条件下通过sds-page进一步分析，以验证二聚化。由于sec图谱中的单体和聚集体的峰略有重叠，因此合并的纯化vhh-mg仍含有少量聚集体。非还原凝胶上的样品清楚显现出80kda的条带(图3b)，这与由两个40kda的vhh-mg多肽组成的单体vhh-mg对应，如在还原条件下在sds-page中所示。此外，还观察到一些最有可能代表聚集体或聚糖变体的高分子量条带。
[0192]
接下来，我们在elisa和facs中测试了不同纯化的vhh-mg融合蛋白的结合特性(分别是图5a和5b)。使用与鼠igg3(gbp-mg)融合的gfp特异性vhh用作阴性对照物[23]。虽然所有六种选定的融合蛋白都表现出对表达apn的细胞的强结合，但是在elisa中在固定抗原上的结合效率变化很大，正如使用粗样品观察时的那样(图4)。
[0193]
由于潜在疫苗携带系统的靶细胞群的高效胞吞作用对于获得强免疫反应非常重要，因此我们进一步研究了结合apn的vhh-mg融合蛋白是否显现出由细胞通过apn受体进行的特异性摄取。我们使用表达apn的bhk21细胞，因为它们在facs中具有很强的vhh-mg结合能力(图5b)。用不同的荧光分子对vhh-mg蛋白染色，以区分与膜相关联的vhh-mg和通过apn受体内化的vhh-mg。共焦成像清楚地证明了vhh-mg融合蛋白的apn依赖性摄取，因为没有观察到无关的vhh-mg融合蛋白的摄取。发现三种vhh-mg融合蛋白(3l94-mg、2l65-mg和2l48-mg)是最有效的apn结合物，它们仅在表达apn的细胞中显现出清晰的摄取信号。
[0194]
如图11所示，通过胞吞分析还证实了3l2和3l73 vhh触发了类似于2l65 vhh的内化。
[0195]
5.在肠结扎环试验中选定的apn特异性vhh-fc候选物的体内行为为了评估选定的vhh-fc igg构建体的体内行为，我们在仔猪的小肠(空肠)中进行了肠结扎环试验。3l94-mg和2l65-mg能够结合绒毛的整个顶端上皮。相比之下，2l48和2l22表现出较参差不齐的结合模式。能够看出，在不同动物中的结合模式是相似的。此外，3l94-mg和2l65-mg被肠上皮细胞以与imm013相似的方式内吞。基于肠结扎环试验中的这种体内行为，我们得出结论：3l94-mg和2l65-mg是将抗原靶向小肠上皮的最适当的候选物。表3给出了这些单域抗体的cdr1-3区的特征。
[0196]
表3
[0197][0198]
6.用apn特异性vhh-fc口服免疫引发循环和小肠免疫反应
[0199]
为了进一步证明选定的vhh-mg作为疫苗输送系统的潜力，对仔猪进行口服免疫实验，并分别通过elisa和elispot检测小鼠fc igg2a特异性血清抗体反应和抗体分泌细胞，以评估随后的全身和小肠免疫反应。图6b表明，与对照组相比，在口服2l65-mg后，小鼠fc igg2a-特异性igg和iga血清水平显著提高。令人惊讶的是，3l94没有促进小鼠fc igg2a特异性血清抗体反应。此外，与第0天和对照组相比，在初次免疫后21天时，用2l65-mg口服免疫显著增加了循环小鼠fc igg2a特异性iga分泌细胞的量(图6c)。这些结果表明，apn特异性vhh-mg在给仔猪口服后促进了系统免疫。为了进一步表明肠道免疫反应也得到增强，我们通过elispot评估了小鼠fc igg2a特异性抗体分泌细胞在不同小肠组织中的存在。如图6d所示，在28dppi时，只有2l65-mg显著增加了肠系膜淋巴结和回肠固有层以及派伊尔淋巴结中的小鼠fc igg2a特异性iga分泌细胞的数量。综上所述，这些结果表明，口服2l65-mg能引发仔猪的全身和小肠免疫反应。
[0200]
7.竞争试验
[0201]
这个基于流式细胞术的竞争试验用于确定vhh是否识别apn上的相似表位。如表4所示，每个vhh拦阻其它vhh与bhk-apn细胞的结合，这表明这些vhh是与非常相似的表位结合的竞争性vhh。
[0202]
表4：基于流式细胞术的竞争试验。数据表示为减去对照值后的中值荧光强度。
[0203][0204]
总而言之，本发明提供了一个不仅结合apn表达细胞而且触发穿过小肠上皮的输运的具有高度序列相似性的vhh家族(2l65、3l2、3l73)。此外，所述vhh家族具有能够在口服给药后诱导全身和肠道iga反应、尤其是诱导抗原特异性iga b细胞的独特特征。
[0205]
参考文献
[0206]
[1]v.snoeck,w.van den broeck,v.de colvenaer,f.verdonck,b.goddeeris,e.cox,“f4受体阳性猪的绒毛和圆顶上皮细胞对f4菌毛的胞吞作用支持受体依赖性胞吞作用在口服免疫策略中的重要性”，《vet.immunol.immunopathol.》，124(2008)29-40。
[0207]
[2]b.devriendt,b.g.de geest,b.m.goddeeris,e.cox,“穿越屏障：靶向上皮受体以增强口服疫苗输送”，《j.control.release》，160(2012)431-439。
beuckelaer,s.de buck,n.callewaert,a.depicker,“拟南芥、本生烟和毕赤酵母中的vhh-fc抗体产生的比较”，《plant biotechnol.j.》，13(2015)938-947。
[0229]
[24]a.coddens,m.loos,d.vanrompay,j.p.remon,e.cox,“蔓越莓提取物抑制f4和f18 748大肠杆菌对猪肠上皮的体外粘附并减少受到f18 749产毒大肠杆菌口服攻击的猪的体内排泄”，《vet.microbiol.》,202(2017)64-71。
[0230]
[25]b.devriendt,m.gallois,f.verdonck,y.wache,d.bimczok,i.p.oswald,b.m.goddeeris,e.cox,“食品污染物伏马菌素b(1)减少猪cd11r1( )肠道抗原呈递细胞的成熟和抗原特异性免疫反应，导致持久的肠道etec感染”，《vet res》,40(2009)40。
[0231]
[26]e.de genst,f.handelberg,a.van meirhaeghe,s.vynck,r.loris,l.wyns,s.muyldermans，“骆驼单结构域抗体的亲和成熟的化学基础”，《j.biol.chem.》,279(2004)53593-53601。
[0232]
[27]k.e.conrath,m.lauwereys,m.galleni,a.matagne,j.-m.fr
è
re,j.kinne,l.wyns,s.muyldermans,“从源自骆驼科的单结构域抗体片段衍生的β-内酰胺酶抑制剂》，《antimicrob.agents chemother.》,45(2001)2807-2812。
[0233]
[28]v.virdi,a.coddens,s.de buck,s.millet,b.m.goddeeris,e.cox,h.de greve,a.depicker,“口服种子生产设计师igas保护断奶仔猪免受产肠毒素大肠杆菌感染”，《proc.natl.acad.sci.usa》,110(2013)11809-11814。
[0234]
[29]k.moonens,m.de kerpel,a.coddens,e.cox,e.pardon,h.remaut,h.de greve,“纳米抗体介导的表达f18菌毛的大肠杆菌的附着抑制”，plos one,9(2014)e114691。
[0235]
[30]s.bakshi,a.depicker,b.schepens,x.saelens,p.juarez,“鼠iga中的双氨基酸突变支持对葡萄球菌超抗原样蛋白7进行下游加工和纯化”，j.768 biotechnol.,294(2019)26-29。