1.本发明关于一种发酵物，特别是关于一种普洱茶及金桔发酵液用于制备降脂或稳定血糖的组合物之用途。
背景技术：
：：2.基于消费者对于人工合物或添加物的疑虑日益增加，故而有机及天然的饮食概念更为受到欢迎。生技公司及食品业者积极投入关于天然产物的相关产品之研发。3.在各项对身体健康有帮助的科学验证基础上，针对不同植物的活性成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。产品开发的项目是藉由天然植物改善或提升身体机能，如减重、美白、肠胃保健、生酮饮食等。4.其中，新陈代谢过低、体脂过高更是现代人常见的健康危害，而新陈代谢过低、体脂过高等可能进一步导致高血脂、脂肪肝、高血糖等多种病变。技术实现要素：5.在一些实施例中，一种青饮茶发酵物的用途是用于制备稳定血糖的组合物，上述青饮茶发酵物由普洱茶与金桔的水浸提液经酵母菌、乳酸杆菌及醋酸菌发酵而制得。6.在一些实施例中，青饮茶发酵物可以提升glut4基因的表现量。7.在一些实施例中，青饮茶发酵物可以提升glut4蛋白的含量。8.在一些实施例中，一种青饮茶发酵物的用途是用于制备减少细胞内脂肪堆积的组合物，上述青饮茶发酵物由普洱茶与金桔的水浸提液经酵母菌、乳酸杆菌及醋酸菌发酵而制得。9.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含以下至少一成分：可可碱(theobromine)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)、没食子酸(gallicacid)、牡荆素(vitexin)、柠檬苦素(limonin)。10.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素和柠檬苦素。11.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含至少130ppm的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素。12.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、川陈皮素(nobiletin)、橘红素(tangeretin)、奎尼酸(quinicacid)、柠檬苦素、橙皮素(hesperetin)、柚皮素(naringenin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)及环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。13.在一些实施例中，青饮茶发酵物的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量相对于普洱茶与金桔的水浸提液的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量提升169％。14.在一些实施例中，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261ppm。15.综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。16.以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。附图说明17.图1是总皂苷含量实验结果图。18.图2是glut4基因相对表现量结果图。19.图3是glut4蛋白相对含量结果图。20.图4是相对脂肪累积量结果图。21.图5是tci-cjt-10的氢-核磁共振光谱。22.图6是tci-cjt-01的氢-核磁共振光谱。23.图7是tci-cjt-04的氢-核磁共振光谱。24.图8是tci-cjt-16的氢-核磁共振光谱。25.图9是tci-cjt-06的氢-核磁共振光谱。26.图10是tci-cjt-07的氢-核磁共振光谱。27.图11是tci-cjt-02的氢-核磁共振光谱。28.图12是tci-cjt-03的氢-核磁共振光谱。29.图13是tci-cjt-14的氢-核磁共振光谱。30.图14是tci-cjt-15的氢-核磁共振光谱。31.图15是tci-cjt-05的氢-核磁共振光谱。32.图16是tci-cjt-12的氢-核磁共振光谱。33.图17是tci-cjt-13的氢-核磁共振光谱。34.图18是tci-cjt-11的氢-核磁共振光谱。35.图19是tci-cjt-08的氢-核磁共振光谱。36.图20是tci-cjt-09的氢-核磁共振光谱。37.图21是青饮茶发酵物的hplc图谱。38.图22是水浸提液的hplc图谱。39.图23是tci-cjt-01、tci-cjt-03、tci-cjt-04、tci-cjt-05及tci-cjt-11的glut4基因相对表现量结果图。40.其中，附图标记：41.c:咖啡因42.tci-cjt-01:可可碱43.tci-cjt-03:3’,5’‑二葡萄糖基根皮素44.tci-cjt-04:没食子酸45.tci-cjt-05:牡荆素46.tci-cjt-11:柠檬苦素具体实施方式47.在一些实施例中，青饮茶发酵物是由普洱茶及金桔的水浸提液经酵母菌(yeast)、乳酸杆菌(lactobacillus)及醋酸菌(acetobacteraceti)发酵而制得。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料及水所制得。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料、水及葡萄糖所制得。48.在一些实施例中，普洱茶(俗称：puertea，学名：camelliasinensis)植株是山茶科(theaceae)山茶属(camellia)的植物。在一些实施例中，普洱茶原料为普洱茶叶。在一些实施例中，普洱茶原料为经发酵加工后的普洱茶叶。举例而言，普洱茶原料可以使用采购自中国的普洱茶砖(德清博太植物有限公司)。49.在一些实施例中，金桔(俗称：kumquat，学名：citrusjaponica)植株是芸香科(rutaceae)柑橘属(citrus)的植物。在一些实施例中，金桔原料为金桔果实。在一些实施例中，金桔原料为新鲜金桔果实。在一些实施例中，金桔果实包括果皮、果肉及种子。举例而言，金桔原料可以使用采购自中国台湾美浓的干燥金桔果实。50.在一些实施例中，水浸提液是由重量比1-3：20-25：75-80的普洱茶原料、金桔原料及水所制得。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料及水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟到70分钟的高温浸提(如，90±5℃)所制得。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料、水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟的高温浸提(如，95℃)所制得。在一些实施例中，水浸提液的白利糖度(brix°)大于或等于8。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料、水及葡萄糖所制得。其中，普洱茶原料、金桔原料及水的重量比为1：25：75，而葡萄糖的含量为相对于普洱茶原料、金桔原料及水的总重的10％(w/v)。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料、水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟的高温浸提，再加入10％的葡萄糖，然后进行持续1小时的高温浸提(如，95℃)所制得。51.在一些实施例中，水浸提液不另滤除其内部的固形物(即普洱茶原料/或金桔原料)直接加入菌种进行发酵，以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分，进而得到植物发酵液。52.在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温以供后续发酵程序使用。在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温到40℃以下。在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温到35℃±2。53.在一些实施例中，水浸提液接种菌株之后进行发酵程序以制得青饮茶发酵原液。首先，发酵程序是在水浸提液内加入0.05wt％～0.15wt％的酵母菌、0.025％～0.01wt％的乳酸菌及1～5％的醋酸菌，并且于室温下静置以形成青饮茶发酵原液。在一些实施例中，发酵程序的终止条件可以是静置发酵一段固定时间。举例而言，发酵程序是在水浸提液内加入0.1wt％的酵母菌以及0.025wt％的乳酸菌及4.5％的醋酸菌，并且于25℃到28℃下静置发酵10天以形成青饮茶发酵原液。酵母菌与乳酸菌具有协同生长的效用。54.在一些实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)。举例来说，酵母菌可为寄存于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)且寄存编号bcrc20271菌株啤酒酵母菌(且国际寄存编号atcc26602)或其它市售啤酒酵母。55.在一些实施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸菌(lactobacillusplantarum)。举例来说，乳酸菌可为寄存于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心且寄存编号bcrc910805菌株的tci028菌株，并且此菌株亦寄存于德国国家菌种保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures，dsmz)且其国际寄存编号为dsm33108。tci028菌株具有心血管保健的功效，并且有助于提供降血脂、降血糖的功效。56.在一些实施例中，醋酸菌可以采用寄存编号bcrc11688(国际寄存atcc15973)菌株的醋酸菌。醋酸菌可以促进发酵程序后段的熟成，增添青饮茶发酵物的风味。57.在一些实施例中，发酵程序的终止条件可以依发酵原液的特性为基准。在一些实施例中，发酵程序是在水浸提液内加入酵母菌、乳酸菌及醋酸菌后静置一段时间后，检测其白利糖度小于brix°6.8±0.5，并且其酸碱值(ph值)为3.3±0.5时，形成青饮茶发酵原液。举例而言，发酵程序是在水浸提液内加入0.1wt％的酵母菌以及0.025wt％的乳酸菌及4.5％的醋酸菌，并且于25℃到28℃下静置发酵10天，当检测到白利糖度小于6.8并且酸碱值为3时形成青饮茶发酵原液。58.在一些实施例中，发酵程序所得的青饮茶发酵原液即为青饮茶发酵物。在另一些实施例中，发酵程序之后所得的青饮茶发酵原液可以再进行下列至少一再处理程序：过滤程序、减压浓缩程序、调味程序、填充程序及灭菌程序，以形成青饮茶发酵物。于此，过滤程序、减压浓缩程序、补水程序、调味程序、填充程序或灭菌程序系用以延长青饮茶发酵物的保存期限、口感并且避免变质。59.在一些实施例中，过滤程序是将青饮茶发酵原液以400目数(mesh)或200目数(mesh)的网孔的滤网过滤以形成青饮茶发酵物。于此，藉由适当目数的滤网将固形物去除。60.在一些实施例中，减压浓缩程序是将植物发酵原液在55℃到65℃下减压浓缩以形成青饮茶发酵物。举例来说，减压浓缩的温度设定值为60℃。在一些实施例中，减压浓缩的压力设定值为150巴(bar)。于此，透过减压浓缩能去除青饮茶发酵物内挥发性成分，例如：酒精。61.在一些实施例中，补水程序是将减压浓缩程序中青饮茶发酵物所减去的重量以水补回。举例而言，将发酵程序所得的青饮茶发酵原液进行过滤程序得到10公斤的过滤后青饮茶发酵原液，之后再进行减压浓缩程序得到7公斤的浓缩青饮茶发酵原液，最后再进行补水程序加入3公斤的纯水，最终得到10公斤的青饮茶发酵物。62.在一些实施例中，填充程序是将青饮茶发酵物分装于适当尺吋的保存容器。在一些实施例中，填充程序是将青饮茶发酵物分装于8ml的保存容器。63.在一些实施例中，灭菌程序是将青饮茶发酵物加热到100℃至少70分钟。64.在一些实施例中，青饮茶发酵物用于稳定血糖。在一些实施例中，青饮茶发酵物用于提升glut4基因(geneid:442992)的表现量。在一些实施例中，青饮茶发酵物用于提升glut4蛋白的含量。在一些实施例中，青饮茶发酵物可以减少细胞内脂肪堆积。65.glut4蛋白又称为葡萄糖载体蛋白4(glucosetransporter4，后续简称glut4蛋白)，与葡萄糖的运送相关，主要存在于肌肉及软骨组织中。glut4蛋白在细胞质中时就可结合装载有胰岛素，一旦血液中葡萄糖浓度升高，就会刺激glut4蛋白位移至细胞膜上，细胞内的外泌体释放出胰岛素以迅速调节血糖，同时也可结合葡萄糖，将其携带回细胞中。因此，glut4基因表现若能增加，将可产生更多的glut4蛋白，而提升细胞对胰岛素的敏感度，增加胰岛素的作用效率，达到调整或降低血糖之目的。66.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含以下至少一成分：可可碱(theobromine)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)、没食子酸(gallicacid)、牡荆素(vitexin)、柠檬苦素(limonin)。67.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素和柠檬苦素。68.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含至少130ppm的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素。69.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、川陈皮素(nobiletin)、橘红素(tangeretin)、奎尼酸(quinicacid)、柠檬苦素、橙皮素(hesperetin)、柚皮素(naringenin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)及环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。70.上述各种成分之结构式如下表一所示：71.表一72.73.[0074][0075]在一些实施例中，青饮茶发酵物的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量相对于普洱茶与金桔的水浸提液的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量提升169％。[0076]在一些实施例中，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261ppm。[0077]综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。[0078]在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的青饮茶发酵物。[0079]在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。[0080]在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)或病灶内注射(intralesionalinjection)。[0081]在一些实施例中，前述之医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、或含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)。[0082]在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品(即食品组合物)。换言之，食用产品包含特定含量的植物发酵液。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品、膳食补充品或食品添加物(foodadditive)。[0083]在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)或调味料。[0084]在一些实施例中，能藉由习知方法于原料制备时添加任一实施例的青饮茶发酵物(即作为食品添加物)，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的青饮茶发酵物(即作为食品添加物)，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品。[0085]例1：青饮茶发酵物的制备[0086]首先，准备重量比为1：25：75的普洱茶原料、金桔原料及水。其中，普洱茶原料使用采购自中国的普洱茶砖，将普洱茶砖粉碎之后成为普洱茶原闱。金桔原料使用中国台湾产的干燥金桔果实，将新鲜金桔果实全果含皮进行粉碎之后成为金桔原料。[0087]接着，将普洱茶原料、金桔原料及水混合并加入相对于山普洱茶原料、金桔原料及水总重的10％的葡萄糖，并且加热至95℃。于加热达到95℃以上后持续60分钟，以得到水浸提液。于此，水浸提液的白利糖度(brix°)大于8。[0088]接着，待水浸提液的温度降温至小于35℃后，即可进行后续发酵程序。[0089]于水浸提液中加入0.1wt％的啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)、0.025wt％的胚芽乳酸菌(lactobacillusplantarum)以及4.5wt％的醋酸菌，于室温下静置培养十天时，检测其白利糖度小于brix°6.8±0.5，并且其酸碱值(ph值)为3.3±0.5时，形成青饮茶发酵原液。于此，啤酒酵母是采用寄存编号bcrc20271的啤酒酵母，胚芽乳酸菌采用寄存编号bcrc910805的tci028菌株，醋酸菌是采用寄存编号bcrc11688的醋酸菌。[0090]将青饮茶发酵原液以孔径400目数的筛网进行过滤，将过滤后的青饮茶发酵原液于60℃下及150巴下进行减压浓缩程序，再进行补水程序及杀菌程序以得到青饮茶发酵物。[0091]例2：总皂苷含量测试[0092]2.1标准曲线绘制[0093]于此，所使用作为标准品的溶液为1000ppm的齐墩果酸(oleanolicacid，品牌：sigma，编号：o5504-100mg)溶液，其系以甲醇(methanol，品牌：jtbaker)溶解配置，并以甲醇序列稀释为0ppm、100ppm、200ppm、400ppm、600ppm、800ppm等浓度。[0094]将各浓度的齐墩果酸溶液分别取100μl至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干各浓度的齐墩果酸溶液使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μl的5％香草醛(vanillin，品牌：sigma，编号：a11169)，并加入400μl的高氯酸(perchloricacid，品牌：sigma，编号：30755-1l)混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。于此，所使用的5％香草醛是以乙酸(aceticacid，品牌：jtbaker，编号：9508-03)配置。[0095]接着，取40μl的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μl的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。于此，依照所量测的吸光值对应齐墩果酸溶液的浓度绘制标准曲线。[0096]2.2.测试流程[0097]于此，将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0098]取100μl的测试样品至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干测试样品使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μl的5％香草醛，并加入400μl的高氯酸混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。[0099]取40μl的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μl的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。接着将依据标准曲线以内插法的方式计算控制组及实验组的总皂苷含量，其结果如图1所示。[0100]2.3.测试结果[0101]由图1可见，水浸提液的总皂苷含量为603.1ppm，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261.6ppm。基此可知，在经过发酵程序之后可以提升总皂苷含量多达二倍。[0102]例3：glut4基因调控测试[0103]本次测试以rna萃取套组、反转录酶、kapafastqpcr试剂组配合定量pcr仪，测定人类肝癌细胞株受经青饮茶发酵物处理后，细胞中血糖调控相关基因的变化。[0104]3-1.实验材料及设备[0105]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0106]测试样品：将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0107]培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的杜氏改良eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)(gibco公司，产品编号：11965-092)。[0108]rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)。[0109]反转录酶iiireversetranscriptase)(购自invitrogen公司，美国，编号18080-051)。[0110]测量标的基因引子，其中包含glut-4基因。[0111]kapafastqpcr试剂组(购自sigma公司，美国，编号38220000000)。[0112]abisteponeplustm实时pcr系统(abisteponeplustmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国))。[0113]3-2.测试流程[0114]首先进行细胞的初培育，在六孔板中各孔分别接种1x105的hepg2细胞及2毫升的培养基，并在37℃下培养24小时后，再进行后续步骤。[0115]接下来，更新培养基后将hepg2细胞分为三组。其中，一组的不再添加测试样品(即空白组)，另一组的培养基内为添加例1得到的水浸提液为测试样品(即控制组)，再一组的培养基内为添加例1得到的青饮茶发酵物为测试样品(即实验组)。于此，实验组及控制组所添加的测试样品浓度为0.025mg/ml。[0116]于24小时培养后，各组以细胞裂解液(600μl)分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以rna萃取试剂套组分别萃取三组细胞溶液内的rna。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的rna作为模板，透过反转录酶将萃取出的rna反转录为相应之cdna。再藉由abisteponeplustm实时pcr系统、qpcr试剂组及下表二的引子(seqidno:1及seqidno:2)对三组的cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)以观察三组的人类肝癌细胞株内的glut4基因表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-δct方法进行基因定量。于此，藉由cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量glut4基因的mrna表现量，进而推断glut4基因编码的蛋白质的表现量。[0117]表二[0118][0119][0120]*r为reverse反向，f为forward顺向。[0121]3-3.结果分析[0122]请参阅图2，将空白组glut4基因表现量视为100％时，控制组相对于空白组的glut4基因表现量为187.86％，实验组相对于空白组的glut4基因表现量为394.75％。可观察到实验组的glut4基因的表现量为控制组的二倍以上，并且实验组的glut4基因的表现量为空白组的接近四倍，而控制组的glut4基因的表现量为空白组的1.8倍。[0123]换言之，当人类肝癌细胞株以0.025mg/ml浓度的水浸提液或青饮茶发酵物处理后，都可以明显的观察到glut4基因的表现量提升的情况。并且将水浸提液经过发酵程序处理后所得的青饮茶发酵物对于glut4基因的表现量的提升更有大幅度的促进。[0124]图2中显示的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0125]例4：glut4蛋白含量测试[0126]4-1.实验材料及设备[0127]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0128]测试样品：将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0129]一般培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的dmem培养基(品牌：gibco，编号12100046)。[0130]胰岛素培养基：指添加1μm胰岛素(品牌：sigma，编号i9278-5ml)的dmem培养基(品牌：gibco，编号12100046)。[0131]4-2.测试流程[0132]首先进行细胞的初培育，以每孔1×105个细胞的细胞数，将hepg2细胞接种于含有2ml培养基的6孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养24小时。[0133]接着，更换培养基为胰岛素培养基，然后置于37℃下培养72小时。[0134]将培养好的hepg2细胞分为三组，移除各组胰岛素培养基，并更换为2ml的实验培养基，然后置于37℃下培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.0625vol％的例1所制备的青饮茶发酵物的一般培养基。控制组的实验培养基为含有0.0625vol％的例1所制备的水浸提液的一般培养基。空白组的实验培养基为单纯的一般培养基(即不含水浸提液或青饮茶发酵物)。[0135]接着，移除各孔中的实验培养基并以1xdpbs润洗二次。继而，收集各孔内的肝脏细胞至微量离心管，并以400xg离心5分钟以去除上清液。接着，加入4％三聚甲醛(paraformaldehyde；品牌：sigma)反应15分钟以固定hepg2细胞，再加入0.5％tritonx100与hepg2细胞反应15分钟。接着，加入1％bsa/pbs进行阻断(blocking)1小时后，以400xg离心5分钟以去除上清液。于每管离心管中加入1xdpbs及glut4一级抗体(比例为1:500)(品牌：invitrogen，编号ma5-17176)反应1小时后，以400xg离心5分钟以去除上清液。接着，以1xdpbs润洗二次后，再与荧光二级抗体(alexafluor488goutanti-mouse，比例为1:200)(品牌：invitrogen，编号a-11001)避光反应1小时。400xg离心5分钟以去除微量离心管的上清液后，接着以1xdpbs润洗二次后，将各组hepg2细胞回溶于1xdpbs中。[0136]以流式细胞仪(bd，accuritmc6plus)侦测fitc之绿色荧光强度来分析glut4蛋白质的表现量。于此，上述测试方式系量测细胞膜上glut4蛋白质的表现量。[0137]4-3.结果分析[0138]于此，将空白组量测到的glut4蛋白质的相对表现量视为100％，以计算控制组及实验组的glut4蛋白质的相对表现量。请参阅图3，控制组的glut4蛋白质的相对表现量为58.62％，而实验组的glut4蛋白质的相对表现量为134.48％。[0139]换言之，实验组的glut4蛋白质的相对表现量显著地高于空白组及控制组。由此可知，青饮茶发酵物能有效地提升glut4蛋白质的产生与glut4蛋白质接合到细胞膜上的量，进而提升将葡萄糖运输至细胞内的能力。[0140]另外，亦可观察到控制组的glut4蛋白质的相对表现量反而低于空白组的情况。推测水浸提液在提升glut4蛋白质含量的同时，会抑制glut4蛋白质接合到细胞膜。意即，由于glut4蛋白质协助将血液内的葡萄糖运送进入细胞内，若细胞膜上的glut4蛋白质减少，则血糖的吸收受到抑制，进而可能提升血糖量。[0141]图3中显示的相对蛋白质含量系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0142]例5：脂质油滴堆积量测试[0143]脂肪细胞内以油滴(lipiddroplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。[0144]5-1.实验材料及设备[0145]实验细胞：采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称op9细胞)，op9细胞购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，之op9细胞株(atcccrl-2749)。[0146]前脂肪细胞增殖培养基(pre-adipocyteexpansionmedium)：为添加有20vol％fbs(品牌：gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素之最低必需培养基α(minimumessentialmediumalpha，memα，品牌：gibco)。[0147]所使用的分化培养基(differentiationmedium)：为添加有20vol％fbs(品牌：gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素之memα(品牌：gibco)。[0148]油-红o染色试剂的储备溶液：将油-红o染色试剂(品牌：sigma)彻底溶解于100％异丙醇(isopropanol，供货商：echo)以配制3mg/ml之油-红o染色试剂的储备溶液。为获得可供使用的油-红o工作溶液(oil-redoworkingsolution)，于使用前实时将油-红o染色试剂的储备溶液以二次水(ddh2o)稀释至浓度1.8mg/ml，即为60％油-红o染色试剂的储备溶液。[0149]5-2.测试流程[0150]首先，以每孔8×104个细胞的细胞数，将op9细胞接种于含有500μl前脂肪细胞增殖培养基的24孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μl分化培养基。于培养7天后，使用显微镜(厂牌：zeiss)观察各孔中的细胞内的油滴(lipiddroplet)形成以确认细胞完全分化成脂肪细胞，供后续实验使用。[0151]实验组：依照每孔500μl培养基含有62.5μl的以例1之方式制备而成的青饮茶发酵物(即，浓度为0.125％)将青饮茶发酵物添加至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。[0152]控制组：不作任何处理，即不额外添加其它化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。[0153]接着，依据下列步骤进行红油o的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1ml之磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline,pbs)清洗脂肪细胞两次，再加入1ml之10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1ml之pbs轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1ml之60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1ml之油红o作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红o作用溶液并迅速地以1ml之60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟。[0154]后续，将染色后的各组再依下列步骤进行红油o的定量。加入100％异丙醇至各孔中，并置于振荡器(shaker)上反应10分钟以溶解油滴。然后，从各孔中取100μl前述之溶液至96孔培养盘并于510nm的波长下以elisa读取仪(厂牌：biotek)读取各孔的吸光值(od510nm)。[0155]于量测后，藉由将所测得的吸光值代入下列公式(3)而计算出脂质油滴堆积量(％)。换言之，是将空白组的脂质油滴堆积量视为100％来计算各组别的脂质油滴堆积量(％)。[0156]公式(1)[0157]脂质油滴堆积量(％)＝(od510nmsample/od510nmcontrol)×100％ꢀꢀ(1)[0158]其中，od510nmsample代表欲换算之组别的吸光值，而od510nmcontrol代表空白组的吸光值。[0159]5-3.结果分析[0160]参阅图4。以空白组的脂质油滴堆积量为100％的情况下，而实验组的脂质油滴堆积量只有74.13％。由此可知，青饮茶发酵物能有效地抑制脂肪累积，具有减少受体的脂肪形成的功能，进而达成减肥之功能。[0161]例6：青饮茶发酵物的生物活性物质成分分析[0162]天然植物的发酵物通常包含多种成分，非属纯物质。不同的化合物在不同的溶剂中溶解度具有差异性，本试验利用相互不相溶的溶剂，将青饮茶发酵物中的某一特定成分转移到另一溶剂中。[0163]6-1.实验材料及设备[0164]核磁共振光谱仪(nuclearmagneticresonancespectrometer,nmr)。1d与2d光谱使用ascend400mhz,brukerco.,germany，以δ表示化学位移(chemicalshift)，单位为ppm。[0165]超高效液相层析仪串联轨道离子阱高解析质谱仪(uplc-qe)：由超高效液相层析仪ultimatetm3000rslcnanosystem(thermo,usa)，串联轨道离子阱高解析质谱仪qextractiveorbitrap(thermo,usa)，单位为m/z。[0166]中压液相层析仪(mediumpressureliquidchromatography,mplc):rf ,teledyneisco,lincoln,ne。[0167]高效能液相层析仪(highperformanceliquidchromatography,hplc)：系hitachihighperformanceliquidchromatographchromaster系统(hitachijapan)；光二极管阵列检出器系hitachichromaster5430diodearraydetector，移动相输送帮浦系hitachichromaster5110pump；样品自动注射器系hitachichromaster5260autosampler；管柱恒温箱系hitacichromaster5310columnoven。[0168]分析管柱:mightysilrp-18gpcolumn(250mmx4.6mm,5μm)(kantochemicalco.,inc.,tokyo,japan))。[0169]管柱层析(columnchromatography)填充材料:sephadexlh-20(pharmacia,piscataway,nj,usa)；diaionhp-20(mitsubishichemicalco.,japan)；merckkieselgel60(40-63um,art.9385)；merckrp-18(40-63um,art.0250)。[0170]薄层色层分析(thin-layerchromatography)采用tlcaluminiumsheets(silicagel60f254,0.25mm,merck,germany)及tlcaluminiumsheets(rp-18f254-s,0.25mm,merck,germany)。[0171]紫外光灯(uvlamp):uvpuvgl-25，波长为254nm及365nm。[0172]采用溶剂(solvent)及其来源说明：正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethylacetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)(采购至默克台湾)、氯仿-d1(deuterationdegree99.5％)、甲醇-d4(deuterationdegree99.5％)、重水deuteriumoxide(deuterationdegree》99.8％)、dimethylsulfoxide-d6(deuterationdegree》99.9％)(默克台湾)。[0173]6-2.测试流程[0174]首先，例1所制得的青饮茶发酵物10公升(l)经由乙酸乙酯与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得乙酸乙酯层萃取液与第一水层萃取液。再将第一水层萃取液经由正丁醇与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得正丁醇层萃取液与第二水层萃取液。基此，低极性物质会在乙酸乙酯层萃取液，高极性物质在正丁醇层萃取液，水溶性物质就留在第二水层萃取液。[0175]接着，将乙酸乙酯层萃取液经减压浓缩干燥可得乙酸乙酯层萃取物(eaf)13.7克。将正丁醇层萃取液经减压浓缩干燥可得正丁醇层萃取物(buf)28.9克。第二水层萃取液经减压浓缩干燥可得水层萃取物(wf)79.1克。[0176]据此可计算得知以青饮茶发酵物10公升(l)可分离萃取得到共121.7克的粉末状萃取物，其中乙酸乙酯层萃取物(eaf)占11.3％、正丁醇层萃取物(buf)23.7％以及第二水层萃取物(wf)65.0％。[0177]接下来依据生物活性导引分离方法(bioassayguidedfractionation)，以水、50％甲醇水溶液及甲醇为冲提液对正丁醇层萃取物层进行大孔树脂管柱层析(diaionhp-20columnchromatography)得到buf1分离部、buf2分离部及buf3分离部。[0178]buf1分离部续以以rp-mplc管柱层析分离，冲提液由水至甲醇依序冲提，之后以薄层色层分析法分析，合并相似的冲提部，共得到3个次分离部，其为buf1-1次分离部、buf1-2次分离部及buf1-3次分离部)。[0179]其中，buf1-2次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝2/98)，得到生物活性物质tci-cjt-10，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为奎尼酸(quinicacid)。于此，tci-cjt-10的氢-核磁共振光谱如图5所示。[0180]其中，buf1-3次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/9)，得到生物活性物质tci-cjt-01，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为可可碱(theobromine)。于此，tci-cjt-01的氢-核磁共振光谱如图6所示。[0181]buf2分离部续以以rp-mplc管柱层析分离，冲提液由水至甲醇依序冲提，之后以薄层色层分析法分析，合并相似的冲提部，共得到7个次分离部，其为buf2-1次分离部、buf2-2次分离部、buf2-3次分离部、buf2-4次分离部、buf2-5次分离部、buf2-6次分离部及buf2-7次分离部)。[0182]其中，buf2-1次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/19)，得到生物活性物质tci-cjt-04，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为没食子酸(gallicacid)。于此，tci-cjt-04的氢-核磁共振光谱如图7所示。[0183]其中，buf2-2次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/9)，得到生物活性物质tci-cjt-16，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。于此，tci-cjt-16的氢-核磁共振光谱如图8所示。[0184]其中，buf2-3次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/4)，得到生物活性物质tci-cjt-06及生物活性物质tci-cjt-07，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-06为儿茶素(catechin)确认生物活性物质tci-cjt-07为表儿茶素(epicatechin)。于此，tci-cjt-06的氢-核磁共振光谱如图9所示。于此，tci-cjt-07的氢-核磁共振光谱如图10所示。[0185]其中，buf2-4次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝3/7)，得到生物活性物质tci-cjt-02及生物活性物质tci-cjt-03，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-02为6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)确认生物活性物质tci-cjt-03为3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)。于此，tci-cjt-02的氢-核磁共振光谱如图11所示。于此，tci-cjt-03的氢-核磁共振光谱如图12所示。[0186]其中，buf2-5次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝7/13)，得到生物活性物质tci-cjt-14及生物活性物质tci-cjt-15，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-14为橙皮苷(hesperidin)确认生物活性物质tci-cjt-15为柚皮苷(naringin)。于此，tci-cjt-14的氢-核磁共振光谱如图13所示。于此，tci-cjt-15的氢-核磁共振光谱如图14所示。[0187]其中，buf2-6次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝2/3)，得到生物活性物质tci-cjt-05，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为牡荆素(vitexin)。于此，tci-cjt-05的氢-核磁共振光谱如图15所示。[0188]其中，buf2-7次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/1)，得到生物活性物质tci-cjt-12及生物活性物质tci-cjt-13，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-12为橙皮素(hesperetin)确认生物活性物质tci-cjt-13为柚皮素(naringenin)。于此，tci-cjt-12的氢-核磁共振光谱如图16所示。于此，tci-cjt-13的氢-核磁共振光谱如图17所示。[0189]依据生物活性导引分离方法(bioassayguidedfractionation)，以甲醇为冲提液对乙酸乙酯层萃取物层进行葡聚糖凝胶管柱层析(sephadexlh-20columnchromatography)而后续利用薄层色层分析，合并相似结果的冲提物，得到eaf1分离部、eaf2分离部、eaf3分离部、eaf4分离部及eaf5分离部。[0190]其中，eaf2分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝7/3)，得到生物活性物质tci-cjt-11，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为柠檬苦酸(limonin)。于此，tci-cjt-11的氢-核磁共振光谱如图18所示。[0191]其中，eaf3分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝8/2)，得到生物活性物质tci-cjt-08及生物活性物质tci-cjt-09，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-08为川陈皮素(nobiletin)确认生物活性物质tci-cjt-09为橘红素(tangeretin)。于此，tci-cjt-08的氢-核磁共振光谱如图19所示。于此，tci-cjt-09的氢-核磁共振光谱如图20所示。[0192]6-3.结果分析[0193]由上述可知，青饮茶发酵物包含有可可碱(tci-cjt-01)、6,8-二葡萄糖基芹菜素(tci-cjt-02)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(tci-cjt-03)、没食子酸(tci-cjt-04)、牡荆素(tci-cjt-05)、儿茶素(tci-cjt-06)、表儿茶素(tci-cjt-07)、川陈皮素(tci-cjt-08)、橘红素(tci-cjt-09)、奎尼酸(tci-cjt-10)、柠檬苦素(tci-cjt-11)、橙皮素(tci-cjt-12)、柚皮素(tci-cjt-13)、橙皮苷(tci-cjt-14)、柚皮苷(tci-cjt-15)及环-(脯胺酸-白胺酸)(tci-cjt-16)等化合物。[0194]例7：青饮茶发酵物及其生物活性物质的指纹图谱hplc分析[0195]于此，利用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)来对例1所制得的青饮茶发酵物及其所含的生物活性物质进行定量与定性的分析。[0196]本次试验中所使用的溶剂为甲醇与水，并在甲醇与水各自添加0.1％甲酸，设定流速为1ml/min，设定冲提条件为0分钟时甲醇：水为2：98，10分钟时甲醇：水为2：98，40分钟时甲醇：水为70：30，50分钟时甲醇：水为100：0，60分钟时甲醇：水为100：0。[0197]首先，图21为对例1所制得的青饮茶发酵物的hplc图谱。其中，在时间为10分附近解析出tci-cjt-04生物活性物质的波峰，在时间为22分附近解析出tci-cjt-01生物活性物质的波峰，在时间为27分附近解析出咖啡因c(caffeine)的波峰，在时间为33分附近解析出tci-cjt-03生物活性物质的波峰，在时间为35分附近解析出tci-cjt-05生物活性物质的波峰，在时间为38分附近解析出tci-cjt-11生物活性物质的波峰。[0198]换言之，青饮茶发酵物中没食子酸、可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、牡荆素及柠檬苦素的含量较多。其中，又以3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量最多。意即没食子酸、可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、牡荆素及柠檬苦素为青饮茶发酵物中有效生物活性物质的主要成分。其中，青饮茶发酵物中的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素经定量为130.6ppm。[0199]图22为对例1所制得的水浸提液的hplc图谱。其中，在时间为27分附近解析出咖啡因c(caffeine)的波峰，在时间为33分附近解析出tci-cjt-03生物活性物质的波峰。[0200]并且将图21及图22进行对比可知，很多地方的波峰变得更为明显。意即经过发酵程序的青饮茶发酵物其中有效生物活性物质的含量提升许多。同时也可以观察到青饮茶发酵物的咖啡因含量反而降低。[0201]例8：tci-cjt-01、tci-cjt-03、tci-cjt-04、tci-cjt-05及tci-cjt-11的glut4基因调控测试[0202]本次测试以rna萃取套组、反转录酶、kapafastqpcr试剂组配合定量pcr仪，测定人类肝癌细胞株受经青饮茶发酵物处理后，细胞中血糖调控相关基因的变化。[0203]8-1.实验材料及设备[0204]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0205]测试样品：将例6得到的生物活性物质tci-cjt-01、生物活性物质tci-cjt-03、生物活性物质tci-cjt-04、生物活性物质tci-cjt-05及生物活性物质tci-cjt-11作为实验组的测试样品。[0206]培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的杜氏改良eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)(gibco公司，产品编号：11965-092)。[0207]rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)。[0208]反转录酶iiireversetranscriptase)(购自invitrogen公司，美国，编号18080-051)。[0209]测量标的基因引子，其中包含glut-4基因。[0210]kapafastqpcr试剂组(购自sigma公司，美国，编号38220000000)。[0211]abisteponeplustm实时pcr系统(abisteponeplustmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国))。[0212]8-2.测试流程[0213]首先进行细胞的初培育，在六孔板中各孔分别接种1x105的hepg2细胞及2毫升的培养基，并在37℃下培养24小时后，再进行后续步骤。[0214]接下来，更新培养基后将hepg2细胞分为六组。其中，一组的不再添加测试样品(即空白组)，另五组的培养基内为分别添加例6得到的生物活性物质tci-cjt-01、生物活性物质tci-cjt-03、生物活性物质tci-cjt-04、生物活性物质tci-cjt-05及生物活性物质tci-cjt-011作为实验组的测试样品(即tci-cjt-01实验组、tci-cjt-03实验组、tci-cjt-04实验组、tci-cjt-05实验组)。于此，各实验组及控制组所添加的测试样品浓度为100μm。[0215]于24小时培养后，各组以细胞裂解液(600μl)分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以rna萃取试剂套组分别萃取三组细胞溶液内的rna。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的rna作为模板，透过反转录酶将萃取出的rna反转录为相应之cdna。再藉由abisteponeplustm实时pcr系统、qpcr试剂组及上表二的引子(seqidno:1及seqidno:2)对各组的cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)以观察各组的hepg2细胞内的glut4基因表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-δct方法进行基因定量。于此，藉由cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量glut4基因的mrna表现量，进而推断glut4基因编码的蛋白质的表现量。[0216]8-3.结果分析[0217]请参阅图23，将空白组glut4基因表现量视为100％时，tci-cjt-01实验组相对于空白组的glut4基因表现量为114.3％，tci-cjt-03实验组相对于空白组的glut4基因表现量为195.6％tci-cjt-04实验组相对于空白组的glut4基因表现量为119.8％tci-cjt-05实验组相对于空白组的glut4基因表现量为136％tci-cjt-011实验组相对于空白组的glut4基因表现量为118.8％。[0218]意即，tci-cjt-01实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升14.3％，tci-cjt-03实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升95.6％，tci-cjt-04实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升19.8％，tci-cjt-05实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升36％，tci-cjt-11实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升18.8％。[0219]其中，当人类肝癌细胞株以100μm浓度的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素处理后，其对于glut4基因的表现量的提升更有大幅度的促进。[0220]图23中显示的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0221]综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。[0222]虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。[0223]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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：：2.基于消费者对于人工合物或添加物的疑虑日益增加，故而有机及天然的饮食概念更为受到欢迎。生技公司及食品业者积极投入关于天然产物的相关产品之研发。3.在各项对身体健康有帮助的科学验证基础上，针对不同植物的活性成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。产品开发的项目是藉由天然植物改善或提升身体机能，如减重、美白、肠胃保健、生酮饮食等。4.其中，新陈代谢过低、体脂过高更是现代人常见的健康危害，而新陈代谢过低、体脂过高等可能进一步导致高血脂、脂肪肝、高血糖等多种病变。技术实现要素：5.在一些实施例中，一种青饮茶发酵物的用途是用于制备稳定血糖的组合物，上述青饮茶发酵物由普洱茶与金桔的水浸提液经酵母菌、乳酸杆菌及醋酸菌发酵而制得。6.在一些实施例中，青饮茶发酵物可以提升glut4基因的表现量。7.在一些实施例中，青饮茶发酵物可以提升glut4蛋白的含量。8.在一些实施例中，一种青饮茶发酵物的用途是用于制备减少细胞内脂肪堆积的组合物，上述青饮茶发酵物由普洱茶与金桔的水浸提液经酵母菌、乳酸杆菌及醋酸菌发酵而制得。9.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含以下至少一成分：可可碱(theobromine)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)、没食子酸(gallicacid)、牡荆素(vitexin)、柠檬苦素(limonin)。10.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素和柠檬苦素。11.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含至少130ppm的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素。12.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、川陈皮素(nobiletin)、橘红素(tangeretin)、奎尼酸(quinicacid)、柠檬苦素、橙皮素(hesperetin)、柚皮素(naringenin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)及环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。13.在一些实施例中，青饮茶发酵物的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量相对于普洱茶与金桔的水浸提液的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量提升169％。14.在一些实施例中，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261ppm。15.综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。16.以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。附图说明17.图1是总皂苷含量实验结果图。18.图2是glut4基因相对表现量结果图。19.图3是glut4蛋白相对含量结果图。20.图4是相对脂肪累积量结果图。21.图5是tci-cjt-10的氢-核磁共振光谱。22.图6是tci-cjt-01的氢-核磁共振光谱。23.图7是tci-cjt-04的氢-核磁共振光谱。24.图8是tci-cjt-16的氢-核磁共振光谱。25.图9是tci-cjt-06的氢-核磁共振光谱。26.图10是tci-cjt-07的氢-核磁共振光谱。27.图11是tci-cjt-02的氢-核磁共振光谱。28.图12是tci-cjt-03的氢-核磁共振光谱。29.图13是tci-cjt-14的氢-核磁共振光谱。30.图14是tci-cjt-15的氢-核磁共振光谱。31.图15是tci-cjt-05的氢-核磁共振光谱。32.图16是tci-cjt-12的氢-核磁共振光谱。33.图17是tci-cjt-13的氢-核磁共振光谱。34.图18是tci-cjt-11的氢-核磁共振光谱。35.图19是tci-cjt-08的氢-核磁共振光谱。36.图20是tci-cjt-09的氢-核磁共振光谱。37.图21是青饮茶发酵物的hplc图谱。38.图22是水浸提液的hplc图谱。39.图23是tci-cjt-01、tci-cjt-03、tci-cjt-04、tci-cjt-05及tci-cjt-11的glut4基因相对表现量结果图。40.其中，附图标记：41.c:咖啡因42.tci-cjt-01:可可碱43.tci-cjt-03:3’,5’‑二葡萄糖基根皮素44.tci-cjt-04:没食子酸45.tci-cjt-05:牡荆素46.tci-cjt-11:柠檬苦素具体实施方式47.在一些实施例中，青饮茶发酵物是由普洱茶及金桔的水浸提液经酵母菌(yeast)、乳酸杆菌(lactobacillus)及醋酸菌(acetobacteraceti)发酵而制得。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料及水所制得。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料、水及葡萄糖所制得。48.在一些实施例中，普洱茶(俗称：puertea，学名：camelliasinensis)植株是山茶科(theaceae)山茶属(camellia)的植物。在一些实施例中，普洱茶原料为普洱茶叶。在一些实施例中，普洱茶原料为经发酵加工后的普洱茶叶。举例而言，普洱茶原料可以使用采购自中国的普洱茶砖(德清博太植物有限公司)。49.在一些实施例中，金桔(俗称：kumquat，学名：citrusjaponica)植株是芸香科(rutaceae)柑橘属(citrus)的植物。在一些实施例中，金桔原料为金桔果实。在一些实施例中，金桔原料为新鲜金桔果实。在一些实施例中，金桔果实包括果皮、果肉及种子。举例而言，金桔原料可以使用采购自中国台湾美浓的干燥金桔果实。50.在一些实施例中，水浸提液是由重量比1-3：20-25：75-80的普洱茶原料、金桔原料及水所制得。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料及水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟到70分钟的高温浸提(如，90±5℃)所制得。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料、水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟的高温浸提(如，95℃)所制得。在一些实施例中，水浸提液的白利糖度(brix°)大于或等于8。在一些实施例中，水浸提液是由普洱茶原料、金桔原料、水及葡萄糖所制得。其中，普洱茶原料、金桔原料及水的重量比为1：25：75，而葡萄糖的含量为相对于普洱茶原料、金桔原料及水的总重的10％(w/v)。在一些实施例中，水浸提液是将普洱茶原料、金桔原料、水依据1：25：75的比例混合后进行持续60分钟的高温浸提，再加入10％的葡萄糖，然后进行持续1小时的高温浸提(如，95℃)所制得。51.在一些实施例中，水浸提液不另滤除其内部的固形物(即普洱茶原料/或金桔原料)直接加入菌种进行发酵，以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分，进而得到植物发酵液。52.在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温以供后续发酵程序使用。在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温到40℃以下。在一些实施例中，于高温浸提后，将水浸提液降温到35℃±2。53.在一些实施例中，水浸提液接种菌株之后进行发酵程序以制得青饮茶发酵原液。首先，发酵程序是在水浸提液内加入0.05wt％～0.15wt％的酵母菌、0.025％～0.01wt％的乳酸菌及1～5％的醋酸菌，并且于室温下静置以形成青饮茶发酵原液。在一些实施例中，发酵程序的终止条件可以是静置发酵一段固定时间。举例而言，发酵程序是在水浸提液内加入0.1wt％的酵母菌以及0.025wt％的乳酸菌及4.5％的醋酸菌，并且于25℃到28℃下静置发酵10天以形成青饮茶发酵原液。酵母菌与乳酸菌具有协同生长的效用。54.在一些实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)。举例来说，酵母菌可为寄存于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)且寄存编号bcrc20271菌株啤酒酵母菌(且国际寄存编号atcc26602)或其它市售啤酒酵母。55.在一些实施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸菌(lactobacillusplantarum)。举例来说，乳酸菌可为寄存于食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心且寄存编号bcrc910805菌株的tci028菌株，并且此菌株亦寄存于德国国家菌种保藏中心(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures，dsmz)且其国际寄存编号为dsm33108。tci028菌株具有心血管保健的功效，并且有助于提供降血脂、降血糖的功效。56.在一些实施例中，醋酸菌可以采用寄存编号bcrc11688(国际寄存atcc15973)菌株的醋酸菌。醋酸菌可以促进发酵程序后段的熟成，增添青饮茶发酵物的风味。57.在一些实施例中，发酵程序的终止条件可以依发酵原液的特性为基准。在一些实施例中，发酵程序是在水浸提液内加入酵母菌、乳酸菌及醋酸菌后静置一段时间后，检测其白利糖度小于brix°6.8±0.5，并且其酸碱值(ph值)为3.3±0.5时，形成青饮茶发酵原液。举例而言，发酵程序是在水浸提液内加入0.1wt％的酵母菌以及0.025wt％的乳酸菌及4.5％的醋酸菌，并且于25℃到28℃下静置发酵10天，当检测到白利糖度小于6.8并且酸碱值为3时形成青饮茶发酵原液。58.在一些实施例中，发酵程序所得的青饮茶发酵原液即为青饮茶发酵物。在另一些实施例中，发酵程序之后所得的青饮茶发酵原液可以再进行下列至少一再处理程序：过滤程序、减压浓缩程序、调味程序、填充程序及灭菌程序，以形成青饮茶发酵物。于此，过滤程序、减压浓缩程序、补水程序、调味程序、填充程序或灭菌程序系用以延长青饮茶发酵物的保存期限、口感并且避免变质。59.在一些实施例中，过滤程序是将青饮茶发酵原液以400目数(mesh)或200目数(mesh)的网孔的滤网过滤以形成青饮茶发酵物。于此，藉由适当目数的滤网将固形物去除。60.在一些实施例中，减压浓缩程序是将植物发酵原液在55℃到65℃下减压浓缩以形成青饮茶发酵物。举例来说，减压浓缩的温度设定值为60℃。在一些实施例中，减压浓缩的压力设定值为150巴(bar)。于此，透过减压浓缩能去除青饮茶发酵物内挥发性成分，例如：酒精。61.在一些实施例中，补水程序是将减压浓缩程序中青饮茶发酵物所减去的重量以水补回。举例而言，将发酵程序所得的青饮茶发酵原液进行过滤程序得到10公斤的过滤后青饮茶发酵原液，之后再进行减压浓缩程序得到7公斤的浓缩青饮茶发酵原液，最后再进行补水程序加入3公斤的纯水，最终得到10公斤的青饮茶发酵物。62.在一些实施例中，填充程序是将青饮茶发酵物分装于适当尺吋的保存容器。在一些实施例中，填充程序是将青饮茶发酵物分装于8ml的保存容器。63.在一些实施例中，灭菌程序是将青饮茶发酵物加热到100℃至少70分钟。64.在一些实施例中，青饮茶发酵物用于稳定血糖。在一些实施例中，青饮茶发酵物用于提升glut4基因(geneid:442992)的表现量。在一些实施例中，青饮茶发酵物用于提升glut4蛋白的含量。在一些实施例中，青饮茶发酵物可以减少细胞内脂肪堆积。65.glut4蛋白又称为葡萄糖载体蛋白4(glucosetransporter4，后续简称glut4蛋白)，与葡萄糖的运送相关，主要存在于肌肉及软骨组织中。glut4蛋白在细胞质中时就可结合装载有胰岛素，一旦血液中葡萄糖浓度升高，就会刺激glut4蛋白位移至细胞膜上，细胞内的外泌体释放出胰岛素以迅速调节血糖，同时也可结合葡萄糖，将其携带回细胞中。因此，glut4基因表现若能增加，将可产生更多的glut4蛋白，而提升细胞对胰岛素的敏感度，增加胰岛素的作用效率，达到调整或降低血糖之目的。66.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含以下至少一成分：可可碱(theobromine)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)、没食子酸(gallicacid)、牡荆素(vitexin)、柠檬苦素(limonin)。67.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素和柠檬苦素。68.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含至少130ppm的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素。69.在一些实施例中，青饮茶发酵物包含可可碱、6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、没食子酸、牡荆素、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、川陈皮素(nobiletin)、橘红素(tangeretin)、奎尼酸(quinicacid)、柠檬苦素、橙皮素(hesperetin)、柚皮素(naringenin)、橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)及环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。70.上述各种成分之结构式如下表一所示：71.表一72.73.[0074][0075]在一些实施例中，青饮茶发酵物的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量相对于普洱茶与金桔的水浸提液的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量提升169％。[0076]在一些实施例中，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261ppm。[0077]综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。[0078]在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的青饮茶发酵物。[0079]在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。[0080]在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)或病灶内注射(intralesionalinjection)。[0081]在一些实施例中，前述之医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、或含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)。[0082]在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品(即食品组合物)。换言之，食用产品包含特定含量的植物发酵液。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品、膳食补充品或食品添加物(foodadditive)。[0083]在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)或调味料。[0084]在一些实施例中，能藉由习知方法于原料制备时添加任一实施例的青饮茶发酵物(即作为食品添加物)，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的青饮茶发酵物(即作为食品添加物)，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品。[0085]例1：青饮茶发酵物的制备[0086]首先，准备重量比为1：25：75的普洱茶原料、金桔原料及水。其中，普洱茶原料使用采购自中国的普洱茶砖，将普洱茶砖粉碎之后成为普洱茶原闱。金桔原料使用中国台湾产的干燥金桔果实，将新鲜金桔果实全果含皮进行粉碎之后成为金桔原料。[0087]接着，将普洱茶原料、金桔原料及水混合并加入相对于山普洱茶原料、金桔原料及水总重的10％的葡萄糖，并且加热至95℃。于加热达到95℃以上后持续60分钟，以得到水浸提液。于此，水浸提液的白利糖度(brix°)大于8。[0088]接着，待水浸提液的温度降温至小于35℃后，即可进行后续发酵程序。[0089]于水浸提液中加入0.1wt％的啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)、0.025wt％的胚芽乳酸菌(lactobacillusplantarum)以及4.5wt％的醋酸菌，于室温下静置培养十天时，检测其白利糖度小于brix°6.8±0.5，并且其酸碱值(ph值)为3.3±0.5时，形成青饮茶发酵原液。于此，啤酒酵母是采用寄存编号bcrc20271的啤酒酵母，胚芽乳酸菌采用寄存编号bcrc910805的tci028菌株，醋酸菌是采用寄存编号bcrc11688的醋酸菌。[0090]将青饮茶发酵原液以孔径400目数的筛网进行过滤，将过滤后的青饮茶发酵原液于60℃下及150巴下进行减压浓缩程序，再进行补水程序及杀菌程序以得到青饮茶发酵物。[0091]例2：总皂苷含量测试[0092]2.1标准曲线绘制[0093]于此，所使用作为标准品的溶液为1000ppm的齐墩果酸(oleanolicacid，品牌：sigma，编号：o5504-100mg)溶液，其系以甲醇(methanol，品牌：jtbaker)溶解配置，并以甲醇序列稀释为0ppm、100ppm、200ppm、400ppm、600ppm、800ppm等浓度。[0094]将各浓度的齐墩果酸溶液分别取100μl至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干各浓度的齐墩果酸溶液使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μl的5％香草醛(vanillin，品牌：sigma，编号：a11169)，并加入400μl的高氯酸(perchloricacid，品牌：sigma，编号：30755-1l)混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。于此，所使用的5％香草醛是以乙酸(aceticacid，品牌：jtbaker，编号：9508-03)配置。[0095]接着，取40μl的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μl的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。于此，依照所量测的吸光值对应齐墩果酸溶液的浓度绘制标准曲线。[0096]2.2.测试流程[0097]于此，将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0098]取100μl的测试样品至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干测试样品使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μl的5％香草醛，并加入400μl的高氯酸混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。[0099]取40μl的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μl的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。接着将依据标准曲线以内插法的方式计算控制组及实验组的总皂苷含量，其结果如图1所示。[0100]2.3.测试结果[0101]由图1可见，水浸提液的总皂苷含量为603.1ppm，青饮茶发酵物的总皂苷含量为1261.6ppm。基此可知，在经过发酵程序之后可以提升总皂苷含量多达二倍。[0102]例3：glut4基因调控测试[0103]本次测试以rna萃取套组、反转录酶、kapafastqpcr试剂组配合定量pcr仪，测定人类肝癌细胞株受经青饮茶发酵物处理后，细胞中血糖调控相关基因的变化。[0104]3-1.实验材料及设备[0105]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0106]测试样品：将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0107]培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的杜氏改良eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)(gibco公司，产品编号：11965-092)。[0108]rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)。[0109]反转录酶iiireversetranscriptase)(购自invitrogen公司，美国，编号18080-051)。[0110]测量标的基因引子，其中包含glut-4基因。[0111]kapafastqpcr试剂组(购自sigma公司，美国，编号38220000000)。[0112]abisteponeplustm实时pcr系统(abisteponeplustmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国))。[0113]3-2.测试流程[0114]首先进行细胞的初培育，在六孔板中各孔分别接种1x105的hepg2细胞及2毫升的培养基，并在37℃下培养24小时后，再进行后续步骤。[0115]接下来，更新培养基后将hepg2细胞分为三组。其中，一组的不再添加测试样品(即空白组)，另一组的培养基内为添加例1得到的水浸提液为测试样品(即控制组)，再一组的培养基内为添加例1得到的青饮茶发酵物为测试样品(即实验组)。于此，实验组及控制组所添加的测试样品浓度为0.025mg/ml。[0116]于24小时培养后，各组以细胞裂解液(600μl)分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以rna萃取试剂套组分别萃取三组细胞溶液内的rna。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的rna作为模板，透过反转录酶将萃取出的rna反转录为相应之cdna。再藉由abisteponeplustm实时pcr系统、qpcr试剂组及下表二的引子(seqidno:1及seqidno:2)对三组的cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)以观察三组的人类肝癌细胞株内的glut4基因表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-δct方法进行基因定量。于此，藉由cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量glut4基因的mrna表现量，进而推断glut4基因编码的蛋白质的表现量。[0117]表二[0118][0119][0120]*r为reverse反向，f为forward顺向。[0121]3-3.结果分析[0122]请参阅图2，将空白组glut4基因表现量视为100％时，控制组相对于空白组的glut4基因表现量为187.86％，实验组相对于空白组的glut4基因表现量为394.75％。可观察到实验组的glut4基因的表现量为控制组的二倍以上，并且实验组的glut4基因的表现量为空白组的接近四倍，而控制组的glut4基因的表现量为空白组的1.8倍。[0123]换言之，当人类肝癌细胞株以0.025mg/ml浓度的水浸提液或青饮茶发酵物处理后，都可以明显的观察到glut4基因的表现量提升的情况。并且将水浸提液经过发酵程序处理后所得的青饮茶发酵物对于glut4基因的表现量的提升更有大幅度的促进。[0124]图2中显示的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0125]例4：glut4蛋白含量测试[0126]4-1.实验材料及设备[0127]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0128]测试样品：将例1得到的水浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的青饮茶发酵物作为实验组的测试样品。[0129]一般培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的dmem培养基(品牌：gibco，编号12100046)。[0130]胰岛素培养基：指添加1μm胰岛素(品牌：sigma，编号i9278-5ml)的dmem培养基(品牌：gibco，编号12100046)。[0131]4-2.测试流程[0132]首先进行细胞的初培育，以每孔1×105个细胞的细胞数，将hepg2细胞接种于含有2ml培养基的6孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养24小时。[0133]接着，更换培养基为胰岛素培养基，然后置于37℃下培养72小时。[0134]将培养好的hepg2细胞分为三组，移除各组胰岛素培养基，并更换为2ml的实验培养基，然后置于37℃下培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.0625vol％的例1所制备的青饮茶发酵物的一般培养基。控制组的实验培养基为含有0.0625vol％的例1所制备的水浸提液的一般培养基。空白组的实验培养基为单纯的一般培养基(即不含水浸提液或青饮茶发酵物)。[0135]接着，移除各孔中的实验培养基并以1xdpbs润洗二次。继而，收集各孔内的肝脏细胞至微量离心管，并以400xg离心5分钟以去除上清液。接着，加入4％三聚甲醛(paraformaldehyde；品牌：sigma)反应15分钟以固定hepg2细胞，再加入0.5％tritonx100与hepg2细胞反应15分钟。接着，加入1％bsa/pbs进行阻断(blocking)1小时后，以400xg离心5分钟以去除上清液。于每管离心管中加入1xdpbs及glut4一级抗体(比例为1:500)(品牌：invitrogen，编号ma5-17176)反应1小时后，以400xg离心5分钟以去除上清液。接着，以1xdpbs润洗二次后，再与荧光二级抗体(alexafluor488goutanti-mouse，比例为1:200)(品牌：invitrogen，编号a-11001)避光反应1小时。400xg离心5分钟以去除微量离心管的上清液后，接着以1xdpbs润洗二次后，将各组hepg2细胞回溶于1xdpbs中。[0136]以流式细胞仪(bd，accuritmc6plus)侦测fitc之绿色荧光强度来分析glut4蛋白质的表现量。于此，上述测试方式系量测细胞膜上glut4蛋白质的表现量。[0137]4-3.结果分析[0138]于此，将空白组量测到的glut4蛋白质的相对表现量视为100％，以计算控制组及实验组的glut4蛋白质的相对表现量。请参阅图3，控制组的glut4蛋白质的相对表现量为58.62％，而实验组的glut4蛋白质的相对表现量为134.48％。[0139]换言之，实验组的glut4蛋白质的相对表现量显著地高于空白组及控制组。由此可知，青饮茶发酵物能有效地提升glut4蛋白质的产生与glut4蛋白质接合到细胞膜上的量，进而提升将葡萄糖运输至细胞内的能力。[0140]另外，亦可观察到控制组的glut4蛋白质的相对表现量反而低于空白组的情况。推测水浸提液在提升glut4蛋白质含量的同时，会抑制glut4蛋白质接合到细胞膜。意即，由于glut4蛋白质协助将血液内的葡萄糖运送进入细胞内，若细胞膜上的glut4蛋白质减少，则血糖的吸收受到抑制，进而可能提升血糖量。[0141]图3中显示的相对蛋白质含量系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0142]例5：脂质油滴堆积量测试[0143]脂肪细胞内以油滴(lipiddroplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，藉以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。[0144]5-1.实验材料及设备[0145]实验细胞：采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称op9细胞)，op9细胞购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，之op9细胞株(atcccrl-2749)。[0146]前脂肪细胞增殖培养基(pre-adipocyteexpansionmedium)：为添加有20vol％fbs(品牌：gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素之最低必需培养基α(minimumessentialmediumalpha，memα，品牌：gibco)。[0147]所使用的分化培养基(differentiationmedium)：为添加有20vol％fbs(品牌：gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素之memα(品牌：gibco)。[0148]油-红o染色试剂的储备溶液：将油-红o染色试剂(品牌：sigma)彻底溶解于100％异丙醇(isopropanol，供货商：echo)以配制3mg/ml之油-红o染色试剂的储备溶液。为获得可供使用的油-红o工作溶液(oil-redoworkingsolution)，于使用前实时将油-红o染色试剂的储备溶液以二次水(ddh2o)稀释至浓度1.8mg/ml，即为60％油-红o染色试剂的储备溶液。[0149]5-2.测试流程[0150]首先，以每孔8×104个细胞的细胞数，将op9细胞接种于含有500μl前脂肪细胞增殖培养基的24孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μl分化培养基。于培养7天后，使用显微镜(厂牌：zeiss)观察各孔中的细胞内的油滴(lipiddroplet)形成以确认细胞完全分化成脂肪细胞，供后续实验使用。[0151]实验组：依照每孔500μl培养基含有62.5μl的以例1之方式制备而成的青饮茶发酵物(即，浓度为0.125％)将青饮茶发酵物添加至含分化后的培养基中，在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。[0152]控制组：不作任何处理，即不额外添加其它化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。[0153]接着，依据下列步骤进行红油o的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1ml之磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline,pbs)清洗脂肪细胞两次，再加入1ml之10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1ml之pbs轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1ml之60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1ml之油红o作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红o作用溶液并迅速地以1ml之60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟。[0154]后续，将染色后的各组再依下列步骤进行红油o的定量。加入100％异丙醇至各孔中，并置于振荡器(shaker)上反应10分钟以溶解油滴。然后，从各孔中取100μl前述之溶液至96孔培养盘并于510nm的波长下以elisa读取仪(厂牌：biotek)读取各孔的吸光值(od510nm)。[0155]于量测后，藉由将所测得的吸光值代入下列公式(3)而计算出脂质油滴堆积量(％)。换言之，是将空白组的脂质油滴堆积量视为100％来计算各组别的脂质油滴堆积量(％)。[0156]公式(1)[0157]脂质油滴堆积量(％)＝(od510nmsample/od510nmcontrol)×100％ꢀꢀ(1)[0158]其中，od510nmsample代表欲换算之组别的吸光值，而od510nmcontrol代表空白组的吸光值。[0159]5-3.结果分析[0160]参阅图4。以空白组的脂质油滴堆积量为100％的情况下，而实验组的脂质油滴堆积量只有74.13％。由此可知，青饮茶发酵物能有效地抑制脂肪累积，具有减少受体的脂肪形成的功能，进而达成减肥之功能。[0161]例6：青饮茶发酵物的生物活性物质成分分析[0162]天然植物的发酵物通常包含多种成分，非属纯物质。不同的化合物在不同的溶剂中溶解度具有差异性，本试验利用相互不相溶的溶剂，将青饮茶发酵物中的某一特定成分转移到另一溶剂中。[0163]6-1.实验材料及设备[0164]核磁共振光谱仪(nuclearmagneticresonancespectrometer,nmr)。1d与2d光谱使用ascend400mhz,brukerco.,germany，以δ表示化学位移(chemicalshift)，单位为ppm。[0165]超高效液相层析仪串联轨道离子阱高解析质谱仪(uplc-qe)：由超高效液相层析仪ultimatetm3000rslcnanosystem(thermo,usa)，串联轨道离子阱高解析质谱仪qextractiveorbitrap(thermo,usa)，单位为m/z。[0166]中压液相层析仪(mediumpressureliquidchromatography,mplc):rf ,teledyneisco,lincoln,ne。[0167]高效能液相层析仪(highperformanceliquidchromatography,hplc)：系hitachihighperformanceliquidchromatographchromaster系统(hitachijapan)；光二极管阵列检出器系hitachichromaster5430diodearraydetector，移动相输送帮浦系hitachichromaster5110pump；样品自动注射器系hitachichromaster5260autosampler；管柱恒温箱系hitacichromaster5310columnoven。[0168]分析管柱:mightysilrp-18gpcolumn(250mmx4.6mm,5μm)(kantochemicalco.,inc.,tokyo,japan))。[0169]管柱层析(columnchromatography)填充材料:sephadexlh-20(pharmacia,piscataway,nj,usa)；diaionhp-20(mitsubishichemicalco.,japan)；merckkieselgel60(40-63um,art.9385)；merckrp-18(40-63um,art.0250)。[0170]薄层色层分析(thin-layerchromatography)采用tlcaluminiumsheets(silicagel60f254,0.25mm,merck,germany)及tlcaluminiumsheets(rp-18f254-s,0.25mm,merck,germany)。[0171]紫外光灯(uvlamp):uvpuvgl-25，波长为254nm及365nm。[0172]采用溶剂(solvent)及其来源说明：正己烷(n-hexane)、乙酸乙酯(ethylacetate)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)(采购至默克台湾)、氯仿-d1(deuterationdegree99.5％)、甲醇-d4(deuterationdegree99.5％)、重水deuteriumoxide(deuterationdegree》99.8％)、dimethylsulfoxide-d6(deuterationdegree》99.9％)(默克台湾)。[0173]6-2.测试流程[0174]首先，例1所制得的青饮茶发酵物10公升(l)经由乙酸乙酯与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得乙酸乙酯层萃取液与第一水层萃取液。再将第一水层萃取液经由正丁醇与水等比例液相分配的方式进行分离，分别取得正丁醇层萃取液与第二水层萃取液。基此，低极性物质会在乙酸乙酯层萃取液，高极性物质在正丁醇层萃取液，水溶性物质就留在第二水层萃取液。[0175]接着，将乙酸乙酯层萃取液经减压浓缩干燥可得乙酸乙酯层萃取物(eaf)13.7克。将正丁醇层萃取液经减压浓缩干燥可得正丁醇层萃取物(buf)28.9克。第二水层萃取液经减压浓缩干燥可得水层萃取物(wf)79.1克。[0176]据此可计算得知以青饮茶发酵物10公升(l)可分离萃取得到共121.7克的粉末状萃取物，其中乙酸乙酯层萃取物(eaf)占11.3％、正丁醇层萃取物(buf)23.7％以及第二水层萃取物(wf)65.0％。[0177]接下来依据生物活性导引分离方法(bioassayguidedfractionation)，以水、50％甲醇水溶液及甲醇为冲提液对正丁醇层萃取物层进行大孔树脂管柱层析(diaionhp-20columnchromatography)得到buf1分离部、buf2分离部及buf3分离部。[0178]buf1分离部续以以rp-mplc管柱层析分离，冲提液由水至甲醇依序冲提，之后以薄层色层分析法分析，合并相似的冲提部，共得到3个次分离部，其为buf1-1次分离部、buf1-2次分离部及buf1-3次分离部)。[0179]其中，buf1-2次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝2/98)，得到生物活性物质tci-cjt-10，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为奎尼酸(quinicacid)。于此，tci-cjt-10的氢-核磁共振光谱如图5所示。[0180]其中，buf1-3次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/9)，得到生物活性物质tci-cjt-01，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为可可碱(theobromine)。于此，tci-cjt-01的氢-核磁共振光谱如图6所示。[0181]buf2分离部续以以rp-mplc管柱层析分离，冲提液由水至甲醇依序冲提，之后以薄层色层分析法分析，合并相似的冲提部，共得到7个次分离部，其为buf2-1次分离部、buf2-2次分离部、buf2-3次分离部、buf2-4次分离部、buf2-5次分离部、buf2-6次分离部及buf2-7次分离部)。[0182]其中，buf2-1次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/19)，得到生物活性物质tci-cjt-04，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为没食子酸(gallicacid)。于此，tci-cjt-04的氢-核磁共振光谱如图7所示。[0183]其中，buf2-2次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/9)，得到生物活性物质tci-cjt-16，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为环-(脯胺酸-白胺酸)(cyclo-(proline-leucine))。于此，tci-cjt-16的氢-核磁共振光谱如图8所示。[0184]其中，buf2-3次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/4)，得到生物活性物质tci-cjt-06及生物活性物质tci-cjt-07，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-06为儿茶素(catechin)确认生物活性物质tci-cjt-07为表儿茶素(epicatechin)。于此，tci-cjt-06的氢-核磁共振光谱如图9所示。于此，tci-cjt-07的氢-核磁共振光谱如图10所示。[0185]其中，buf2-4次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝3/7)，得到生物活性物质tci-cjt-02及生物活性物质tci-cjt-03，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-02为6,8-二葡萄糖基芹菜素(6,8-diglucosylapiginin)确认生物活性物质tci-cjt-03为3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(3’,5’‑diglucosylphloretin)。于此，tci-cjt-02的氢-核磁共振光谱如图11所示。于此，tci-cjt-03的氢-核磁共振光谱如图12所示。[0186]其中，buf2-5次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝7/13)，得到生物活性物质tci-cjt-14及生物活性物质tci-cjt-15，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-14为橙皮苷(hesperidin)确认生物活性物质tci-cjt-15为柚皮苷(naringin)。于此，tci-cjt-14的氢-核磁共振光谱如图13所示。于此，tci-cjt-15的氢-核磁共振光谱如图14所示。[0187]其中，buf2-6次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝2/3)，得到生物活性物质tci-cjt-05，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为牡荆素(vitexin)。于此，tci-cjt-05的氢-核磁共振光谱如图15所示。[0188]其中，buf2-7次分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝1/1)，得到生物活性物质tci-cjt-12及生物活性物质tci-cjt-13，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-12为橙皮素(hesperetin)确认生物活性物质tci-cjt-13为柚皮素(naringenin)。于此，tci-cjt-12的氢-核磁共振光谱如图16所示。于此，tci-cjt-13的氢-核磁共振光谱如图17所示。[0189]依据生物活性导引分离方法(bioassayguidedfractionation)，以甲醇为冲提液对乙酸乙酯层萃取物层进行葡聚糖凝胶管柱层析(sephadexlh-20columnchromatography)而后续利用薄层色层分析，合并相似结果的冲提物，得到eaf1分离部、eaf2分离部、eaf3分离部、eaf4分离部及eaf5分离部。[0190]其中，eaf2分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝7/3)，得到生物活性物质tci-cjt-11，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认其为柠檬苦酸(limonin)。于此，tci-cjt-11的氢-核磁共振光谱如图18所示。[0191]其中，eaf3分离部经rp-hplc纯化(体积比甲醇/水＝8/2)，得到生物活性物质tci-cjt-08及生物活性物质tci-cjt-09，经氢-核磁共振光谱(1h-nmr)与电喷洒离子化质谱(esims)分析其化学结构后，确认生物活性物质tci-cjt-08为川陈皮素(nobiletin)确认生物活性物质tci-cjt-09为橘红素(tangeretin)。于此，tci-cjt-08的氢-核磁共振光谱如图19所示。于此，tci-cjt-09的氢-核磁共振光谱如图20所示。[0192]6-3.结果分析[0193]由上述可知，青饮茶发酵物包含有可可碱(tci-cjt-01)、6,8-二葡萄糖基芹菜素(tci-cjt-02)、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素(tci-cjt-03)、没食子酸(tci-cjt-04)、牡荆素(tci-cjt-05)、儿茶素(tci-cjt-06)、表儿茶素(tci-cjt-07)、川陈皮素(tci-cjt-08)、橘红素(tci-cjt-09)、奎尼酸(tci-cjt-10)、柠檬苦素(tci-cjt-11)、橙皮素(tci-cjt-12)、柚皮素(tci-cjt-13)、橙皮苷(tci-cjt-14)、柚皮苷(tci-cjt-15)及环-(脯胺酸-白胺酸)(tci-cjt-16)等化合物。[0194]例7：青饮茶发酵物及其生物活性物质的指纹图谱hplc分析[0195]于此，利用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)来对例1所制得的青饮茶发酵物及其所含的生物活性物质进行定量与定性的分析。[0196]本次试验中所使用的溶剂为甲醇与水，并在甲醇与水各自添加0.1％甲酸，设定流速为1ml/min，设定冲提条件为0分钟时甲醇：水为2：98，10分钟时甲醇：水为2：98，40分钟时甲醇：水为70：30，50分钟时甲醇：水为100：0，60分钟时甲醇：水为100：0。[0197]首先，图21为对例1所制得的青饮茶发酵物的hplc图谱。其中，在时间为10分附近解析出tci-cjt-04生物活性物质的波峰，在时间为22分附近解析出tci-cjt-01生物活性物质的波峰，在时间为27分附近解析出咖啡因c(caffeine)的波峰，在时间为33分附近解析出tci-cjt-03生物活性物质的波峰，在时间为35分附近解析出tci-cjt-05生物活性物质的波峰，在时间为38分附近解析出tci-cjt-11生物活性物质的波峰。[0198]换言之，青饮茶发酵物中没食子酸、可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、牡荆素及柠檬苦素的含量较多。其中，又以3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量最多。意即没食子酸、可可碱、3’,5’‑二葡萄糖基根皮素、牡荆素及柠檬苦素为青饮茶发酵物中有效生物活性物质的主要成分。其中，青饮茶发酵物中的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素经定量为130.6ppm。[0199]图22为对例1所制得的水浸提液的hplc图谱。其中，在时间为27分附近解析出咖啡因c(caffeine)的波峰，在时间为33分附近解析出tci-cjt-03生物活性物质的波峰。[0200]并且将图21及图22进行对比可知，很多地方的波峰变得更为明显。意即经过发酵程序的青饮茶发酵物其中有效生物活性物质的含量提升许多。同时也可以观察到青饮茶发酵物的咖啡因含量反而降低。[0201]例8：tci-cjt-01、tci-cjt-03、tci-cjt-04、tci-cjt-05及tci-cjt-11的glut4基因调控测试[0202]本次测试以rna萃取套组、反转录酶、kapafastqpcr试剂组配合定量pcr仪，测定人类肝癌细胞株受经青饮茶发酵物处理后，细胞中血糖调控相关基因的变化。[0203]8-1.实验材料及设备[0204]实验细胞：人类肝癌细胞株(后续简称hepg2细胞，采用购自atcc，产品编号hb-8065tm的细胞株)。[0205]测试样品：将例6得到的生物活性物质tci-cjt-01、生物活性物质tci-cjt-03、生物活性物质tci-cjt-04、生物活性物质tci-cjt-05及生物活性物质tci-cjt-11作为实验组的测试样品。[0206]培养基：添加有10％胎牛血清(gibco，美国，产品编号：10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(antibiotic-antimycotic)(gibco公司，产品编号：15240-062)的杜氏改良eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)(gibco公司，产品编号：11965-092)。[0207]rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)。[0208]反转录酶iiireversetranscriptase)(购自invitrogen公司，美国，编号18080-051)。[0209]测量标的基因引子，其中包含glut-4基因。[0210]kapafastqpcr试剂组(购自sigma公司，美国，编号38220000000)。[0211]abisteponeplustm实时pcr系统(abisteponeplustmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国))。[0212]8-2.测试流程[0213]首先进行细胞的初培育，在六孔板中各孔分别接种1x105的hepg2细胞及2毫升的培养基，并在37℃下培养24小时后，再进行后续步骤。[0214]接下来，更新培养基后将hepg2细胞分为六组。其中，一组的不再添加测试样品(即空白组)，另五组的培养基内为分别添加例6得到的生物活性物质tci-cjt-01、生物活性物质tci-cjt-03、生物活性物质tci-cjt-04、生物活性物质tci-cjt-05及生物活性物质tci-cjt-011作为实验组的测试样品(即tci-cjt-01实验组、tci-cjt-03实验组、tci-cjt-04实验组、tci-cjt-05实验组)。于此，各实验组及控制组所添加的测试样品浓度为100μm。[0215]于24小时培养后，各组以细胞裂解液(600μl)分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。接着，以rna萃取试剂套组分别萃取三组细胞溶液内的rna。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的rna作为模板，透过反转录酶将萃取出的rna反转录为相应之cdna。再藉由abisteponeplustm实时pcr系统、qpcr试剂组及上表二的引子(seqidno:1及seqidno:2)对各组的cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)以观察各组的hepg2细胞内的glut4基因表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-δct方法进行基因定量。于此，藉由cdna进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量glut4基因的mrna表现量，进而推断glut4基因编码的蛋白质的表现量。[0216]8-3.结果分析[0217]请参阅图23，将空白组glut4基因表现量视为100％时，tci-cjt-01实验组相对于空白组的glut4基因表现量为114.3％，tci-cjt-03实验组相对于空白组的glut4基因表现量为195.6％tci-cjt-04实验组相对于空白组的glut4基因表现量为119.8％tci-cjt-05实验组相对于空白组的glut4基因表现量为136％tci-cjt-011实验组相对于空白组的glut4基因表现量为118.8％。[0218]意即，tci-cjt-01实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升14.3％，tci-cjt-03实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升95.6％，tci-cjt-04实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升19.8％，tci-cjt-05实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升36％，tci-cjt-11实验组的glut4基因的表现量相较于空白组提升18.8％。[0219]其中，当人类肝癌细胞株以100μm浓度的3’,5’‑二葡萄糖基根皮素处理后，其对于glut4基因的表现量的提升更有大幅度的促进。[0220]图23中显示的相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用excel软件之stdev公式计算标准差，并在excel软件中以单尾学生t检验(studentt-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。[0221]综上所述，根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备稳定血糖的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4基因的表现量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备提升glut4蛋白的含量的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物可以用来制备减少细胞内脂肪堆积的组合物。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升3’,5’‑二葡萄糖基根皮素含量。根据任一实施例的青饮茶发酵物相对于普洱茶与金桔的水浸提液可以提升总皂苷含量。[0222]虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。[0223]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12
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